BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
D. Ekstraksi sampel
Ekstraksi yang dipilih untuk penelitian ini adalah maserasi. Metode
maserasi memiliki beberapa kelebihan di antara metode ekstraksi lainnya. Selain
dapat menjaga stabilitas senyawa fenolik yang terekstraksi dari sampel, metode
ini juga menguntungkan karena sederhana dan mudah dilakukan. Proses maserasi
dilakukan dengan melarutkan sampel ke dalam cairan penyari. Larutan penyari
yang digunakan yaitu etanol 70 %. Cairan penyari etanol 70% ini dipilih karena
senyawa-senyawa flavonoid mudah larut di dalam pelarut metanol maupun etanol
yang mengandung air 20-50 % (Bruneton, 1999) dan proses maserasi ini dibantu
dengan alat shaker. Penggunaan shaker pada proses maserasi bertujuan untuk
membantu agar hasil ekstraksi lebih maksimal dan efektif. Adanya bantuan
berpenetrasi ke dalam sel-sel tanaman. Proses maserasi ini dilakukan selama tiga
hari. Selanjutnya cairan penyari dipisahkan dari ampas serbuk kulit jeruk dengan
disaring. Penyaringan ini menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas
saring dan dibantu dengan pompa vakum. Pompa vakum digunakan untuk
membantu mempercepat proses penyaringan. Ampas hasil penyarian kemudian
diremaserasi lagi dengan menambahkan penyari etanol yang baru dengan volume
yang sama selama tiga hari seperti sebelumnya. Dan hasil remaserasi dipisahkan
dengan penyarinya dengan disaring menggunakan corong Buchner. Tujuan dari
remaserasi ini yaitu untuk menyari senyawa-senyawa yang mungkin belum
sempat terekstraksi karena penyari yang sudah jenuh.
Hasil maserasi dan remaserasi digabung menjadi satu dan diuapkan
pelarutnya menggunakan vacuum rotary evaporator. Prinsip dari alat ini yaitu
penguapan dengan penurunan tekanan. Jika tekanan uap suatu cairan sama dengan
tekanan atmosfer, maka cairan akan mendidih dan menguap pada titik didih
normalnya. Oleh sebab itu, dengan adanya vakum akan menurunkan tekanan pada
alat di bawah tekanan atmosfer sehingga menyebabkan suatu cairan mendidih di
bawah titik didih normalnya. Penguapan pelarut dengan menggunakan rotary
evaporator direkomendasikan untuk residu yang tidak tahan panas karena
temperatur pada penangas air pada rotary evaporator lebih rendah jika dibanding
pada penangas air biasa (Patiram, Brajendra Azad Thakur dan Ramesh, 2007).
Setelah itu, proses penguapan pelarut ini dilanjutkan dengan menggunakan oven
pada suhu 50oC untuk menghilangkan sisa-sisa penyari sampai diperoleh ekstrak
Ekstrak etanol kulit jeruk yang didapat kemudian dilarutkan dalam air
hangat karena ekstrak sulit untuk dilarutkan dalam air dingin. Ekstrak yang telah
larut kemudian diektraksi cair-cair dengan wash bensin dengan perbandingan
wash bensin : air (1:1 v/v) menggunakan corong pisah. Ekstraksi cair-cair
digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel atau clean-up sampel untuk
memisahkan analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin mengganggu
pada saat kuantifikasi atau deteksi analit (Gandjar, 2007). Prinsip dari ekstraksi
cair-cair merupakan pemisahan dua atau lebih senyawa yang saling campur
berdasarkan perbedaan polaritas dengan menggunakan dua pelarut yang memiliki
perbedaan polaritas yang tidak saling campur. Analit-analit yang mudah
terekstraksi ke pelarut organik adalah molekul-molekul netral yang bersifat
non-polar atau agak non-polar. Sementara itu, senyawa non-polar dan juga senyawa-senyawa
yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air. Pada partisi ini,
fraksi air akan berada di bagian bawah dan wash bensin di atas. Hal ini
dikarenakan bobot jenis air (0,996 g/ml) lebih besar jika dibandingkan dengan
wash bensin (0,730 g/ml). Bagian yang polar seperti polifenol dan flavonoid akan
terlarut ke dalam air, sedangkan bagian non polar seperti klorofil dan lipid akan
terlarut ke dalam wash bensin. Proses ekstraksi ini dilakukan berulang sampai tiga
kali sampai pelarut wash bensin menjadi bening yang menandakan bahwa tidak
ada lagi senyawa-senyawa yang tidak diinginkan yang terlarut di dalam fraksi air.
Fraksi yang diambil pada partisi ini adalah fraksi air yang mengandung polifenol
senyawa-senyawa yang terlarut bukan merupakan senyawa-senyawa yang ingin diuji dalam
penelitian ini.
Setelah itu, proses partisi dilanjutkan kembali menggunakan pelarut yang
berbeda, yaitu etil asetat yang berbobot jenis 0,898 g/ml dengan perbandingan
volume 1:1 v/v. Pada partisi ini, etil asetat berada di atas karena bobot jenis air
lebih besar (0,996 g/ml) dibandingkan etil asetat. Proses ekstraksi ini juga
dilakukan berulang, yakni tiga kali sampai pelarut etil asetat menjadi bening. Hal
ini menandakan bahwa tidak ada lagi senyawa yang larut dalam pelarut etil asetat.
Pada proses partisi ini, fraksi yang diambil adalah fraksi etil asetat karena
sebagian besar senyawa-senyawa flavonoid larut dalam fraksi etil asetat.
Fraksi etil asetat yang didapat, dievaporasi menggunakan vacuum rotary
evaporator untuk menghilangkan pelarut. Kemudian dioven untuk menguapkan
sisa-sisa etil asetat sampai didapat bobot tetap fraksi etil asetat ekstrak etanolik.
Fraksi etil asetat ini yang akan digunakan untuk uji aktivitas antioksidan dan
ditetapkan kandungan fenolik total yang dinyatakan sebagai ekivalen asam galat.
Berat fraksi etil asetat yang didapat yaitu 245 mg dan disimpan dalam eksikator
untuk menjaga stabilitas senyawa dari pengaruh cahaya maupun kelembaban
lingkungan.
E. Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan fenolik total
Uji pendahuluan fenolik total ini bertujuan untuk mengetahui adanya
kualitatif. Prinsip dari uji ini adalah reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa.
Penambahan natrium karbonat akan memberikan suasana basa yang akan
mengubah senyawa fenolik menjadi ion fenolat. Ion fenolat yang terbentuk akan
dioksidasi oleh asam fosfomolibdab-fosfotungstat dalam reagen Folin-Ciocalteu
yang menyebabkan larutan berubah menjadi warna biru. Keberadaan senyawa
fenolik dalam sampel positif apabila terjadi perubahan warna pada reagen
Folin-Ciocalteu yang berwarna kuning menjadi biru. Pada uji pendahuluan ini, fraksi
etil asetat ekstrak etanolik kulit jeruk nipis menunjukkan hasil positif dengan
adanya perubahan larutan menjadi berwarna biru, sehingga dapat dikatakan bahwa
mengandung senyawa fenolik.
Gambar 3. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = reagen Folin-Ciocalteu + larutan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk nipis, B = kontrol positif [reagen Ciocalteu + asam galat], C = blanko [reagen
Folin-Ciocalteu + natrium karbonat) 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Uji pendahuluan merupakan langkah awal dalam penentuan aktivitas
antioksidan yang bertujuan untuk mengetahui adanya aktivitas antioksidan dari
fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit jeruk nipis secara kualitatif. Uji ini
dilakukan dengan mereaksikan DPPH 0,4 mM dengan larutan sampel uji yang
dibandingkan dengan kontrol negatif (hanya larutan DPPH) dan kontrol positif
(larutan DPPH yang direaksikan dengan larutan baku pembanding, yaitu rutin).
Apabila senyawa uji memiliki aktivitas antioksidan, ketika direaksikan dengan
DPPH maka radikal DPPH akan menangkap elektron yang menyebabkan
berkurangnya ikatan rangkap konjugasi karena tidak adanya kesempatan elektron
untuk beresonansi. Reaksi ini ditandai dengan adanya perubahan warna larutan
DPPH yang berwarna ungu menjadi kuning. Pada hasil uji pendahuluan (Gambar
4) ini menunjukkan hasil positif untuk larutan rutin yang ditandai dengan
perubahan warna ungu menjadi kuning, sedangkan untuk larutan sampel uji juga
menunjukkan hasil positif dengan ditandai dengan adanya penurunan intensitas
warna ungu. Walaupun tidak terjadi perubahan warna manjadi kuning dan hanya
penurunan intensitas warna, tetap ada kemungkinan aktivitas antioksidan.
Gambar 4. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = larutan DPPH + larutan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk nipis, B =
kontrol negatif [larutan DPPH], C = kontrol positif [larutan DPPH + larutan rutin])
Gambar 5. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = larutan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk nipis + metanol, B = larutan
rutin + metanol)
F. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan