BAB 3. METODE PENELITIAN
4.4 Daya Degradasi Kitin Pada Tepung Cangkang
Prinsip dari uji daya degradasi tepung cangkang udang menggunakan enzim kitinase adalah menambahkan enzim kitinase ke dalam substrat (tepung cangkang udang) kemudian diukur kadar N-asetilglukosamin pada supernatan hasil degradasi. Hasil pengukuran kadar N-asetilglukosamin (Gambar 4.4) menunjukkan kenaikan kadar N-asetilglukosamin selama perlakuan dan kadar N-asetilglukosamin tertinggi dihasilkan oleh penambahan enzim kitinase sebanyak 5 ml.
Gambar 4.4 Degradasi tepung cangkang udang olehcrudeenzim kitinase
Enzim adalah golongan protein yang berfungsi sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi di dalam sel maupun di luar enzim. Dengan adanya enzim dalam suatu reaksi, energi aktivasi akan diperkecil atau diturunkan, sehingga akan dapat mempermudahkan atau mempercepat terjadinya suatu reaksi (Poedjiadi dan Supriyanti, 2009). Pada Gambar 4.4 dapat dilihat bahwa semakin banyak jumlah enzim yang ditambahkan maka semakin tinggi kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan. Hal ini berkaitan dengan kompleks enzim-substrat, semakin tinggi konsentrasi enzim semakin banyak kompleks enzim-substrat yang terbentuk dan ini berlangsung sampai semua enzim berikatan dengan substrat.
Menurut Poedjiadi dan Supriyanti (2009), hubungan antar substrat dan enzim hanya terjadi pada bagian tertentu yaitu bagian aktif (active site). Semakin banyak substrat yang berikatan dengan sisi aktif enzim maka kompleks enzim-substrat akan semakin meningkat sehingga produk yang dihasilkan juga tinggi. Sisi aktif enzim kitinase akan berikatan dengan kitin yang terkandung dalam tepung cangkang udang membentuk kompleks enzim substrat sehingga terbentuk produk N-asetilglukosamin. Oleh karena itu pada Gambar 4.4, peningkatan kadar N-asetilglukosamin terjadi seiring dengan peningkatan jumlah enzim yang ditambahkan.
Semakin banyak enzim yang digunakan maka kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan juga semakin meningkat. Proses degradasi cangkang udang oleh Roy (2003) menunjukkan bahwa peningkatan unit aktivitas enzim kitinase yang ditambahkan pada cangkang udang menyebabkan kenaikan kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan. Sashiwa (2002) menjelaskan bahwa proses degradasi kitin dengan enzim kitinase diawali dengan pemecahan substrat kitin oleh endokitinase menjadi oligosakarida. Kemudian oligosakarida yang terbentuk dipecah menjadi N-asetilglukosamin oleh eksokitinase. Park (2000) menyatakan bahwa kitin akan dihidrolisis menjadi oligomer dan dihidrolisi lebih lanjut oleh β -N-acetylglucosaminidase dalam bentuk monomer yaitu N-asetilglukosamin.
Kadar N-asetilglukosamin dapat diukur dengan spektrofotometer menggunakan metode Schales. Terjadinya reaksi reduksi pada oksidan anorganik yaitu ferisianida disebabkan oleh gugus aldehid atau hemiasetal dari N-asetilglukosamin. Reaksi reduksi ini dapat diketahui dari perubahan warna pada larutan yang diukur menggunakan spektrofotometer. Reagen Schales berwarna kuning dan reaksi dengan N-asetilglukosamin menghasilkan perubahan warna menjadi lebih memudar dan dapat diukur pada 420 nm (Ferrari, et al., 2014). Semakin tinggi kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan maka semakin memudar larutan yang akan diukur absorbannya. Hal ini disebabkan semakin banyaknya ferisianida yang teroksidasi bersama N-asetilglukosamin.
4.5 Daya Degradasi Kitin pada Tepung Cangkang Udang Menggunakan Bakteri Kitinolitik Isolat A7
Kitin merupakan makromolekul berbentuk padatan amorf atau kristal, berwarna putih dan dapat didegradasi secara hayati terutama oleh bakteri penghasil enzim kitinase. Degradasi cangkang udang dapat dilakukan menggunakan enzim yang ditambahkan langsung maupun enzim hasil metabolik sekunder dari proses kultivasi mikroba (Yang et al., 2000). Penggunaan bakteri secara langsung pada proses degradasi tepung cangkang udang bersifat lebih kompleks. Inokulum bakteri akan mensintesis enzim sebagai respon adaptasi terhadap substrat. N-asetilglukosamin yang terbentuk kemudian digunakan untuk proses pertumbuhannya. Pada penggunaan crudeenzim yang ditambahkan langsung, N-asetilglukosamin yang terbentuk merupakan murni hasil proses degradasi tepung cangkang udang karena tidak ada monomer N-asetilglukosamin yang digunakan pada proses pertumbuhan.
Prinsip dari uji daya degradasi tepung cangkang udang adalah menginokulasikan inokulum bakteri kitinolitik ke dalam substrat (tepung cangkang udang) kemudian diukur kadar N-asetilglukosamin pada supernatan hasil degradasi. Hasil pengukuran kadar N-asetilglukosamin (Gambar 4.3) menunjukkan kenaikan kadar N-asetilglukosamin selama perlakuan dan kadar N-asetilglukosamin tertinggi dihasilkan oleh penambahan inokulum bakteri sebanyak 5 ml dengan kepadatan bakteri sebesar 6,57x107sel/ml.
Pada Gambar 4.3 dapat dilihat bahwa semakin banyak jumlah inokulum yang ditambahkan maka semakin tinggi kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan. Hal ini terjadi karena peningkatan jumlah inokulum disertai dengan peningkatan enzim kitinase yang diproduksi sehingga banyak kitin yang didegradasi membentuk N-asetilglukosamin. Menurut Abun (2006), penggunaan dosis inokulum berpengaruh terhadap enzim yang dihasilkan mikroba tersebut. Dosis inokulum Bacillus licheniformis 5% menghasilkan enzim kitinase yang lebih banyak daripada penggunaan Bacillus licheniformis3 %. Pada penggunaan Bacillus licheniformis3 % terjadi penurunan jumlah enzim karena jumlah mikroba yang kurang optimum menghasilkan enzim kitinase.
N-asetilglukosamin merupakan monomer penyusun kitin dan dapat diperoleh dari proses hidrolisis. Semakin tinggi jumlah inokulum yang digunakan pada degradasi cangkang udang maka semakin tinggi pula cangkang udang yang terdegradasi. Hasil penelitian Hoang (2011) menyebutkan bahwa pada berat kering inokulum sebesar 40 mg, jumlah cangkang udang yang tersisa sebesar 80%, sedangkan pada berat kering inokulum sebesar 50 mg, jumlah cangkang udang yang tersisa sebesar 60%. Semakin menurunnya jumlah cangkang udang yang tersisa membuktikan bahwa terjadi proses degradasi kitin pada cangkang udang menjadi bentuk yang lebih sederhana atau monomer-monomernya. Ilangumaran (2014) menyatakan bahwa pada waktu inkubasi 24 jam, Pseudomonas fluorescens
menghasilkan N-asetilglukosamin sebesar 19 µg/ml, S224 (2 µg/ml), S223 (18 µg/ml), dan S23 (10 µg/ml). Semakin tinggi konsentrasi inokulum mengakibatkan semakin tinggi pula kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan. Pada S223 dan S224 peningkatan kadar N-asetilglukosamin seiring dengan peningkatan konsentrasi inokulum (1%, 5%, dan 10%).
Pada uji degradasi tepung cangkang udang digunakan perlakuan waktu inkubasi, banyak tepung cangkang udang yang digunakan dan banyak inokulum serta
dengan inokulum bakteri kitinolitik isolat A7 menghasilkan kadar N-asetilglukosamin sebesar 121,5 µg/ml, sedangkan kadar N-asetilglukosamin hasil dari proses degradasi oleh crude enzim isolat A7 sebesar 106,75 µg/ml. Enzim yang digunakan dalam proses degradasi merupakan enzim hasil produksi selama 14 jam (waktu produksi optimal), sedangkan inokulum yang digunakan merupakan inokulum dengan umur 7 jam pada media LB (fase eksponensial). Rendahnya kadar N-asetilglukosamin yang dihasilkan dari proses degradasi menggunakan crude enzim diduga karena pengaruh stabilitas enzim yang digunakan. Enzim dalam melakukan aktivitasnya dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dan ini berkaitan dengan stabilitas enzim. Stabilitas enzim adalah kemampuan enzim untuk menjaga struktur dan konformasinya pada kondisi lingkungan tertentu sehingga aktivitasnya tetap tinggi. Pada industri, suatu reaksi enzimatik sering dilakukan pada kondisi pH dan suhu yang cukup ekstrim dalam waktu yang cukup lama. Oleh karena itu, di samping pH dan suhu optimum, faktor penting yang menentukan kualitas enzim industri adalah stabilitas enzim terhadap pH dan suhu (Montenecourt et al., 1985). Perlakuan terhadap penggunaan enzim berkaitan dengan stabilitas sedangkan inokulum berkaitan dengan fase pertumbuhan. Penggunaan crude enzim yang disesuaikan dengan hasil stabilitasnya akan menunjukkan aktivitas yang optimal.
BAB 5. PENUTUP