Liporotein lipase merupakan enzim kunci yang berperan dalam metabolisme dan transpor lipoprotein sehingga dapat meningkatkan level trigliserida darah.
Lipoprotein lipase juga berfungsi mengontrol partisi trigliserida pada jaringan adipose dan otot sehingga dapat meningkatkan penyimpanan lemak dan menyediakan energi dalam bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot.
Lipoprotein lipase (LPL) dikodekan oleh gen LPL. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi single nucleotide polymorphisms (SNPs) gen LPL. Total 66 DNA genom digunakan dalam penelitian ini, terdiri dari domba sumatera ekor tipis (50 ekor) dan domba garut (16 ekor). Amplifikasi DNA genom menggunakan metode
polymerase chain reaction dan metode direct sequencing digunakan untuk mengidentifikasi keragaman sekuens. Selanjutnya sekuens disejajarkan dengan metode Clustal W dan pensejajaran sekuens dengan gen bank nomor akses X.68308.1 menggunakan program BioEdit dan program MEGA 5.2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ditemukan tiga SNPs baru yaitu pada posisi basa g.26, g.27 dan c.192. Insersi sitosina atau guanina pada basa ke 26 dan insersi guanina pada basa ke 27 merupakan frameshift mutation. Substitusi timina menjadi sitosina pada c.192 adalah non synonymous mutation (Val>Ala), ditemukan pada domba garut.
Kata kunci: direct sequencing, domba, gen LPL, SNPs
ABSTRACT
Lipoprotein lipase is a key enzyme that plays in metabolism and transport lipoprotein as well as influence on blood triglyceride levels. Lipoprotein lipase controls triacyl glycerol partitioning between adipose tissue and muscle that increases fat storage or provides energi in the form of fatty acids for muscle growth. Lipoprotein lipase (LPL) is encoded by LPL gene. The research was aimed to explore single nucleotide polymorphisms of LPL gene. A total of 66 genomic DNA of Indonesian local sheeps, consisted of sumatera thin tail (50 heads) and garut (16 heads) sheeps were used in this study. Polymerase chain reaction was used to amplify genomic DNA and direct sequencing method was used to identify polymorphism sequences. The sequences were aligned with Clustal W method and BLAST sequence obtained from Gene Bank with accession number X.68308.1. The results showed three novel single nucleotide polymorphisms at g.26, g.27 and c.192. Insertion cytosine or guanine g.26 and insertion guanine g.27 were frame shift mutation. Substitution thymine to cytosine c.192 was a non synonymous mutation (Val>Ala), it was found in garut sheep. Keywords: direct sequencing, LPL gene, sheep, SNPs,
Pendahuluan
Domba merupakan salah satu ternak potong yang memberikan kontribusi dalam penyediaan daging merah di Indonesia. Domba tersebar di beberapa wilayah Indonesia, hidup dan berkembang biak dengan baik di suatu wilayah sehingga membentuk karakteristik fenotipe khas membentuk rumpun, diantaranya adalah domba garut dan domba ekor tipis sumatera.
Domba garut adalah domba yang berkembang di daerah Garut, Jawa Barat yang merupakan hasil persilangan dari domba ekor tipis jawa, domba kapstad dan domba merino. Domba kapstad merupakan domba ekor gemuk afrika (fat tailed africander) dari Afrika Selatan sedangkan domba merino diimpor dari Australia (Mason 1980). Pengembangan domba garut tidak terlepas dari kegiatan budaya berupa adu ketangkasan sehingga seleksi domba garut diarahkan untuk menghasil domba tangkas dan domba pedaging.
Asal usul domba ekor tipis sumatera tidak diketahui jelas (Bradford dan Inounu 1996) dan diduga berasal dari domba ekor tipis jawa (Priyanto et al. 2000). Domba ekor tipis sumatera dicirikan dengan warna tubuh dan kepala dominan coklat muda di samping warna putih dan hitam dengan satu atau dua pola warna dengan ukuran tubuh relatif kecil (Sodiq dan Tawfik 2004) dan memiliki wol kasar, daya adaptasi terhadap iklim tropis basah tinggi, dapat dikawinkan sepanjang tahun dan lebih resisten terhadap beberapa penyakit walaupun memiliki tubuh yang lebih kecil karena pertumbuhannya lambat (Priyanto et al. 2000). Pengembangan domba ekor tipis sumatera lebih diarahkan sebagai ternak potong.
Peranan lemak memberikan arti penting bagi penilaian konsumen terhadap daging yang akan dikonsumsi. Lemak memberikan pengaruh terhadap keempukan, juiciness, flavour serta kesehatan bagi yang mengkonsumsinya. Deposisi lemak dalam tubuh ternak dijumpai pada bagian visceral, subcutan,
intermuscular dan intramuscular (marbling). Marbling merupakan bagian dari otot sehingga tidak dapat dipisahkan, berbeda dengan lemak pada bagian lainnya.
Timbunan lemak pada otot ditentukan oleh keseimbangan dari proses yang berlangsung dalam tubuh termasuk lipogenic, lipolitic, transpor asam lemak dan jumlah asam lemak yang digunakan. Keseimbangan proses ini ditentukan oleh jumlah lemak yang dimakan, sintesis de novo asam lemak, sintesis triacylglycerol, degradasi lemak dan transport asam lemak (Zhao et al. 2010). Sifat-sifat yang mempengaruhi kualitas lemak seperti komposisi asam lemak, distribusi lemak, tipe serabut otot, sekitar 35% dipengaruhi oleh genetik (Williams 2008) dan sisanya dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti pakan.
Kualitas lemak tubuh ditentukan oleh sekelompok enzim yang disandikan oleh gen. Enzim-enzim penentu kualitas dan deposisi lemak tubuh dapat dikelompokkan ke dalam 9 kelompok yaitu 1) enzim yang berfungsi dalam biosintesa asam lemak 2) enzim pembatas dalam katabolisme asam lemak 3) enzim yang berfungsi dalam metabolisme lemak dan jaringan lemak melalui ekspresi gen 4) enzim yang berfungsi dalam transpor asam lemak ke jaringan 5) enzim yang berperan dalam metabolisme lipoprotein terutama dalam proses
reverse cholesterol transport 6) enzim yang berperan dalam penjenuhan asam lemak 7) enzim yang berperan dalam metabolisme dan fisiologi pertumbuhan 8) enzim pengatur terjadinya lipolisis dan menghambat lipogenesis dan 9) enzim
22
yang berperan dalam gluconeogenesis (Lee dan Hossner 2002; Scanes 2003; Zhao
et al. 2010; Crissa et al. 2010; Kaplanova et al. 2010; Cheeke dan Dierenfeld 2010; Sevane et al. 2013). Salah satunya adalah enzim lipoprotein lipase.
Mekanisme dan Fungsi Lipoprotein Lipase dalam Tubuh Ternak
Lipoprotein merupakan bentuk transpor lemak dalam darah berupa kompleks protein lipid, terdiri atas empat tipe: kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL), dan high density lipoprotein
(HDL) (Bender 1992; Bandara 1997; Cheeke dan Dierenfeld 2010). Lipoprotein terdiri dari kolesterol, trigliserida phospholipid dan apolipoprotein. Persentase masing-masing komponen pembentuk lipoprotein berbeda tergantung tipe lipoprotein yang terbentuk.
Pada ternak ruminansia, lemak yang telah mengalami lipolysis oleh bakteri rumen (anaerovibrio lipolytica dan butyrivibrio fibrisolven) dan biohidrogenasi diserap melalui dinding rumen sedangkan asam lemak rantai panjang dan asam lemak jenuh hasil sintesis de novo dan lemak pakan yang lolos dari transformasi mikroba masuk ke usus halus (Jenkins 1994; Wina dan Susana 2013). Setelah masuk ke usus halus, asam lemak akan bergabung dengan lisolesitin dan garam empedu. Lisolesitin berfungsi sebagai pengemulsi lemak sehingga dapat diserap oleh dinding usus membentuk triasilgliserol. Triasilgliserol akan dilipolisis oleh enzim lipase pankreas menjadi monogliserol, digliserol dan asam lemak bebas. Monogliserol dan diasilgliserol pada bagian mucosa usus dirakit menjadi triasilgliserol. Triasilgliserol mengandung asam lemak dengan rantai karbon lebih dari 12. Triasilgliserol bersatu dengan protein membentuk kilomikron (Collier 1985; Cheeke dan Dierenfeld 2010).
Kilomikron yang terbentuk disekresikan melalui sistem limfe dan masuk ke aliran darah. Kilomikron plasma darah masuk ke hati, jaringan adipose dan jaringan perifer ambing. Hati mengambil kilomikron langsung dari plasma darah sedangkan pada jaringan adipose dan jaringan ambing, kilomikron harus dipecah menjadi triasilgliserol dengan bantuan enzim lipoprotein lipase (LPL). Aktivasi enzim LPL dengan bantuan apoprotein C-II pada dinding kapiler. Melalui perantaraan enzim LPL, kilomikron melepaskan monoasilgliserol dan asam lemak bebas. Asam lemak bebas masuk ke dalam jaringan lemak dan otot yang dapat dipakai untuk pemenuhan energi melalui proses oksidasi atau sebagai cadangan energi (Gambar 3.1). Hati memiliki peranan penting dalam transpor dan metabolisme lemak. Fungsi hati yaitu 1) memfasilitasi pencernaan dan pencernaan lipid melalui sekresi bile 2) mensintesis dan mengoksidasi asam lemak 3) mengonversi asam lemak menjadi keton body 4) sintesis dan katabolisme lipoprotein (Giesecke 1983; Cheeke dan Dierenfeld 2010).
Lipoprotein lipase diproduksi dalam jaringan adipose, jantung dan otot rangka. Lipoprotein lipase ditransfer ke permukaan endothelium kapiler, menghidrolisis trigliserida dari bentuk kilomikron menjadi VLDL. Lipoprotein lipase mengontrol partisi triasilgliserol antara jaringan adipose dan otot sehingga meningkatkan penyimpanan lemak atau menyediakan energi dalam bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot (Bonnet et al. 2000; Dunner et al. 2013).
Lipoprotein lipase adalah enzim kunci yang berperan utama pada metabolisme dan transpor lipoprotein serta memberikan pengaruh penting pada level trigliserida darah (Wang et al. 2012).
Gambar 3.1 Transpor lemak ke jaringan (jaringan adipose, hati, otot rangka dan ginjal) pada ternak ruminansia dan non ruminansia (Sumber: Giesecke 1983)
Gen yang bertugas sebagai pengatur transkripsi dari gen-gen yang mengontrol metabolisme, adipogenesis dan menjaga homeostatis di dalam tubuh adalah peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARG) dan
peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha
(PPARGC1A). Peroxisome proliferator activated receptor gamma berfungsi
lipogenic dan adipogenic pada jaringan adiposit dan hepatosit serta berfungsi lipolisis karena merupakan promotor oksidasi asam lemak pada otot sehingga dapat menurunkaan ketersediaan lipid.
Aktivasi gen LPL pada otot (Gambar 3.2) dimulai dengan aktivasi gen
peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARG) oleh sirtuin (SIRT1) dan peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha
(PPARGC1A) pada saat kadar glukosa darah rendah dalam tubuh. PPARG akan memerintahkan gen LPL dan solute carrier family 2 member 4 (SLC2A4) untuk meningkatkan oksidasi asam lemak, pengambilan glukosa dan biogenesis pada mitochondria (Sevane et al. 2013). Perbedaan jenis jaringan lemak dan otot jantung tidak mengakibatkan terjadinya perbedaan ekspresi gen LPL pada domba, begitu juga perbedaan pemberian pakan (Bonnet et al. 2000).
Ac = asam asetat AcAc = asetoasetat BHB = hidroksi butirat FA = asam lemak FFA = asam lemak bebas GI = gastrointestinal LP = lipoprotein TG = triasilgliserol
24
Gambar 3.2 Mekanisme aktivasi gen LPL pada otot, dimodifikasi dari Sevane et al. (2013).
Struktur dan Letak Gen LPL
Gen LPL terdiri atas 10 exon, 9 intron (Gambar 3.3) pada domba terletak pada kromosom ke 2 (www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA).
Gambar 3.3 Struktur gen LPL terdiri atas 10 ekson (1, β,γ….10) dan 9 intron Keragaman gen LPL dan hubungannya dengan sifat-sifat produksi pada ruminansia telah dilaporkan pada domba (Bonnet et al. 2000; Crissa et al. 2010) sapi (Tank et al. 2012; Wang et al. 2012; Sevane et al. 2013), kambing (Badaoui
et al. 2012; Qin et al. 2012) dan Yak (Ding et al. 2012). Identifikasi keragaman gen LPL pada domba lokal Indonesia belum pernah dilakukan. Berdasarkan hasil penelitian pada tahap 1, disimpulkan bahwa keragaman gen LCAT tinggi pada kelompok domba ekor tipis (domba ekor tipis sumatera dan ekor tipis jawa) dan domba garut. Berdasarkan penelitian pada tahap 1 dan ketersediaan sampel domba di lapangan, maka pada penelitian tahap 2 ini, identifikasi keragaman gen LPL dilakukan pada dua rumpun yaitu domba ekor tipis sumatera dan domba garut.
Glukosa SIRT1 PPARG PPARGC1 A LPL Okisdasi Asam Lemak otot SLC2 A4
Bahan dan Metode Tempat dan Waktu
Ekstraksi dan amplifikasi PCR dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB dari bulan Oktober 2012 s/d Juni 2013. Identifikasi keragaman segmen gen LPL dilakukan dengan metode direct sequencing dengan mengirimkan sampel ke First Base Laboratory Juni s/d Agustus 2013.
Materi
Lima puluh sampel darah domba ekor tipis sumatera dan 16 ekor domba garut digunakan dalam penelitian ini. Total sampel DNA yang digunakan adalah 66 sampel.
Amplifikasi DNA Menggunakan Metode PCR
Amplifikasi fragmen gen LPL dari domba sumatera ekor tipis dan domba garut menggunakan metode PCR. Primer dirancang dengan bantuan program Primer Blast dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools.primer-blast) dengan nomor akses gen bank X.68308.1. Primer forward yang digunakan adalah F’5 AAACCTGCCGCTTCTAGCTC-γ’ dan primer reverse adalah F’5- TCTTGTAATCCTGTCGGCGG-γ’. Primer mengapit sekuens gen LPL pada posisi basa 17 hingga 277 dengan panjang produk 260 bp. Sekuens ini merupakan
bagian kecil dari 5’UTR (untranslated region) dan ekson pertama dari gen LPL
domba (Gambar 11).
Gambar 3.4 Amplikon gen LPL (gen bank nomor akses X.68308.1) dengan panjang 260 bp mengapit sekuens gen LPL c.17-c.277 merupakan bagian dari daerah 5’UTR dan bagian dari ekson 1. Primer ditandai dengan garis bawah, bold dan italic.
Setiap reaksi PCR terdiri atas 50 ng (2-3 µL) DNA template, 0.25 µM primer forward dan reverse, 12.5 µL Dream Tag Green Master Mix dari Thermo Scientific #K 1081 dan dH2O hingga 25 µL. Amplifikasi DNA menggunakan
mesin GeneAmp PCR sistem 9700 dan Master Cycler Personal 22331 Eppendorf. Amplifikasi gen LPL dilakukan menggunakan metode PCR. Amplifikasi bertujuan untuk memperbanyak DNA target yang akan dianalisis lebih lanjut menggunakan metode direct sequencing. Amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 95 oC selama 5 menit diikuti dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 oC selama 45 detik, annealing pada suhu 58 oC selama satu menit dan ekstensi pada suhu 72 oC selama satu menit. Selanjutnya ekstensi akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit.
Visualisasi Hasil PCR
Produk PCR selanjutnya diseparasi pada gel agarose 1.5% dalam 0.5 x TBE yang mengandung 200 ng/ml ethidhium bromide (EtBr) dan dikalibrasi
26
menggunakan 100 bp ladder marker. Elektroforesis dijalankan pada teganggan 100 volt selama 30 menit dilanjutkan visualisasi gel di bawah UV transilluminator. Produk PCR selanjutnya dikirim ke First Base Laboratory untuk dianalisis sekuensnya menggunakan dideoxy sequencing in ABI 3730 XL automated DNA sequencer.
Analisis Data
Hasil sekuens segmen gen LPL domba garut dan sumatera ekor tipis, dianalisis menggunakan BioEdit (Hall 2011) dan MEGA 5.2 (Tamura et al. 2007) untuk menemukan titik mutasi atau single nucleotide polymorphisms. Selanjutnya sekuen yang berbeda, diBLAST dengan sekuens gen bank nomor akses X.68308.1. Nilai frekuensi gen, frekuensi genotipe, heterosigositas harapan (He) dan heterosigositas pengamatan (Ho) serta uji keseimbangan Hardy-Weinberg dihitung menggunakan program POPGENE (Yeh et al. 1999).
Frekuensi gen dan genotipe dihitung menggunakan rumus menurut Nei dan Kumar (2000) yaitu;
;
Keterangan:
xi = Frekuensi gen ke-i
xj = Frekuensi gen ke-j
= Jumlah sampel dengan genotipe ii = Jumlah sampel dengan genotipe ij
N = Jumlah sampel
Frekuensi genotipe dihitung menggunakan rumus :
;
Keterangan:
= Frekuensi genotipe ke-ii
= Frekuensi genotipe ke-jj = Frekuensi genotipe ke-ij
Penyimpangan frekuensi genotipe yang muncul dari keseimbangan Hardy- Weinberg dianalisis menggunakan chi square test ( ) berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000);
∑
Keterangan:
= Nilai uji chi kuadrat
O = Frekuensi genotipe sampel yang diamati E = Frekuensi genotipe harapan
Nilai heterosigositas pengamatan (Ho) dan harapan (He) dihitung
Keterangan:
= Heterosigositas observasi = Heterosigositas harapan = Ukuran populasi efektif
= Frekuensi genotipe AiAj, populasi ke-k Hasil dan Pembahasan
Single Nucleotide Polymorphisms Gen Lipoprotein Lipase Domba Sumatera Ekor Tipis dan Domba Garut
Amplifikasi gen LPL menghasilkan amplikon dengan panjang 260 bp (Gambar 3.5), merupakan bagian dari 5’UTR dan ekson 1 dari gen LPL domba (Lampiran 2).
Gambar 3.5 Hasil amplifikasi PCR gen LPL daerah 5’UTR dan bagian dari ekson 1 dengan panjang 260 bp. M = DNA ladder 100 bp;
C48,C06, ….08 = kode sampel domba garut
Hasil aligment 66 sekuens gen LPL yang terdiri dari 50 sekuens domba sumatera ekor tipis dan 16 sekuens domba garut, ditemukan tiga titik mutasi baru atau tiga SNPs baru yaitu pada posisi basa g.26, g.27 dan c.192 (Gambar 3.6).
Tiga SNPs baru ini ditemukan pada domba garut dan hanya satu SNP ditemukan pada domba ekor tipis sumatera yaitu pada posisi basa g.26. Tiga SNPs pada domba garut terdiri atas insersi basa sitosina g.26>C, insersi basa guanina g.27>G dan mutasi timina menjadi sitosina c.192T>C membentuk 5 diplotipe yaitu diplotipe A, B, C, F dan G (Gambar 3.6). Insersi C atau G pada posisi basa g.26 (Gambar 3.7) pada domba ekor tipis sumatera membentuk 3 diplotipe yaitu diplotipe A, D dan E. Diplotipe A merupakan diplotipe yang persis sama dengan sekuens gen bank X.68308.1. Tiga SNPs ini merupakan SNPs baru yang tidak atau belum dilaporkan pada populasi domba lainnya.
M C48 C06 C39 C47 02 C7 C51 03 C11 C35 01 07 C41 10 05 08
260 bp 200 bp
Gambar 3.6 Aligment gen lipoprotein lipase domba garut dan domba ekor tipis sumatera dengan gen bank nomor akses X.68308.1 10 20 30 40 50 60 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Diplotype_A - - - - - - - - - - - - - - - TA A AC CTGC C - - GC T TCTAGCTC C C CAC C C TC C C C T T TA A AG G GT Diplotype_B - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_C - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_D - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . C - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_E - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . G - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_F - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . CG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_G - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . CG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . O.ovies_LPL_X68308 GA A T TCGCG GC CGCG G. . . . . . . . . - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 80 90 100 110 120 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Diplotype_A GAC T TGC TC C GCGC CAGAC CGC TGC TC CAGC C TGC TGC CGC C TCG G GCTCAGCG GCTC TA Diplotype_B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . O.ovies_LPL_X68308 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 140 150 160 170 180 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Diplotype_A C TGCTC TGTC CGCGC TCGCGC C C G GTGC C C CGCATCTC C TACG GAG G GACATC C C C CGAG Diplotype_B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . O.ovies_LPL_X68308 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 200 210 220 230 240 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Diplotype_A ATG GAGAGCA AG GTC C TGC T TC TGC TG GC TC TGAGCGTGTG GC TGCAGAGTCTGAC CGTC Diplotype_B . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_C . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_G . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . O.ovies_LPL_X68308 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250 260 270 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . Diplotype_A TC C CGCG GAG G GC TG GTCGC CGC CGACAG GAT TACA Diplotype_B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diplotype_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Keterangan: Insersi c.26>C dan c.27>G Keterangan: Insersi c.26>G
Keterangan: Adanya insersi c.26>C Keterangan: Tidak adanya insersi
Gambar 3.7 Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan adanya insersi pada posisi basa c.26 dan c.27.
Insersi pada daearah 5‘UTR gen LPL ditemukan pada posisi basa g.26>C
dan g.27>G (Gambar 3.7). Daerah 5’UTR (untranslated region) yaitu daerah
sebelum triplet pemulai (ATG) merupakan tempat ribosom melekat. Daerah
5’UTR merupakan daerah tempat terjadinya transkripsi dimulai atau disebut juga
transcription initiation site (Mignone et al. 2002; Nicholas β004). Daerah 5’UTR gen LPL domba sepanjang 178 nukleotida (Lampiran 2). Insersi pada daerah
5’UTR berperan penting dalam pengaturan ekspresi gen (Araujo et al. 2012) dan menyebabkan terjadinya kesalahan dalam proses replikasi DNA (Nei dan Kumar 2000). Insersi pada posisi basa g.26>C dan g.27>G menyebabkan munculnya
stop codon pada asam amino ke 13, 66 dan ke 73 (Gambar 3.8) sedangkan insersi
pada posisi basa g.26>G/C (Gambar 3.7) menyebabkan munculnya stop codon
pada posisi asam amino ke 6 dan 15 (Gambar 3.8). Mutasi pada posisi basa g.26
dan g.27 disebut dengan frameshift mutation yaitu adanya insersi satu atau dua
nukleotida menyebabkan munculnya stop codon tidak pada tempatnya (Griffiths
et al. 2000; Nei dan Kumar 2000; Nicholas 2004). Frekuensi munculnya SNPs
pada 5’UTR relatif kecil pada kedua populasi yang diuji (Tabel 3.1).
Mutasi transisi pada daerah ekson pertama gen LPL ditemukan pada posisi
basa c.192 (Gambar 3.9) pada populasi domba garut, merupakan non synonymous
mutation karena perubahan basa timina menjadi sitosina merubah asam amino valina menjadi alanina (Val>Ala)(Gambar 3.8). Substitusi nukleotida pada posisi
pertama atau kedua dari triplet kodon pada umumnya merupakan non synonymous
mutation sedangkan pada nukleotida yang ketiga merupakan synonymous mutation (Griffiths et al. 2000; Nei dan Kumar 2000). Dalam hal ini substitusi T>C terjadi pada posisi triplet ke dua yaitu GTC>GCC. Mutasi transisi
TA A A C CTGC 10 C C GCT TCTAG 20 CT TA 10 A AC CTGC CGG 20 T TCTAGCTC GA A A C CTG 10 C C C GC TCTAG 20 CTC TA A AC CTGC C 10 GCT TCTAGCT 20 C
30
merupakan substitusi basa yang memiliki struktur yang sama yaitu basa purin dengan basa purin (A>G) atau basa primidin dengan basa pirimidin (C>T)
(Griffiths et al. 2000). Mutasi pada posisi basa c.192 membentuk 3 genotipe yaitu
TT, CT dan CC. Lokus SNP c.192 bersifat polimorfik pada domba garut dan monomorfik pada domba ekor tipis sumatera.
Tabel 3.1 Diplotipe sekuens bagian dari 5’UTR dan ekson 1 gen LPL domba ekor tipis sumatera dan domba garut
Diplotipe Titik Mutasi Frekuensi (n)
g.26 g.27 c.192 ETS Garut Diplotipe A - - T 0.840(42) 0.186 (3) Diplotipe B - - C 0.000 (0) 0.375 (6) Diplotipe C - - C/T 0.000 (0) 0.313 (5) Diplotipe D C - T 0.020 (1) 0.000 (0) Diplotipe E G - T 0.140 (7) 0.000 (0) Diplotipe F C G T 0.000 (0) 0.063 (1) Diplotipe G C G C 0.000 (0) 0.063 (1) Total 50 16
Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera
Hasil penelitian Ding et al. (2011) melaporkan bahwa satu SNP pada ekson
7 gen LPL pada posisi basa 19913C>T mengakibatkan perubahan Phe>Ser bertanggung jawab terhadp sifat-sifat karkas dan deposisi lemak pada Yak. Tiga
SNPs pada daerah γ’UTR yaitu g.74 T>C, g.1γ0 T>C dan g.1γγ T>A berasosiasi
dengan kandungan Conjugated Linoleic Acid susu domba (Crisa et al. 2010).
Sevane et al (2013) melaporkan bahwa keragaman gen LPL pada sapi
berpengaruh terhadap kandungan ALTJG yaitu asam dihomo-gama-linolenat (C20:3n-6) dan asam arakidonat (C20:4n-6) dan belum pernah dilaporkan mengenai
pengaruh 3 SNPs yang ditemukan pada penelitian ini.
Gambar 3.8 Aligment sekuens protein gen LPL domba garut dan domba ekor tipis sumatera
Keterangan: Mutasi c.192T>C Keterangan: Mutasi c.192T>CT
Keterangan: tidak mengalami mutasi
Gambar 3.9 Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan adanya mutasi pada posisi c.192 T>C pada domba garut
Frekuensi Gen, Frekuensi Genotipe, Nilai Heterosigositas dan Keseimbangan Hardy-Weinberg Gen Lipoprotein Lipase c.192
Hasil penghitungan frekuensi gen dan frekuensi genotipe gen LPL domba sumatera ekor tipis dan domba garut disajikan pada Tabel 6. Frekuensi gen C (59.00%) pada domba garut, lebih tinggi dibandingkan gen T (41.00%) dan frekuensi genotipe tertinggi yaitu CC (43.80%), diikuti CT (31.20%) dan TT (25.00%) sedangkan pada domba sumatera ekor tipis hanya ditemukan satu genotipe TT berarti monomorfik.
Tabel 3.2 Frekuensi gen dan genotipe gen LPL domba garut dan domba sumatera ekor tipis pada posisi basa c. 192
Sub populasi Jumlah individu
Frekuensi Gen Frekuensi Genotipe
C T CC CT TT
Garut 16 0.590 0.410 0.438 0.312 0.250
ETS 50 0.000 1.000 0.000 0.000 1.000
Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera
Nilai heterosigositas merupakan deskripsi keragaman genetik dari suatu gen pada suatu populasi (Nei dan Kumar 2000). Nilai heterosigositas merupakan persentase lokus heterozigot tiap individu atau rataan persentase individu heterozigot pada suatu populasi (Marson et al. 2005). Hasil analisis menunjukkan bahwa domba garut memiliki nilai heterosigositas pengamatan sebesar 31.30% dan nilai heterosigositas harapan sebesar 49.80% (Tabel 7). Nilai heterosigositas berkisar nol sampai dengan satu . Nilai nol menunjukkan bahwa kekerabatan yang TG GA 140 GAGCA AG GC C 150 CTGCT TCTGC 160 T TG GAGA 140 GCA AG GTC C T 150 GCT TCTGC TG G AGAGCA 140 AG G TC CTGC T 150 TCTGC G GA G A GCAA GG T/CC C TG C T TCG
32
dekat diantara populasi yang diukur dan nilai satu menunjukkan tidak adanya hubungan kekerabatan (Nei 1987). Nilai heterosigositas yang didapatkan menunjukkan bahwa gen LPL pada domba garut adalah polimorfik.
Keseimbangan gen LPL dalam suatu populasi dapat diketahui dengan pendekatan hukum keseimbangan Hardy-Weinberg (Tabel 3.3). Apabila dalam suatu populasi, perkawinan berlangsung secara acak, tidak terjadi seleksi, mutasi dan genetic drift maka frekuensi genotipe dalam suatu populasi akan tetap dari satu generasi ke generasi berikutnya. Hasil uji chi square (χ2) menunjukkan bahwa frekuensi genotipe gen LPL pada domba garut berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg (P>0.05). Diduga alel C yang ditemukan pada gen LPL merupakan alel khas pada domba garut.
Tabel 3.3 Nilai heterosigositas dan uji chi square gen LPL domba garut dan domba ekor tipis sumatera
Sub Populasi Jumlah Individu Nilai Heterosigositas Nilai χ2 Ho He Garut 16 0.313 0.498 2.379ns ETS 50 0.000 0.000 0.000
Keterangan : ETS = ekor tipis sumatera; Ho = heterosigositas pengamatan; He =
heterosigositas harapan; ns = tidak berbeda nyata P>0,05 pada taraf α = 0.05
Hasil penelitian gen LPL memperlihatkan bahwa satu SNP pada ekson 7 pada posisi basa c.19913, merubah sitosina menjadi timina mengakibatkan perubahan fenilalanina menjadi serina, bertanggung jawab terhadap sifat-sifat karkas dan deposisi lemak pada Yak telah dilaporkan oleh Ding et al. (2011). Tiga
SNPs yang ditemukan pada daerah γ’UTR pada domba yaitu pada posisi basa
g.74, perubahan timina menjadi sitosina; g.130 perubahan timina menjadi sitosina dan g.133 substitusi timina menjadi adenina berhubungan dengan kandungan
Conjugated Linoleic Acid (CLA) pada susu domba (Crissa et al. 2010).
Keragaman gen LPL pada daerah 5’flanking region dan ekson 3,6,7,8 dan 9
memberikan pengaruh nyata terhadap deposisi lemak pada ayam (Liu et al. 2006). Begitu juga SNPs yang ditemukan pada ekson 5 c.645 C>T dan c.726 G>A pada