II. TINJAUAN PUSTAKA
2.5 ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMIDA SODIUM DODESIL SULFAT
Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi campuran berdasarkan pergerakan partikel-partikel koloid yang bermuatan, di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis banyak digunakan untuk analisis asam nukleat, virus, enzim, dan protein. Pemisahan senyawa dengan elektroforesis dilakukan berdasarkan perpindahan molekul bermuatan karena pengaruh medan listrik. Dalam larutan, protein akan bermuatan karena
14 bersifat amfoter. Pada titik isoelektriknya, protein tidak akan bergerak di bawah pengaruh medan listrik. Pada keadaan pH di bawah pH isoelektrik, protein bergerak sebagai kation di mana kecepatannya naik bersamaan dengan turunnya pH, kation ini akan bergerak ke arah elektroda negatif. Pada keadaan pH di atas pH isoelektrik, protein akan bergerak sebagai anion dan kecepatannya akan naik bersamaan dengan meningkatnya pH, anion ini akan bergerak ke arah elektroda positif (Bintang 2010).
Elektroforesis pada umumnya digunakan untuk menentukan berat molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein atau asam nukleat, menetapkan titik isolistrik, serta memisahkan spesies-spesies yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif. Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan elektroforesis adalah muatan penyangga, sistem buffer, suhu, waktu, dan besar arus. Semakin tinggi arus maka pemisahan semakin cepat, namun suhu akan bertambah (Bintang 2010).
Salah satu jenis elektroforesis yang digunakan secara luas pada saat ini adalah elektroforesis SDS gel poliakrilamida (SDS PAGE) (Bintang 2010). SDS-PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) adalah suatu metode yang sangat baik
untuk mengidentifikasi dan mengamati protein selama pemurnian serta untuk menilai homogenitas dari fraksi yang dimurnikan tersebut. SDS-PAGE biasanya digunakan untuk menentukan berat molekul subunit protein dan menentukan komposisi subunit dari protein yang dimurnikan. SDS-PAGE juga dapat digunakan dalam tahap persiapan dengan tujuan menghasilkan protein yang cukup untuk studi lebih lanjut (Garfin 1990). Metode SDS-PAGE merupakan metode yang paling sering digunakan untuk menganalisis campuran protein secara kualitatif. Metode ini memisahkan protein berdasarkan berat molekul (Gordon 1983). SDS-PAGE dinilai lebih menguntungkan dibandingkan elektroforesis kertas dan elektroforesis pati. Hal ini disebabkan karena besarnya pori medium penyangga serta perbandingan konsentrasi akrilamida dan bis-metilen akrilamida. Selain itu, gel ini juga tidak menimbulkan konveksi dan bersifat transparan (Bintang 2010). Skematik elektroforesis SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Skematik elektroforesis SDS-PAGE (Jage, 2008)
Medium penyangga dibuat dari reaksi polimerisasi akrilamid dan bis-metilen akrilamid yang dikatalisis oleh amonium persulfat dan tetrametiletilendiamin (TEMED). Polimerisasi akrilamid terjadi karena adanya cross linking antara N,N-metilen-bis akrilamid dan amonium persulfat sebagai katalisator. Polimerisasi ini memerlukan TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilen-etilendiamin) sebagai katalisator utama dalam mengawali terjadinya polimerisasi. TEMED menyebabkan terbentuknya formasi radikal bebas amonium persulfat yang akan bereaksi
15 dengan akrilamid dan menghasilkan akrilamid aktif. terbentuklah Akrilamid aktif akan bereaksi dengan sesama akrilamid membentuk polimer yang panjang dan gel. Gel elektroforesis terdiri dari dua bagian yaitu stacking gel dan separating gel. Stacking gel diperlukan agar awal pergerakan sampel sama (Bintang 2010).
Penambahan SDS pada gel poliakrilamid menghasilkan SDS-PAGE yang digunakan
untuk sampel terdenaturasi. SDS merupakan detergen anionik. SDS bersama dengan β-merkaptoetanol yang dilanjutkan dengan pemanasan akan merusak struktur tiga dimensi
menjadi bentuk lilitan acak (Gordon 1983). Hal ini terjadi akibat reduksi ikatan disulfida membentuk gugus sulfidril yang dapat mengikat SDS sehingga protein bermuatan sangat negatif dan bergerak ke arah kutub positif (Bintang 2010). Sementara, Gordon (1983) menjelaskan bahwa SDS-PAGE digunakan pada pH netral dimana pada pH 7 SDS akan membentuk komplek negatif dengan protein sehingga sampel akan bergerak ke arah elektroda positif. Matriks yang digunakan pada SDS-PAGE yaitu agarose dan poliakrilamid. Bahan ini dapat memisahkan molekul berdasarkan ukurannya karena matrik tersebut adalah gel penyerap. Gel penyerap dapat bertindak sebagai penyaring dengan proses perlambatan, atau dalam beberapa kasus dapat menghalangi pergerakan dari molekul yang besar dan membiarkan molekul yang lebih kecil untuk lebih bebas bermigrasi. Agarose gel cair umumnya lebih kaku dan lebih mudah untuk ditangani daripada poliakrilamida pada konsentrasi yang sama sehingga agarose digunakan untuk memisahkan protein besar dan protein kompleks (Gordon 1983).
Gel poliakrilamida bersifat porous dengan ukuran lubang sekitar 0,6-4,0 nm (diameter molekul protein globular 1,6-8,0 nm) dan ditentukan dari persen total akrilamida ditambah bis-akrilamid di dalam campuran gel, serta perbandingan relatif akrilamid dan bis-akrilamid. Migrasi protein di dalam gel poliakrilamida terutama ditentukan oleh muatan molekul dan juga dipengaruhi oleh ukuran molekul. Keberhasilan pemisahan senyawa dengan menggunakan SDS-PAGE tergantung juga pada metode preparasi contoh yang dilakukan, di samping pengaruh ukuran pori gel pemisah dan sistem buffernya (Bintang 2010).
Gel poliakrilamida dapat digunakan tidak hanya untuk pemisahan dari berbagai protein, tetapi juga untuk membandingkan berat molekulnya. Teknik ini dapat digunakan baik untuk tujuan preparatif maupun pemisahan analitik dari sampel protein. Biasanya dengan teknik elektroforesis ini hanya diperlukan beberapa mikrogram sampel protein (Bintang 2010). Gel hasil elektroforesis menunjukkan pita-pita protein dengan berat molekul yang berbeda. Protein dengan berat molekul yang lebih besar akan tertahan diatas, sedangkan protein dengan berat molekul yang lebih kecil akan berada dibawah. Penentuan berat molekul pita protein sampel berdasarkan pita protein marker dapat menggunakan persamaan regresi antara mobilitas relatif (Rf) protein marker dengan logaritma dari berat molekul marker yang telah diketahui. Nilai Rf tersebut dirumuskan sebagai:
Rf = jarak migrasi protein jarak migrasi
Persamaan regresi standar tersebut dapat digunakan untuk menentukan berat molekul pita protein sampel (dengan y = log BM protein dan x = nilai Rf pita protein). Contoh persamaan regresi marker untuk uji SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 7.
16 Gambar 7. Contoh persamaan regresi standar untuk uji SDS-PAGE
Interpretasi pita protein berdasarkan berat molekul ini umumnya dibandingkan dengan profil protein sejenis yang berasal dari pustaka lain. Profil protein kedelai dengan SDS-PAGE baik total protein maupun hasil pengisolasian protein 11S dan 7S sudah banyak dipublikasikan. Namun berat molekul subunit-subunit pada protein 11S maupun 7S merupakan suatu kisaran, sehingga ada beberapa literatur yang menyatakan berat molekul yang berbeda-beda.
17