DAFTAR LAMPIRAN
II. TINJAUAN PUSTAKA
5 dan 11. Vektor pCAMBIA130.1 dipotong dengan enzim EcoRI
and NcoI untuk menghasilkan gen GUSPlus tanpa promoter, 6-10 pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong dengan EcoRI and NcoI, M1. Marka DNA λHindIII, M2.
100bp DNA ladder.
PCR
DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. (2000). Sepasang primer, forward 5'-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3' dan
reverse 5'-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ digunakan untuk
mengam-plifikasi daerah penyandi gen hpt. Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl sampel DNA, 6,25 µM masing-masing primer, dan 6,5 µl KAPA Taq ReadyMix
a
PCR Kit (KAPA Biosystems) dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektrophoresis mengunakan 0.8% gel agarosa.
Analisis Southern Blot
DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik positif PCR
hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. (1994). Sampel DNA dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Sambrook et al. 1989). Sebagai pelacak gen hpt digunakan fragmen DNA hasil PCR (492 bp) yang diperbanyak menggunakan primer spesifik untuk gen hpt. Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection
system dari GE Healthcare (Amersham Bioscience) mengikuti petunjuk produsen.
Induksi Kekeringan
Induksi kekeringan diberikan pada fase vegetatif dan generatif tanaman T0 positif PCR hpt dengan 2 pendekatan. Pendekatan pertama, induksi kekeringan dilakukan dengan cepat yaitu dengan mengering anginkan sampel di atas kertas seperti yang dilakukan Gao et al. (2011) selama 1 jam. Tanaman yang tidak dikeringkan digunakan sebagai kontrol. Kedua, kekeringan dilakukan secara lambat dimana tanaman ditanam pada pipa paralon (PVC) mengikuti metode yang dijelaskan oleh Yue et al. (2006). Tanaman ditanam masing-masing satu tanaman per paralon. Tanaman disiram setiap hari. Pada saat perlakuan kekeringan air pada pipa dibuang melalui lubang yang ada di bagian bawah pipa, dan tidak disiram selama percobaan kekeringan dilakukan hingga 50% dari tanaman menunjukkan gejala daun menggulung. Sampel (daun, akar, batang, bunga) diambil sebelum perlakuan (hari ke 0), kemudian pada hari ke 2, 4, 6, 7 hari setelah pengeringan, dan 1 hari setelah disiram kembali. Tanaman yang tidak ditransformasi dan yang ditransformasi dengan pCAMBIA1305.1 digunakan
48
sebagai pembanding. Kadar air relatif daun di ukur pada awal dan akhir percobaan kekeringan mengikuti persamaan berikut: Kadar air relatif (%) = [(berat segar – berat kering)/(berat turgid-berat kering)] x 100
Uji Aktivitas GUS Tanaman T0
Analisis histokimia GUS dilakukan untuk mempelajari pola ekspresi gen
GUSPlus pada tanaman padi yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Organ
tanaman (daun, batang, akar, bunga) direndam dalam larutan Gluc (2 mM X-Gluc, 1 mM potassium ferrisianida, 1 mM potassium ferrosianida, 100 µg/ml chloramphenicol, 10 mM Na
Transgenik
2EDTA.2H2O, 0,1% triton-X, 20% metanol dan 50mM dapar sodium fosfat pH 7) disimpan pada suhu 37oC selama 36 jam pada kondisi gelap. Selanjutnya organ tanaman dicuci dengan tiga seri larutan etanol (50,70, dan 95% v/v) hingga pigmen klorofil hilang. Jaringan kemudian diamati di bawah mikroskop.
Pembuatan Preparat Jaringan
Jaringan yang telah diwarnai secara histokimia disayat secara melintang dan membujur menggunakan mikrotom beku (freeze mikrotom) tipe Yamato RV 240 dengan tebal 15 mikron. Hasil sayatan disusun pada suatu gelas objek dan ditetesi dengan gliserin sebelum ditutup dengan gelas penutup. Sampel diamati menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i.
Hasil
Identifikasi, Karakterisasi dan Isolasi Promoter OsHox6
Kandidat promoter OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen
OsHox6 (no. aksesi AF145730) dengan klon BAC APOO5681 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Motif atau cis-acting elemen yang terdapat pada daerah 5’ dari gen terinduksi kekeringan OsHox6 diprediksi dengan bantuan
PLACE (Plant cis-acting regulatory DNA elements) (http://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/signalscan.html). Berdasarkan keberadaan cis-regulatory element dan untuk kemudahan isolasi (PCR) dan konfirmasi (sekuensing) selanjutnya dipilih 1 kb daerah upstream dari kodon ATG gen OsHox6 untuk analisis fungsi. Daerah
promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb ini diprediksi mengandung 8 kandidat
cis-regulatory element terkait respon kekeringan, yaitu motif yang mirip dengan
MYB1 dan MYC dari Arabidopsis thaliana, ABRE like/ERD1, ERD1, dan LTRE (Gambar 9; Tabel 10). Selain itu elemen lain (ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2) yang terkait dengan respon terhadap ABA juga ditemukan. Berdasarkan data ini maka promoter OsHox6 diduga responsive terhadap kekeringan dan ABA. Namun, berdasarkan hasil analisis prediksi ini promoter OsHox6 tidak memiliki TATA box yang umum dijumpai pada promoter sel eukaryot. Selanjutnya promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi Ciherang menggunakan sepasang primer yang spesifik. Urutan DNA kandidat promoter hasil isolasi dari daun padi kultivar Ciherang menunjukkan kemiripan yang sangat tinggi (identity 100%) dengan sekuen DNA acuan (BAC clone APOO5681) dari Nipponbare (Gambar 10).
Kloning, Konstruksi Plasmid dan Transformasi Tanaman Padi
Kandidat promoter OsHox6 (1 kb) yang diisolasi dari padi cv Ciherang difusikan dengan gen GUSPlus plasmid pCAMBIA 1305.1 yang telah dihilangkan promoter CaMV35S-nya (Gambar 8). Vektor pCAMBIA1305.1
OsHox6P::GUSPlus ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi Nipponbare
dan Ciherang dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens EHA105. Vektor pCAMBIA yang membawa gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter CaMV35S digunakan sebagai positif kontrol, sedangkan tanaman yang tidak ditransformasi digunakan sebagai negatif kontrol. Tiga (3) tanaman Ciherang dan tiga puluh dua (32) tanaman Nipponbare kandidat transgenik berhasil diperoleh.
Tanaman transgenik di PCR dan Southern untuk konfirmasi keberadaan transgen menggunakan pelacak gen hpt. Hasil PCR menunjukkan, secara berturut-turut, 30 dan 1 tanaman Nipponbare dan Ciherang, positif PCR hpt (Gambar 11). Sebanyak 12 tanaman Nipponbare positif PCR hpt di Southern menggunakan pelacak hpt. Enam tanaman Nipponbare hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6, mengandung satu salinan gen hpt (data tidak ditampilkan), meyakinkan bahwa gen telah terintegrasi ke dalam genom tanaman. Tanaman yang mengandung satu salinan gen GUSPlus ini
50
kemudian digunakan untuk analisis selanjutnya untuk mempelajari pola ekspresi gen GusPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6.
Gambar 9 Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter OsHox6. Informasi lebih lanjut dari masing-masing cis-acting elemen
dirangkum pada Tabel 10.
Tabel 10 Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA pada 1 kb
daerah promoter OsHox6. Nama cis-elemen Sekuen cis-elemen Jumlah cis-elemen
Posisi Keterangan Pustaka
ABRE like/ERD1
ACGTG 1 -348 etiolation-induced
expression of erd1 (early responsive to dehydration) Simpson et al. 2003 AtACGT/ ERD1 ACGT 3 -349, 361 -568 etiolation-induced expression of erd1 (early responsive to dehydration)
Simpson et al. 2003
HvCBF RYCGAC 1 -384 dehydration-responsive
element (DRE) binding proteins (DREBs)
Xue 2002
LTRE CCGAC 1 -572 Cold, drought, ABA
responsive element
Baker et al. 1994
AtMYB1 WAACCA 1 -583 ABA, dehydration
responsive
Abe et al. 2003 AtMYC/
ERD1
CATGTG 1 -978 Water stress Tran et al.
2004 CGCG BOX VCGCGB 19 -248 -795 dst
Ca++/Calmodulin binding Yang & Poovaiah 2002 ABRE related sequence MACGYG B 2 -630 -795
Ca++ responsive Kaplan et al. 2006 SORLIP1 GCCAC 8 -127 -643 dst Phytochrome A-induced motifs Jiao et al. 2005 SORLIP2 GGGCC 2 -177 -839 Phytochrome A-induced motifs Hudson & Quail 2003
TATA Box TATAA 0 Grace et al.
2004
R adalah nukleotida A atau G, Y nukleotida C atau T, dan W nucleotida A atau T, V nukleotida A, C, atau G, B nukleotida C, G, atau T, dan M nukleotida A atau C.
Gambar 10 Hasil pensejajaran sekuen kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi
dari padi Ciherang dengan sekuen acuan (BAC APOO5681) dari Nipponbare.
OsHox6P NB:OsHox6P CH identity= 100%
106 AAACACATCCCCTAGCTAGTAGCTGCTGGTAAACTACCGTCCTGAGCAACAGAGAAGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 1 AAACACATCCCCTAGCTAGTAGCTGCTGGTAAACTACCGTCCTGAGCAACAGAGAAGCAA 166 AGCAATGAGTTGACGCGACCGAATCCGCGACGCCGCCCTCGCACCGCAAGGGCCACGCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 61 AGCAATGAGTTGACGCGACCGAATCCGCGACGCCGCCCTCGCACCGCAAGGGCCACGCCA 226 ATTTGGTGCTCGATCGATCGGAACGCGCGCGGCGCTCCACGGCCATGTCCCACCGCACGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 121 ATTTGGTGCTCGATCGATCGGAACGCGCGCGGCGCTCCACGGCCATGTCCCACCGCACGA 286 ACCGCGCGGCCGCCCGCCAACCGAGCTAGCGCGCGGCCCCGGCCGCCGCCATGCTAACAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 181 ACCGCGCGGCCGCCCGCCAACCGAGCTAGCGCGCGGCCCCGGCCGCCGCCATGCTAACAC 346 ACACCCGATGCGTTGCATTGCATGGCCGCTCCACGACGCCTCCCGCCCGCCTCGCGCCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 241 ACACCCGATGCGTTGCATTGCATGGCCGCTCCACGACGCCTCCCGCCCGCCTCGCGCCAC 406 CACGGCCACGCGGTGCACCAGCTATAGCTAGCTAGCTAGGCGCATGGGGAGACGCTCCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 301 CACGGCCACGCGGTGCACCAGCTATAGCTAGCTAGCTAGGCGCATGGGGAGACGCTCCAC 466 GACGCCCACTGCACTCCCGACACGTTTCCCCCAACCAACCACCACGCACCAACCCAAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 361 GACGCCCACTGCACTCCCGACACGTTTCCCCCAACCAACCACCACGCACCAACCCAAAAC 526 CATCCATCCATCCAGCCAGCCAAGCCAATCTCCCGGCTCCCTCCGCTACGCGCCCCACGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 421 CATCCATCCATCCAGCCAGCCAAGCCAATCTCCCGGCTCCCTCCGCTACGCGCCCCACGA 586 CCTTTTTCCCATCACCCGCCCGCGCGCGCGGTCGAGCGCAACGCAACGCAACTCCACCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 481 CCTTTTTCCCATCACCCGCCCGCGCGCGCGGTCGAGCGCAACGCAACGCAACTCCACCGT 646 ACCAACCGCGGCGCGGCCGATCGATCGACGCGAATCCCGCATGCGTATACGTACTATTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 541 ACCAACCGCGGCGCGGCCGATCGATCGACGCGAATCCCGCATGCGTATACGTACTATTCT 706 ACGTGAAGTATATGTGTAGCCGATCGAGCCGTCTCCCACCGCGCGCTCCCTCCCTGCCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 601 ACGTGAAGTATATGTGTAGCCGATCGAGCCGTCTCCCACCGCGCGCTCCCTCCCTGCCCC 766 CGCGACAGCGACGCCGAGCGAGCGAGAGCGCGCAGCTAGCCACAGCCTCCAGAGCTATAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 661 CGCGACAGCGACGCCGAGCGAGCGAGAGCGCGCAGCTAGCCACAGCCTCCAGAGCTATAG 826 CTACAGCGCGATCGAGAGAGAAGGGGGGAGACAGTGAGGCCGAGAGCGAGAGGGCCAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 721 CTACAGCGCGATCGAGAGAGAAGGGGGGAGACAGTGAGGCCGAGAGCGAGAGGGCCAGCC 886 ACGCACGCACGCACGCCACCGCGCTCCATTGGCCACCCCCTCGCCATCGCCACGATTAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 781 ACGCACGCACGCACGCCACCGCGCTCCATTGGCCACCCCCTCGCCATCGCCACGATTAAA 946 CTACTCTCTTGCTACTCCCCCTCCATCCATCCACACACTCCACCATTTCCTCTTCTTCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 841 CTACTCTCTTGCTACTCCCCCTCCATCCATCCACACACTCCACCATTTCCTCTTCTTCTT 1006 CCTCCATATCACACGGTTTTCGTCCATCGATCATCAGAGCTCGATCGGGCGCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 901 CCTCCATATCACACGGTTTTCGTCCATCGATCATCAGAGCTCGATCGGGCGCCATG OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH OsHox6P NB OsHox6P CH
52
Gambar 11 Contoh hasil PCR menggunakan primer spesifik untuk gen hpt.
DNA genomik tanaman diisolasi dari daun tanaman hasil transformasi dengan vektor mengandung gen pelapor GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6. M. DNA λ yang dipotong dengan enzim HindIII, P. DNA plasmid pCAMBIA1305.1
OsHox6P::GUSPlus, Pt. Kontrol tanaman positif hpt, Nt. Kontrol
tanaman tidak ditransformasi, R. Kontrol reaksi. 1-32. Sampel DNA tanaman hasil transformasi dengan vektor mengandung gen pelapor GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6.
Aktifitas GUSPLUS Pada Tanaman T0
Aktifitas GUSPlus pada tanaman transgenik Nipponbare dan Ciherang hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh 1 kb promoter OsHox6 diamati dengan uji histokimia pada saat ada atau tidak ada induksi kekeringan. Warna biru pada sel atau jaringan mengindikasikan adanya ekspresi GUSPlus. Pada kondisi normal ekspressi GUSPlus pada berbagai organ vegetatif (seperti akar, batang, dan daun) dan generatif (bunga) tidak ada atau sangat rendah. Ekspresi gen GUSPlus meningkat ketika tanaman diinduksi kekeringan, baik dengan menggunakan metode dehidrasi secara cepat di Lab maupun dengan induksi kekeringan secara lambat di rumah kaca. Ekspresi GUSPlus meningkat secara nyata ditandai dengan munculnya warna biru pada jaringan setelah dikering anginkan selama 1 jam di atas meja di Laboratorium (Gambar 12). Dari hasil pengamatan ekspresi GUSPlus pada berbagai organ (akar, batang, daun dan bunga), sebanyak 92% (dari total 12 tanaman yang diuji) ekspresi GUSPlus di jumpai pada batang terutama pada daerah buku batang, sedangkan pada organ lain (akar, daun, dan bunga) kejadiannya hanya 8,3%. Tidak ada ekspresi GUSPlus
Transgenik Pada Saat Ada Induksi Kekeringan
pada tanaman yang tidak ditransformasi, dan seperti yang diharapkan, ekspresi GUSPlus pada tanaman hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikendalikan promoter konstitutif CaMV 35S terjadi pada berbagai jaringan baik sebelum dan setelah dikeringkan.
Hasil uji histokimia pada tanaman Nipponbare positif PCR hpt, hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikendalikan promoter OsHox6, yang diinduksi kekeringan dengan cara kedua (lambat) menunjukkan kecenderungan yang sama. Ekspresi GUSPlus sesaat sebelum dikeringkan (hari ke-0) menunjukkan ekspresi yang rendah atau tidak ada ekspresi (RWC daun berkisar antara 91 - 95%). Ekspresi GUSPlus yang tinggi ditandai dengan peningkatan intensitas warna biru yang kuat dijumpai pada batang, akar, dan bunga pada hari ke 6 dan ke 7 setelah dikeringkan (RWC daun berkisar antara 79 hingga 80%, menunjukkan tingkat stres moderat menurut Agalou et al. (2008) dan 50% tanaman yang diuji sudah mulai menunjukkan gejala daun menggulung.
Ekspresi GUSPlus kembali rendah atau tidak ada 1 hari setelah tanaman di siram kembali (Gambar 13) membuktikan bahwa gen OsHox6 terinduksi kekeringan. Pada batang, ekspresi GUSPlus terutama ditemukan pada bagian buku batang dan sudah mulai terlihat pada awal percobaan kekeringan, kemudian meningkat hingga akhir pengamatan (hari ke -7). Pada daun peningkatan intensitas warna biru tidak meningkat secara nyata dan baru terlihat pada hari ke-6 atau ke-7. Hal yang sama juga ditemukan pada akar dan bunga. Pada bunga warna biru dengan intensitas yang kuat ditemukan pada dasar bunga (Gambar 13C). Sedangkan pada akar intensitas yang kuat ditemukan pada daerah pertemuan akar primer dan lateral.
Untuk mengetahui lebih lanjut bagian sel, jaringan, atau yang mengekspresikan GUSPlus, dilakukan irisan terhadap sampel yang sudah diuji GUS. Irisan dilakukan baik secara melintang maupun membujur. Hasil irisan menunjukkan GUSPlus diakumulasikan terutama pada jaringan meristem yang aktif membelah. Pada kondisi yang melimpah GUSPlus ditemukan menyebar pada berbagai jaringan (Gambar 14). Dengan melihat hasil irisan secara melintang dapat terlihat jelas bahwa warna biru ditemukan lebih pekat pada lingkaran luar yang mengelilingi batang (lingkaran paling dalam). Daerah
54
lingkaran luar tersebut merupakan bagian dari pangkal pelepah daun. Sehingga hasil ini memperjelas bahwa GUSPlus diekspresikan lebih kuat pada daerah pangkal pelepah daun dibandingkan dengan helaian daun yang dijelaskan sebelumnya (Gambar 13B). Selanjutnya lingkaran daun yang paling dalam menunjukkan intensitas warna yang lebih kuat dibandingkan dengan lingkaran terluar, hal ini mengindikasikan bahwa ekspresi GUSPlus lebih kuat pada bagian yang lebih muda.
N32 N37 CH1 O sH ox 6 Ca M V 3 5S Pr om ote r Ko nt ro l Tidak didehidrasi
Akar Batang Daun Bunga Akar BatangDidehidrasiDaun Bunga
Gambar 12 Ekspresi β-glucuronidase (warna biru) pada berbagai organ (akar, batang, daun, dan bunga) tanaman padi cv Ciherang (CH) dan Nipponbare (N) hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter terinduksi kekeringan OsHOx6 dan promoter konstitutif CaMV 35S pada saat ada atau tidak ada induksi kekeringan. Garis merepresentasikan 1 mm.
C aM V 35S 0 2 4 6 7 S* N18 N47 O sH o x6 P
Pengamatan hari
ke-P
rom
ot
er
0 2 4 6 7 S* Pengamatan hari
ke-N18 N47 O sH o x6 P C aM V 35S P rom ot er 0 2 4 6 7 S* N18 N47 O sH ox6 P C aM V 35S P rom ot er
Pengamatan hari
ke-N 18
N47
0 6 7
Pengamatan hari
ke-O sH ox6 C aM V 35S P rom ot er
Gambar 13 Pola ekspresi
GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6 pada berbagai organ tanaman padi. A. batang, B. Daun, C. Bunga , dan D. Akar. Warna biru menunjukkan ekspressi gen GUSPlus. Garis putus-putus menunjukkan saat tanaman disiram kembali. S* sampel diambil 1 hari setelah tanaman disiram kembali. Garis merepresentasikan 1 mm.
A.
B.
C.
56 P r omote r Irisan Membujur Irisan Melintang K on tr ol O sHo x6P :: GU S P lus 35S C aM V Ph Xy VB VB
Gambar 14 Penampang melintang dan membujur bagian buku batang padi yang
telah di uji GUS. Jaringan tanaman yang tidak ditransformasi digunakan sebagai kontrol pembanding. VB. Vessel bundle (jaringan pembuluh), Xy. Xylem, Ph. Phloem. Garis menunjukkan 100 µm.
Pembahasan
Analisis promoter sangat penting dilakukan untuk mempelajari fungsi dan mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler. Pengaturan ekspresi gen reponsif terhadap cekaman (kekeringan) terjadi dengan adanya interaksi antara faktor transkripsi dan elemen cis-acting yang ada di daerah promoter gen target. Gen HD-Zip pada tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini (Agalou et al. 2008), sehingga informasi tentang pola ekspresi gen
dan elemen penting yang mengendalikan regulasi transkripsi gen HD-Zip ini masih sangat terbatas.
Di dalam penelitian ini, promoter gen OsHox6 yang merupakan anggota dari HD-Zip sub-famili I dan dilaporkan responsif kekeringan (Agalou et al. 2008) dipelajari fungsinya dengan melihat keberadaan elemen cis-acting yang ada di daerah promoter tersebut dan dengan melakukan analisis fungsional promoter yang difusikan dengan gen pelapor GUSPlus. Keberadaan elemen cis-acting terkait cekaman tertentu merupakan salah satu petunjuk awal bahwa promoter dapat mengatur proses transkripsi pada saat ada cekaman tertentu, meskipun tidak ada jaminan efektifitas ekspresi gen. Oleh karena itu analisis fungsi dari kandidat promoter perlu dilakukan dengan menggabungkan kandidat promoter dengan suatu gen pelapor dan mengujinya pada kondisi cekaman tertentu.
Hasil analisis sekuen 1 Kb kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi dari Ciherang menunjukkan kemiripan yang sangat tinggi (identity 100%) dengan sekuen DNA acuan (Nipponbare). Hal ini mengindikasikan adanya konservasi pengaturan ekspresi gen OsHox6 yang tinggi pada Nipponbare dan Ciherang. Hasil analisis PLACE menunjukkan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen cis-acting yang penting untuk respon kekeringan (yaitu MYB1 dan MYC, ABRE like/ERD1, ERD1, dan LTRE) dan respon ABA (seperti ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2). Sehingga ekspresi gen
OsHox6 kemungkinan diregulasi oleh kekeringan dan ABA. Untuk membuktikan
dugaan ini maka dapat dilakukan dengan melakukan analisis ekspresi pada tanaman transgenik mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan suatu gen pelapor. Ekspresi gen pelapor diamati ketika tanaman transgenik di tumbuhkan pada kondisi kekurangan air atau pada media mengandung ABA.
Salah satu hal menarik dari promoter OsHox6 adalah tidak adanya TATA box yang merupakan elemen penting untuk inisiasi proses transkripsi. Hal yang sama juga dilaporkan sebelumnya oleh Chen et al. (2005) dan Rai et al. (2009), masing-masing pada promoter MYB dan HP1. Meskipun demikian, analisis fungsi promoter berdasarkan uji GUS pada tanaman transgenik positif PCR hpt menunjukkan promoter OsHox6 fungsional pada padi Nipponbare dan Ciherang.
58
Diduga ada motif lain yang belum diketahui yang memiliki fungsi yang mirip dengan TATA box.
Aktivitas promoter OsHOx6 meningkat pada saat ada cekaman kekeringan ditandai dengan peningkatan intensitas warna biru pada jaringan. Namun berdasarkan uji GUS diamati bahwa pola ekspresi GUSPlus cenderung diekspresikan lebih tinggi pada daerah dimana terdapat jaringan meristem, seperti daerah intercalary meristem pada batang dan daun, daerah meristematis pada bunga dan daerah lateral meristem pada batang.
Hasil pengamatan ekspresi GUSPlus pada berbagai organ tanaman padi menunjukkan ada perbedaan pola ekspresi pada batang dan organ selain batang. Pada batang ekspresi GUSPlus dapat diamati pada tahap awal dehidrasi, sedangkan pada akar, daun, dan bunga ekspresi GUSPlus baru dapat diamati setelah kekeringan berlangsung 6-7 hari. Hal ini mengindikasikan adanya kemungkinan mekanisme regulasi gen Oshox6 yang berbeda pada batang dan organ lainnya. Pengamatan lebih lanjut pada setiap tahap perkembangan juga perlu dilakukan untuk melihat apakah promoter OsHox6 diregulasi oleh tahap perkembangan tanaman.
Ekspresi gen OsHox6 seperti yang disimpulkan dari pola aktivitas promoter
OsHox6, mirip dengan promoter AtHB7 Arabidopsis. Keduanya berhubungan
erat dengan sel-sel yang mengalami fase differensiasi (Hjellstrom et al. 2003). Seperti AtHB7, aktivitas GUS paling kuat pada jaringan muda daerah batang yang aktif memanjang atau membelah.
Simpulan
Promoter OsHox6 berdasarkan hasil analisis bioinformatik mengandung elemen cis-acting responsif kekeringan dan ABA. Promoter OsHox6 teraktivasi oleh proses kekeringan berdasarkan hasil analisis histokimia GUS pada tanaman transgenik hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Aktivitas promoter OsHox6 lebih tinggi pada buku batang dan jaringan yang aktif membelah.
Abstrak
Protein homeodomain leucin zipper (HD-Zip) merupakan suatu famili faktor transkripsi yang hanya ditemukan pada tanaman. OsHox6 adalah anggota dari HD-Zip sub-famili I pada tanaman padi. Ekspresi OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Untuk mengetahui fungsi gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi sawah Ciherang dan IR64 transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Empat galur (I.19, I.23, I.33, dan I.40) tanaman padi transgenik IR64 yang mengandung satu salinan transgen berdasarkan Southern blot lebih toleran pada kondisi kekeringan, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya. Konfirmasi ekspresi gen akan dilakukan. Penampilan morfologi tanaman transgenik berdasarkan pengamatan tinggi tanaman tidak berbeda dengan kontrolnya. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui cara kerja OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan.
Kata Kunci: Gen OsHox6, promoter OsLEA3, padi transgenik, tingkat
kelangsungan hidup, toleran kekeringan
Abstract
Homeodomain leucine zipper (HD-Zip) proteins constitute a family of transcription factors unique to plants. OsHox6 is a member of rice HD-Zip sub-family I. It is regulated at the transcriptional level by water availability. In order to establish if this gene plays a functional role in drought responses, transgenic rice plants (Ciherang and IR64) containing OsHox6 gene driven by OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic lines of IR64 (I.19, I.23, I.33, and I.40) containing single copy of transgene were more tolerant to water stress conditions, showed by higher survival rates than wild-type plants. The expression level of
OsHox6 gene in these transgenic plants will be confirmed. The morphological
performance of transgenic plants having an extra copy of transgene were similar to that of wild type plants. Further investigations are required to evaluate the modulation of drought tolerance by OsHox6.
Key words: OsHox6 gene, OsLEA3 promoter, transgenic rice, survival rate, drought tolerance
60
Pendahuluan
Gen homeodomain leucin zipper (HD-Zip) menyandikan protein faktor transkripsi yang unik pada tanaman. Protein ini dikenali dengan adanya homeodomain yang penting untuk pengikatan DNA dan motif leucin zipper yang diperlukan untuk proses dimerisasi. Gen HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah seperti lumut Physcomitrella
patens (Sakakibara et al. 2001), kemudian pakis Ceratopteris richardii (Aso et al. 1999), dan tumbuhan tingkat tinggi seperti Arabidopsis thaliana (Hanson et al.
2002; Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004; Kim et al. 2007), kedelai (Wang et al. 2005), dan tanaman gurun yang sangat toleran kekeringan
Craterostigma plantagienum (Deng et al. 2002). Beberapa protein HD-Zip
khususnya sub-famili I dilaporkan berperan dalam mengatur perkembangan tanaman dalam merespon kondisi lingkungan seperti kekeringan, suhu ekstrem, stres osmotik, dan kondisi pencahayaan (Ariel et al. 2007).
Keterlibatan gen dari famili HD-Zip dalam adaptasi kekeringan pada tanaman telah dilaporkan sebelumnya pada tanaman model toleran kekeringan
Craterostigma plantagineum dan tanaman model Arabidopsis thaliana (Deng et al. 2002, Hjellstrom et al. 2003, Olsson et al. 2004, Dezaar et al. 2005a, Deng et al. 2006). Gen HD-Zip pada tanaman padi baru diteliti beberapa tahun
belakangan ini (Agalou et al. 2008). Sebanyak 8 dari 31 gen HD-Zip sub-famili I, II dan III yang berhasil diungkap pada tanaman padi dilaporkan responsif terhadap kekeringan. Lima (5) gen (OsHox4, 6, 20, 22, dan 24) diantaranya merupakan anggota dari kelompok sub-famili I dan 3 gen (OsHox11, 19, dan 27) merupakan anggota dari sub-famili II. Gen-gen ini berpotensi sebagai kandidat gen yang menentukan sifat toleran kekeringan yang diperlukan dalam upaya perakitan tanaman toleran kekeringan. Dari 8 gen HD-Zip responsif kekeringan tersebut, baru gen OsHox1 dan Oshox4 padi yang telah dipelajari secara mendetil.
OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000).