BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Desain Senyawa Inhibitor NF- κB
Tahapan yang pertama kali dilakukan adalah melakukan validasi dasar terhadap protokol yang akan digunakan untuk melakukan simulasi penambatan
molekul. Struktur kristal protein NF-κB diunduh dari RSCB melalui situs
http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=4G3G dalam format PDB dan disimpan dalam format yang sama untuk input dalam tahap molecular docking.
Data PDB menyebutkan bahwa struktur tiga dimensi dari protein NF-κB ditentukan
dengan menggunakan metode X-ray crystallography dan dipublikasikan pada tahun
2012. Struktur kristal ini kemudian direferensikan sebagai protein reseptor untuk mendesain obat baru.
Gambar 3. Struktur tiga dimensi protein NF-κB (de Leon-Boenig et al., 2012).
File PDB tersebut kemudian dipreparasi menggunakan aplikasi YASARA
kemudian akan digunakan dalam proses docking validasi protokol menggunakan
parameter RMSD. Selain dibutuhkan protein dan ligan dalam melakukan docking,
PLANTS juga membutuhkan configuration file (plantsconfig) untuk dapat
dijalankan. Plantsconfig merupakan sekumpulan konfigurasi yang terdiri dari
pengaturan scoringfunctionandsearchsettings, input dan outputfile, writesingle mol2 files, serta cluster algorithm yang digunakan untuk mengatur aplikasi
PLANTS dalam melakukan docking.
OH H N S N N F
Gambar 4. Struktur 4-fluoro-2-
{[4-(piridin-4-il)-1,3-thiazol-2-il]amino}fenol (0WA)
Gambar 5. Konfigurasi plantsconfig yang digunakan dalam proses docking
Dalam plantsconfig yang digunakan untuk melakukan docking, scoring function di-setting dengan string berupa plp. Scoring function merupakan pendekatan secara matematika yang digunakan memprediksi kekuatan interaksi non-kovalen (juga disebut sebagai afinitas pengikatan) antara dua molekul pada
proses docking. String yang digunakan pada scoring function adalah PLP
(Piecewise Linear Potential). PLP merupakan scoring function yang menilai interaksi yang ada berdasarkan gaya tarik dan tolak-menolak antara protein dan ligan (Korb, Stützle, dan Exner, 2009). String pada searchspeed digunakan speed1,
dimana pada pengaturannya akan menghasilkan simulasi docking yang mempunyai reliabilitas yang tinggi, namun mempunyai kecepatan pemrosesan yang paling rendah (bila dibandingkan dengan speed4) (Korb dan Exner, 2012). Pada baris selanjutnya, terdapat parameter inputfile. Parameter ini mengatur file yang akan
di-docking dengan PLANTS, dimana secara eksklusif PLANTS hanya dapat menjalankan docking dengan file ligan dan protein yang mempunyai eksistensi berupa .mol2 (Korb dan Exner, 2012). Pada parameter ini, keduanya di-setting
sesuai dengan file protein dan ligan yang akan di-docking. Untuk parameter output, parameter ini mengatur nama direktori yang akan dibuat oleh PLANTS untuk hasil
docking yang telah dilakukan (Korb dan Exner, 2012). Dalam pengerjaannya, parameter ini diisi dengan string berupa results. Pada parameter write single mol2
files, diisi dengan string 0 yang berarti file protein dan ligan hasil docking akan disimpan terpisah sehingga nantinya dapat digunakan dalam perhitungan RMSD (Korb dan Exner, 2012). Pada parameter cluster algorithm yang terdiri dari cluster structure, cluster rmsd, bindingsite center, dan bindingsite radius. Pada cluster structure, string diisi dengan dengan angka sepuluh yang merupakan default.
Cluster structure merupakan parameter yang menyatakan jumlah struktur yang
akan dihasilkan pada proses docking dengan parameter algoritma yang telah
ditetapkan (Korb dan Exner, 2012). Untuk cluster rmsd, parameter tersebut diisikan dengan angka dua sebagai default. Cluster rmsd adalah parameter yang menyatakan ambang batas dari nilai RMSD yang diijinkan dalam proses docking (Korb dan
menyatakan pusat koordinat dan radius dari situs pengikatan (Korb dan Exner, 2012).
Setelah itu, proses docking dilakukan dengan menggunakan plantsconfig
yang telah ditetapkan. Hasil docking menunjukkan bahwa dari input konformasi
yang di-submit untuk dilakukan simulasi perhitungan, konformasi ke-9
memberikan hasil terbaik dengan skor terendah (tabel II). Hasil tersebut kemudian
digunakan untuk menghitung RMSD pose ligan hasil docking yang dibandingkan
dengan referensi hasil eksperimen/struktur kristal. Dari perhitungan yang telah
dilakukan, diketahui bahwa RMSD antara senyawa hasil docking dan referensinya
sebesar 0,1656 Å. Nilai RMSD yang kurang dari 2 Å (1 Å = 10-10 m) memberikan
jaminan bahwa protokol dapat digunakan untuk memproduksi pose hasil kristal struktur dari ligan yang berinteraksi dengan protein NF-κB (Istyastono, 2010). Hasil tersebut menunjukkan bahwa protokol tersebut dapat digunakan untuk penapisan
secara virtual dalam upaya penemuan senyawa baru inhibitor NF-κB.
Tabel II. Skor dari pose terbaik untuk setiap konformasi senyawa hasil docking
Konformasi Skor PLANTSPLP
1 -84.1304 2 -83.7724 3 -84.3417 4 -80.4493 5 -84.5923 6 -85.0590 7 -78.8340 8 -83.9249 9 -86.1337
Gambar 6. Tumpang-tindih pose senyawa referensi yang diperoleh dari struktur kristal protein NF-κB (atom karbon berwarna biru) dan pose senyawa hasil
docking (atom karbon berwarna ungu).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Weber et al. (2006), diketahui bahwa kurkumin yang merupakan senyawaan enon dapat menghambat ekspresi dari protein NF-κB. Dari informasi tersebut, kemudian dilakukan docking terhadap kurkumin dan turunannya yang terdiri dari demetoksi kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin dengan menggunakan protokol yang telah divalidasi sebelumnya. Dari hasil visualisasi menggunakan PyMol (gambar 7), terlihat bahwa struktur kurkumin mengalami penekukan saat di-docking ke dalam protein NF-κB. Hal tersebut tentunya dapat dijadikan sebagai dasar dalam melakukan desain senyawa baru analog kurkumin dengan ukuran molekul yang lebih kecil dibandingkan kurkumin. Desain dilakukan dengan tetap mempertahankan sisi aromatis, gugus enon, substituen bagian aromatis dan menghilangkan bagian metilen aktif dari kurkumin. Bangun dasar senyawa yang akan digunakan merupakan suatu struktur enon yang terdiri dari dua gugusan karbonil, yakni 2-benzilidensikloheksana-1,3-dion (Istyastono, Yuniarti, dan Jumina, 2009). Berdasarkan hal tersebut, dapat didesain
suatu senyawa baru analog kurkumin, yakni 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena)
Gambar 7. Visualisasi interaksi kurkumin dengan protein NF-κB menggunakan PyMol
Hasil perhitungan menunjukkan bahwa senyawa 2-(4’-hidroksi-3’
-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion mempunyai skor PLANTPLP sebesar
-60,8375 (tabel III) dan berinteraksi dengan residu sistein (Cys 535) sebagai tempat
ikatan antara senyawa target dengan reseptor pada protein NF-κB (gambar 8). Skor
PLANTSPLP senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion
lebih besar dibandingkan dengan skor PLANTSPLP kurkumin yang telah diketahui
mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB (Weber et al., 2006). Oleh karena itu, senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion secara in silico diharapkan mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB
Tabel III. Skor PLANTSPLP hasil perhitungan dengan PLANTS
Struktur Senyawa Skor PLANTSPLP
O
O
HO H3CO
2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion
- 60.8375 H3CO HO O O OCH3 OH Kurkumin - 21.4551 H3CO HO O O OH Demetoksi kurkumin - 35.4851 HO O O OH Bisdemetoksi kurkumin - 46.7238
Gambar 8. Visualisasi interaksi senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dengan protein NF-κB menggunakan PyMol
B. Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion
Sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena)
sikloheksana-1,3-dion dilakukan dengan mereaksikan starting material berupa sikloheksana-1,3-dion
dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida (KOH)
menggunakan metode solid phase reaction. Sikloheksana-1,3-dion yang
merupakan starting material adalah senyawa yang mempunyai dua gugus keton
dengan enam hidrogen alfa, sedangkan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida adalah
suatu aldehida yang tidak mempunyai hidrogen alfa. Kedua starting material
tersebut dimungkinkan bereaksi melalui reaksi kondensasi aldol silang yang dapat
menghasilkan senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena)
sikloheksana-1,3-dion. Reaksi tersebut dapat terjadi karena adanya suatu senyawa karbonil yang mempunyai hidrogen alfa, yakni sikloheksana-1,3-dion dan suatu senyawa karbonil
lainnya yang tidak mempunyai hidrogen alfa, yakni
4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan bantuan katalis basa (KOH).
Gambar 9. Struktur sikloheksana-1,3-dion yang mempunyai dua gugus karbonil dan enam hidrogen alfa
Gambar 10. Struktur 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang mempunyai
gugus karbonil tanpa hidrogen alfa
Sikloheksana-1,3-dion mempunyai enam buah hidrogen alfa dengan diapit oleh dua atom karbonil yang menyebabkan molekul tersebut bersifat asam. Hal tersebut memungkinkan dengan adanya suatu basa, maka atom karbon alfa pada
sikloheksana-1,3-dion akan melepaskan atom hidrogennya sehingga terbentuk karbon yang bermuatan negatif atau yang dikenal sebagai karbanion. Dalam penelitian ini, digunakan katalis berupa kalium hidroksida (KOH) yang merupakan basa kuat. Penggunaan kalium hidroksida (KOH) dalam penelitian ini dimaksudkan agar hidrogen alfa yang bersifat asam pada molekul sikloheksana-1,3-dion dapat terlepas dengan mudah, sehingga dapat terbentuk ion karbanion. Terbentuknya sikloheksana-1,3-dion yang bermuatan negatif, maka senyawa tersebut bertindak sebagai nukleofil dalam reaksi sintesis ini.
Pada penelitian ini, reaksi diawali dengan proses pembentukan ion enolat dari dion. Proses pembentukan ion enolat dari sikloheksana-1,3-dion diawali dengan menambahkan katalis KOH yang akan mengalami ionisasi menjadi ion kalium (K+) dan hidroksil (-OH). Ion hidroksil yang terbentuk akan
mengambil hidrogen alfa pada sikloheksana-1,3-dion sehingga terbentuk ion
enolat. Ion enolat yang terbentuk kemudian akan mengalami proses stabilisasi dengan mekanisme resonansi.
Gambar 11. Reaksi pembentukan dan stabilisasi ion enolat yang terbentuk
Senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida merupakan senyawa yang bermuatan parsial positif pada atom C karbonilnya sehingga berperan sebagai elektrofil pada reaksi sintesis ini. Muatan yang terbentuk pada senyawa
4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida adalah efek yang ditimbulkan akibat pengaruh induksi dan resonansi dari atom oksigen yang bersifat elektronegatif. Adanya atom oksigen yang bersifat elektronegatif menyebabkan elektron pada atom karbon akan lebih tertarik pada atom oksigen sehingga atom C akan bermuatan parsial positif. Terbentuknya senyawa yang mempunyai muatan parsial positif memungkinkan ion enolat yang berasal dari sikloheksana-1,3-dion dapat menyerang atom C karbonil dari senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida.
Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion
dengan metode solidphasereaction dilakukan dengan menggerus starting material
yang digunakan di dalam mortir. Tujuan dari penggerusan tersebut adalah untuk
meratakan persebaran dan memperkecil ukuran partikel dari starting material yang
digunakan dalam campuran tersebut. Adanya penggerusan tersebut menyebabkan ukuran partikel starting material akan semakin kecil dan luas bidang kontak antarpartikel akan semakin besar sehingga kontak antara 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dan sikloheksana-1,3-dion semakin meningkat dan reaksi berlangsung secara efisien. Setelah campuran homogen, kemudian ditambahkan
katalis berupa pellet kalium hidroksida ke dalam campuran tersebut. Pada proses
penggerusannya, akan terjadi perubahan warna dari campuran yang digerus, dimana perlahan-lahan campuran tersebut yang semula berwarna putih akan berubah warna menjadi kekuningan. Perubahan warna merupakan pertanda terjadinya reaksi, dimana terdapat perpanjangan kromofor yang menyebabkan timbulnya warna kuning pada campuran yang digerus. Adanya energi yang diberikan melalui proses penggerusan mengakibatkan terjadinya reaksi pada campuran tersebut.
2-(4-hidroksi-3-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion C O O sikloheksana-1,3-dion H H
Pembentukan ion enolat:
-OH -H2O C O O H C O O H
resonansi ion enolat Pembentukan ion alkoksida:
C O O HO H3CO C O H 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida CH O O H3CO HO O (ion alkoksida) Pembentukan 2-(4-hidroks i-3-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion melalui dehidrasi aldol:
CH O O H3CO HO O CH O O H3CO HO OH CH O O H3CO HO OH H H O H --OH CH O O H3CO HO OH -OH -H2O CH O O H3CO HO OH --OH O O H3CO HO KOH K + OH
Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion HO H3CO O O
= auksokrom
= kromof or
Gambar 13. Kromofor dan auksokrom dari senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion
Proses penggerusan yang berlangsung kurang lebih selama 10 menit akan menghasilkan padatan yang berwarna kuning jingga. Untuk memperoleh senyawa hasil sintesis dalam bentuk serbuknya, maka akan dilakukan proses kristalisasi pada padatan yang terbentuk dengan menambahkan HCl 2N sebanyak 10 mL. Proses kristalisasi dilakukan dengan cara mengasamkan padatan yang terbentuk karena senyawa hasil sintesis berada dalam bentuk garam akibat keberadaan ion hidroksil (dari KOH) yang akan mengambil atom H dari gugus fenolik senyawa hasil sintesis
(gambar 14). Dalam suasana asam, akan terjadi pendesakan oleh ion H+ dari asam
yang ditambahkan terhadap garam yang terbentuk (dalam hal ini adalah kalium-4-((2,6-dioksosikloheksilidena)metil)-2-metoksifenolat), sehingga struktur senyawa hasil sintesis akan kembali ke dalam bentuk molekulnya. Adanya penambahan asam tersebut menyebabkan garam senyawa target yang sebelumnya larut dalam air akan dapat dipisahkan dengan starting material-nya. Endapan yang berupa serbuk kemudian disaring dengan kertas saring menggunakan bantuan pompa vakum. Endapan yang tertinggal pada kertas saring kemudian dicuci dengan aquades untuk menghilangkan sisa asam dari HCl yang ditambahkan ke dalamnya dari startingmaterial. Setelah dicuci hingga diperoleh serbuk yang sifatnya netral, serbuk tersebut kemudian dikeringkan dalam desikator selama dua hari. Pengeringan selama dua hari dimaksudkan agar pengeringan berlangsung dengan optimal dan diperoleh serbuk kering senyawa hasil sintesis.
H3CO HO O O + KOH H3CO O O O kalium-4-((2,6-dioksosikloheksilidena)metil)-2-metoksif enolat) K+ H3CO O O O + HCl H3CO HO O O 2-(4'-hidroksi-3'-metoksibenzilidena) sikloheksana,1-3-dion K+ + H2O + KCl
Gambar 14. Pembentukan garam dari senyawa hasil sintesis akibat keberadaan kalium hidroksida (KOH) dan penambahan HCl yang mengembalikan bentuk
garam senyawa target menjadi bentuk molekulnya
Berdasarkan perhitungan stoikiometri yang dilakukan terhadap rendemen hasil sintesis (crude product), diketahui bahwa jumlah senyawa yang dihasilkan dari tiga kali replikasi masing-masing sebanyak 0,378 g; 0,374 g; dan 0,378 g
dengan rendemen crude product masing-masing sebesar 38,157%; 38,075%; dan
37,661%. Hasil perhitungan yang ada menunjukkan bahwa rendemen hasil sintesis yang diperoleh relatif kecil, dimana rendemen hasil masih kurang dari 50%.
Rendemen hasil sintesis yang diperoleh relatif kecil disebabkan starting material
yang ditambahkan belum habis bereaksi karena sifatnya yang kurang reaktif dan saat proses pencucian untuk menghilangkan vanilin, terdapat serbuk senyawa hasil sintesis yang tercuci pada saat proses pencucian. Bila ditinjau dari struktur
4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang merupakan starting material, atom C
karbonil yang berperan sebagai elektrofil dapat mengalami stabilisasi resonansi menyebabkan atom C karbonil menjadi kurang positif untuk diserang oleh ion enolat yang terbentuk. Berdasarkan serbuk senyawa yang diperoleh dari tahapan sintesis tersebut, perlu dilakukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui apakah
serbuk yang didapat merupakan senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion atau bukan.
HO H3CO H O HO H3CO H O elektrofil 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida O H3CO H O
peristiwa stabilisasi resonansi
H
Gambar 15. Proses stabilisasi resonansi dari elektrofil yang terbentuk pada senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida
C. Analisis Pendahuluan