HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3 Densitas Serabut Kolagen
Pengamatan preparat histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop optis (Olympus 1X71) dengan pembesaran 100x. Masing-masing preparat dilakukan pengambilan gambar sebanyak lima lapang pandang secara acak kemudian diambil nilai rata-rata. Berikut merupakan gambaran histopatologi kulit mencit bagian dorsal dengan pewarnaan Masson’s trichome. Pada pengamatan histopatologi ini diambil 3 mencit dari kelompok normal dan 5 mencit untuk masing-masing kelompok lainnya.
Analisa kolagen secara kuantitatif dilakukan dengan menggunakan piranti lunak Adobe Photoshop CS6. Densitas kolagen dihitung dengan menganalisa intensitas warna biru pada masing-masing gambar dari seluruh kelompok perlakuan dengan menggunakan fungsi histogram pada piranti lunak (Miot HA, 2010). Data yang diperoleh adalah sebagai berikut:
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Gambar 4.2 Grafik Rerata Densitas Kolagen
Keterangan: (Normal) Kelompok normal; (P0) Kelompok yang disinari UV; (P1) Kelompok yang diberikan basis sediaan; (P2) Kelompok yang diberikan sediaan emulgel Gamma
oryzanol 0,1%
Berdasarkan data tersebut kemudian dilakukan analisa statistik dengan menggunakan SPSS 22. Hasil dari uji normalitas Kolmogorov-Smirnov menunjukan data rerata densitas kolagen terdistribusi normal (p≥0,05). Data selanjutnya kemudian diuji dengan menggunakan one-way ANOVA. Hasil varian yang dilakukan terhadap densitas kolagen antar kelompok perlakuan menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan (p≥0,05).
4.4 Pembahasan
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh aktivitas antioksidan
Gamma oryzanol terhadap densitas kolagen pada mencit yang dipapar sinar
ultraviolet. Gamma oryzanol tidak dapat larut air (Patel M, 2004), sehingga dibutuhkan sediaan yang sesuai sebagai pembawanya. Dalam penelitian ini dipilih sediaan emulgel sebagai pembawa.
Sediaan emulgel merupakan sediaan emulsi, baik air dalam minyak (A/M) atau pun minyak dalam air (M/A), yang kemudian dibuat menjadi sediaan gel dengan cara mencampurkannya dengan bahan pembentuk gel. Sediaan emulgel memiliki kelebihan sebagai pembawa untuk zat aktif yang hidrofobik. Emulgel
233,194 234,8524 230,5352 229,502 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236
Kelompok Hewan Uji
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
membantu menyatukan bahan aktif hidrofobik ke dalam fase minyak yang kemudian globul minyak terdispersi ke dalam fase air (emulsi M/A) yang kemudian emulsi yang terbentuk dapat dicampurkan ke dalam basis gel (Checker
et al, 2012; Alexander et al., 2012; Jain et al., 2010), selain itu terdapat kelebihan
lain dari emulgel yaitu obat akan melekat cukup lama di kulit dan memiliki daya sebar yang baik serta memberikan rasa nyaman pada kulit dan mudah dioleskan (Magdy, 2004).
Pembuatan emulgel dilakukan dengan cara mencampurkan fase emulsi ke dalam fase gel. Pembuatan fase emulsi dilakukan pencampuran masing-masing fase, yaitu fase minyak (Gamma oryzanol, Rice bran oil, Vitamin E, Span 80) dan fase air (Tween 80 dan aquadest) pada suhu 70-80°C, kemudian pada suhu yang sama, fase minyak ditambahkan ke fase air sekaligus sambil diaduk dengan kecepatan 300rpm selama 15 menit (Khasanah, 2016). Pada formula ini, Tween 80 dan Span 80 berfungsi sebagai emulsifier (Arifin MF dkk, 2015), dan karbopol 940 sebagai gelling agent.
Pada penelitian ini dibuat dua sediaan yaitu sediaan emulgel yang mengandung zat aktif Gamma oryzanol 0,1% dan sediaan emulgel yang hanya mengandung basis sediaan. Kedua sediaan tersebut kemudian dilakukan evaluasi. Evaluasi sediaan pada penelitian ini bertujuan untuk memastikan bahwa sediaan yang akan diaplikasikan pada hewan uji sudah layak untuk diaplikasikan. Evaluasi pada penelitian ini terdiri dari uji organoleptis, uji ukuran globul, dan uji pH.
Pengamatan organoleptis dilakukan dengan cara mengamati sediaan emulgel secara visual yang meliputi warna, homogenitas dan tekstur (Khullar et
al., 2012). Uji homogenitas bertujuan untuk melihat dan mengetahui
tercampurnya bahan-bahan sediaan (Juwita et al., 2013).
Berdasarkan pengamatan, emulgel Gamma oryzanol dan basis menunjukkan bahwa kedua sediaan homogen dan memiliki karakteristik warna putih, tidak berbau, serta memiliki tekstur yang lembut dan tidak terlalu lengket.
Suatu sediaan yang dibuat harus memiliki rentang nilai pH yang sesuai. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter. Pada penelitian ini didapatkan nilai pH sediaan yang sesuai yaitu sebesar 6,1. Suatu sediaan jika bersifat terlalu asam maka akan dapat menyebabkan iritasi pada kulit sedangkan
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
jika bersifat terlalu basa maka akan membuat kulit menjadi kering (Suhery dkk, 2016).
Selanjutnya dilakukan pengukuran rata-rata diameter globul. Pengukuran ini bertujuan untuk mengetahui daya persebaran emulsi pada emulgel (Thomas J et
al., 2017). Pengukuran diameter globul rata-rata ini dilakukan pada minggu
pertama setelah pembuatan emulgel. Didapatkan hasil diameter rata-rata globul pada emulgel yang mengandung zat aktif Gamma oryzanol 0,1% sebesar 2,990µm dan emulgel basis sebesar 1,995µm. Hal ini sesuai dengan persayaratan, yaitu untuk ukuran diameter globul emulsi keruh berkisar 0,1-10 µm(Dewi et al., 2014). Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu 28 ekor mencit jantan, usia 6-8 minggu dengan berat badan 22-24 g, galur Deutschland, Denkenand and
Yoken (DDY) yang diperoleh dari penyedia fasilitas dan model hewan coba
(iRATco) yang disertai surat keterangan sehat dari Rumah Sakit Hewan Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) Institut Pertanian Bogor (IPB). Mencit dikelompokkan ke dalam 4 kelompok yakni kelompok P0 yang diberikan perlakuan berupa iradiasi sinar UV, kelompok normal, kelompok P1 yang diberikan perlakuan berupa iradiasi sinar UV dan pemberian basis sediaan emulgel serta kelompok P2 yang diberikan perlakuan berupa iradiasi sinar UV dan pemberian emulgel
Gamma oryzanol 0,1%.
Sebelum uji dilakukan, seluruh mencit diaklimatisasi selama 7 hari untuk memberikan waktu penyesuaian mencit di lingkungan baru. Setelah itu dilakukan pencukuran pada seluruh bagian dorsal mencit dengan cara bagian dorsal dioleskan menggunakan krim depilatori selama 3-5 menit dan dicukur. Daerah dorsal yang telah dicukur kemudian dibersihkan dengan alkohol 70%.
Iradiasi sinar UVB dilakukan dengan menggunakan lampu UVB KN-003 sebanyak 3 kali dalam seminggu yaitu pada hari senin, rabu dan jumat selama 4 minggu. Pada minggu pertama perlakuan, dosis sinar UVB yang diberikan yaitu sebesar 50 mJ/cm2 dengan lama penyinaran yaitu 50 detik, pada minggu kedua dosis dinaikan menjadi 70 mJ/cm2 dengan lama penyinaran yaitu 70 detik dan pada minggu ke-3 dan 4 dosis sinar UVB yang diberikan adalah sebesar 80 mJ/cm2 dengan lama penyinaran yaitu 80 detik, sehingga total keseluruhan iradiasi sinar UVB selama 4 minggu adalah sebesar 840 mJ/cm2.
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Bahan uji yang berupa basis emulgel dan emulgel gamma oryzanol 0,1% diaplikasikan 2 kali sehari, yaitu 20 menit sebelum disinari (untuk memberikan waktu absorbsi bahan topikal ke dalam kulit) dan 4 jam setelah penyinaran (terbentuknya ROS mulai 4 jam setelah paparan). Pengaplikasian bahan uji tetap dilakukan pada hari tanpa penyinaran (Soenarjady HW, 2014).
Setelah 4 minggu perlakuan, dilakukan pengambilan sampel kulit bagian dorsal untuk kemudian dilakukan analisa histopatologi. Pengambilan jaringan kulit dilakukan dengan cara mencit setiap kelompok dieutanasia dengan eter, kemudian diambil bagian kulit bagian dorsal dengan ketebalan sampai subkutan dan difiksasi dengan menggunakan formalin 10%. Setelah itu sampel dikirim ke bagian laboratorium patologi Institut Pertanian Bogor (IPB) untuk dilakukan pembuatan preparat dengan menggunakan pewarnaan Masson’s trichome. Pewarnaan dengan menggunakan Masson’s trichome digunakan untuk membedakan kolagen dari jaringan otot. Pewarna ini mewarnai daerah fibrotik yang kaya kolagen dengan warna biru (Ruegg MA et al., 2014).
Sinar UV memberikan dampak perubahan pada kulit secara klinis seperti
sunburn, penekanan kekebalan tubuh, kanker, dan penuaan kulit dini
(Photoaging) (Fisher GJ., et al, 1997). Paparan sinar ultraviolet B (UVB) secara berulang dapat mengakibatkan penurunan ekspresi enzim antioksidan dan meningkatkan modifikasi protein oksidatif dan akumulasi peroksidasi lipid dan produk glikasi (Vayalili et al, 2004). ROS yang terbentuk selama pejanan UV menghambat transforming growth factor (TGF)-ß sehingga produksi kolagen terhambat serta meningkatkan produksi matrix metalloproteinase (MMP)-1 yang merupakan enzim yang mendegradasi kolagen (Fisher, 2002; Helfrich 2008).
Gamma oryzanol merupakan senyawa antioksidan yang di dalam kosmetik
digunakan untuk mengatasi radikal bebas yang dihasilkan dari sinar ultraviolet dan polusi lingkungan (Lupo, 2001 dalam Juliano, Claudia et al., 2005) serta dapat digunakan sebagai anti kerut dan dapat digunakan untuk melembabkan kulit (Vorarat, Suwanna, et al., 2010).
Emulgel Gamma oryzanol dengan formula yang sama telah dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH oleh Nusrsetiyanti 2014. Berdasarkan uji tersebut didapatkan nilai IC50 (Inhibition concentration
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
50%) sebesar 6,527 μg/ml dan nilai AAI (antioxidant activity index ) 24,514 pada hari pertama dan pada hari ke-30 setelah pembuatan sediaan nilai IC50 sebesar 6,715 μg/ml serta nilai AAI 23,827. Menurut Blois, 1958 apabila nilai IC50 <50 μg/ml maka aktivitas antioksidan sangat kuat dan menurut Vasic et al., 2012 apabila nilai AAI >2 maka suatu sampel memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat.
Berdasarkan hal tersebut maka dapat disimpulkan bahwa formula emulgel
Gamma oryzanol 0,1% yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nilai
aktivitas antioksidan yang sangat kuat, sehingga peneliti memiliki hipotesis bahwa formula yang digunakan dalam penelitian ini dapat meningkatkan densitas kolagen pada mencit yang kolagennya sudah terdegradasi akibat iradiasi oleh sinar UVB yang dilakukan selama penelitian.
Pengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop optik (Olympus 1x71) pembesaran 100x. Masing-masing sampel preparat dilakukan pengambilan foto seluruh lapang pandang, kemudian dipilih foto sebanyak 5 lapang pandang pada setiap preparat untuk dianalisa. Foto disimpan dan dianalisis dengan mengukur serapan warna RGB (Red, Green, Blue) atau format RGB menggunakan program komputer adobe photoshop CS6.
Berdasarkan penampakan histopatologi secara visual (Gambar 4.2 dan 4.3) terlihat terdapat lapisan epidermis, sel kulit rambut, sel darah, sel adiposa, lapisan subkutan serta terdapat serat-serat kolagen yang ditunjukkan dengan warna biru dan terletak di antara lapisan epidermis dan subkutan. Pada penelitian yang dilakukan oleh Choi et al., 2018, peningkatan densitas kolagen ditandai dengan tersusunnya serabut kolagen yang rapat dan tebal. Pada penelitian ini, umumnya seluruh kelompok hewan uji menunjukkan serat kolagen yang rapat dan tebal sehingga tidak terdapat perbedaan yang signifikan secara visual, namun terdapat satu hewan uji pada kelompok perlakuan yang diberikan iradiasi sinar UV (Lampiran 5, no 9) yang terlihat sangat jelas secara visual mengalami degradasi kolagen yang ditandai dengan warna biru yang jauh lebih tipis dan tidak tersusun rapat.
Analisa kolagen secara kuantitatif dilakukan dengan menggunakan piranti lunak Adobe Photoshop CS6. Densitas kolagen dihitung dengan menganalisa
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
intensitas warna biru pada masing-masing gambar dari seluruh kelompok perlakuan dengan menggunakan fungsi histogram pada piranti lunak (Miot HA, 2010). Berdasarkan data yang diperoleh kemudian dilakukan analisa statistik dengan menggunakan SPSS 22. Hasil dari uji normalitas Kolmogorov-Smirnov menunjukan data rerata densitas kolagen terdistribusi normal (p≥0,05). Data kemudian diuji dengan menggunakan one-way ANOVA. Hasil varian yang dilakukan terhadap Densitas kolagen antar kelompok perlakuan menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan (p≥0,05). Dimana seharusnya densitas kolagen dari kelompok yang diberikan paparan sinar UV lebih kecil dibandingkan dengan densitas kolagen dari mencit yang tidak diberikan perlakuan (normal).
Hal ini terjadi kemungkinan dikarenakan dosis penyinaran yang kurang selama perlakuan dan selama masa perlakuan kulit bagian dorsal seluruh mencit tumbuh rambut setelah dua sampai tiga hari yang mengharuskan peneliti mencukurnya kembali agar tidak menghalangi sinar UV yang dipaparkan ke bagian dorsal atau pun menghalangi emulgel yang dioleskan. Pada saat proses pencukuran atau setelahnya, terjadi pembentukan luka pada beberapa mencit yang tidak dapat dihindarkan. Menurut Jorge de la Torre, 2007 melaporkan bahwa proses penyembuhan luka ini terbagi dalam tiga fase. Pertama yaitu fase inflamasi yang secara klinis ditandai dengan adanya kemerahan dan bengkak. Kedua yaitu fase poliferasi yang dimulai 2-3 hari setelah luka dan ditandai dengan adanya fibroblast yang berpoliferasi dan mensintesis glikosaminoglikan dan proteoglikan yang merupakan blok pembangun matriks ekstraseluler baru dari jaringan granulasi dan kolagen.selama poliferasi fibroblast, keratinosit dan populasi sel endotel juga dirangsang untuk meningkatkan jumlah. Setelah itu yang terakhir yaitu fase pematangan yang ditandai dengan produksi kolagen baru dari minggu pertama sampai minggu keenam. Remodeling kolagen menjadi struktur yang lebih terorganisir terjadi selama fase pematangan luka, yang berperan untuk meningkatkan wound tensile strength. Sehingga meski dilakukan iradiasi sinar UVB pada kelompok perlakuan yang dapat mendegradasi kolagen, namun tetap terdapat mekanisme penyembuhan luka yang juga merangsang pembentukan kolagen
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
BAB V