Tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Untuk mempelajari, memahami dan melakukan prosedur yang benar dalam isolasi dan penghitungan coliform,faecalcoliform dan Escherichia colidengan metoda MPN (Most Probable Number).
2. Untuk mengevaluasi makna mikrobiologis dari mikroba indikator dalam bahan pangan basil ternak.
PENDAHULUAN
Bahan makanan hasil ternak dapat terkontaminasi mikroba patogen yang berasal dari faeses manusia, ternak dan unggas atau sumber lain. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri yang mungkin dapat ditularkan melalui bahan pangan hasilternak diantaranya: demam typhoid (Salmonella tuphii) dansalmonellosisyang lainya, kolera (Vibrio cholerae) dan basil desentri (Shigella dysenteriae). Virus penyebab penyakit hepatitis dan polio mungkin dapat juga ditularkan melalui bahan basil ternak dan faeses orang yang terinfeksi penyakit ini mengandung mikroba ini dalam jumlah yang tinggi.Produk hasil ternak dapat terkontaminasi melalui air yang tercemar oleh faeces.
Secara ekonomis tidaklah mungkin dilakukan pengujian bahan makanan hasil ternak secara rutin terhadap patogen spesifik.Dan juga jumlah spesies patogen pada produk hasil ternak sangat kecil sehingga sulit dideteksi dengan metoda pemupukan biasa.Oleh karena itu, pengujian mikroba patogen pada bahan makanan hasil ternak biasanya dilakukan berdasarkan adanya bakteri indikator seperti E.coli.Adanya Exoli sangat mudah diketahui dan karena bakteri ini berasal dari faeses maka keberadaanya di dalam bahan makanan hasil ternak mengindikasikan kontaminasi oleh faeses dan kemungkinan adanya (namun tidak selalu ada) spesies bakteri patogen seperti diatas.Biasanya pengujian baktericoliform – (dimana salah satunya adalah Ecoli).pada bahan makanan hasil ternak adalah untuk mengetahui kualitas sanitasi dalam penanganan atau proses produksi bahan makanan tersebut Coliform adalah bakteri Gram-negatif, berbentuk batang, fakultafif anaerob, tidak membentuk spora, dan memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas. Mereka terdapat dalam saluran usus manusia dan mengkontaminasi produk hasil ternak melalui air yang tercemar oleh faeses. Beberapa uji mikrobiologi dapat dilakukan terhadap air dan bahan makanan hasil ternak diantaranya adalah: (1) uji jumlah mikroba (total count), (2) uji kualitatif koliform, (3) uji terhadap jenis koliform, dan (4) ujikuantitatif koliform. Bakteri koliform yang terdapat dalam air dapat dibedakan dalam dua grup yaitu fekal koliform yaitu bakteri yang berasal dari kotoran, misalnya Escherichia coli, dan
grup nonfekal koliform yaitu bakteri yang berasal dari hewan atau tanaman yang telah mati, misalnyaEnterobacter aerogenes.
UjiKualitatif
Uji kualitatif kolifonn dapat dilakukan dalam tiga tahap yaitu: (1) uji penduga (presumptive test), (2) uji penguat (confirmed test), dan (3) uji lengkap (complete test). Analisa air tidak selalu harus melaui ketiga tahap tersebut tetapi tergantung dari macam atau komposisi air, serta tujuan penggunaan air tersebut. Sebagai contoh, uji penduga biasanya dilakukan terhadap air buangan atau air kotor lainnya, uji penguat dilakukan terhadap air yang diklorinasi, sedangkan uji lengkap dilakukan terhadap air minum atau air yang dikonsumsi masyarakat. (1) Uji Penduga
Pengujian terhadap coliform dilaksanakan dengan mengmokulasikan sampel ke dalam tabung reaksi berisi kaldu laktosa dan tabung Durham. Pengamatan terhadap indikasi terbentuknya gas dan asam dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Hanya sedikit spesies bakteri selain coliform dapat memfermentasilaktosa dengan cepat dan membentuk gas (Buckle et at 1982).
Hasil positif pada tahap ini belum memberi simpulan bahwa coliform ada dalam produk, sehingga hasilini disebut hasil, “presumptive” (penduga).Hasil positif pada uji ini membutuhkan konfirmasi lebih lanjut. (2) Uji Penguat
Beberapa coliform tidak berasal dan faeses, sehingga hasil positif yang diberikannya pada uji diatas memberikan hasil positif yang salah terhadap kontaminasi produk oleh faeses.Untuk mengurangi kesalahan tersebut dapat dilakukan uji penguat yaituuji Eiijkman atau uji EC.Pada ujipenguat ini kaldu laktosa ekstra yang telah diinokulasi sampel pada butir (i) diinkubasi pada suhu 44-45°C.Hasil positif yang ditunjukkan oleh terbentuknya gas menunjukkan kontaminasi oleh coliform fekal.Selanjutnya hasil positif tadi dibiakkan pada Ebsin Methylene Blue Agar(EMBA), atau Endo Agar. Jika digunakan EMB Agar, ada tiga macam koloni yang mungkin tumbuh yaitu: (a) koloni typical yaitu koloni dari E.coli yangberwarna hijau metalik, (b) koloni typikal yaitu koloni dari E. Aerogenes yang berwarna merah muda dengan titik hitam di tengah seperti mata ikan, dan (c) koloni lainnya yang tidak seperti kedua koloni di atas. Di atas Endo Agar, koloni koliform akan berwarna merah, sedangkan koloni dari bakteri lainnya yang tidak dapat memfermentasf laktosa akan berwarna .pucat atau tidak berwarna dan bening. (3) Uji Lengkap
Uji lengkap dilakukan terhadap semua contoh yang menghasilkan uji penguat positif. Tujuan dari uji lengkap adalah untuk: (a) mengetahui reaksi uji IMViC koloni koliform yang terbentuk pada EMB Agar atau Endo yaitu: pembentukan indole pada 44,5°C,produksi asam darigtukosa, pembentukan
acetoin, dan penggunaan sitrat di dalam medium, (b) melihat secara mikroskopis bentuk dan sifat bakteri yang tumbuh, yaitu dengan cara melakukan pewaraaan Gram. Bakteri yang termasuk koliform berbentuk batang/gram negatif, dan tidak membentuk spora.
Uji Terhadap Jenis Koliform
Perbedaan jenis bakteri koliform dapat diketahuidengan menggunakan empat macam uji yaitu: (a) uji pembentukan senyawa indole, (b)reaksi dengan methyl red, (c) uji Voges Proskauer, dan (d) reaksi sitrat. Keempat macam uji ini biasanya disingkat dengan nama uji IMViC (Indole, Methyl red, Voges Froskauer, and Citrate). Uji IMViC ini dapat membedakan apakah bakteri koli yang tumbuh termasuk dalam grup fekal yang hidup dalam usus manusia atau hewan, misalnya E.coli, atau termasuk dalam grup nonfekal yang hidup pada tanaman atau hewan mati, misalnya Escherichiafreundii dan Enterobacter aerogenes.
(a) Uji Indol
Bakteri yang tergolong dalam grup fekal dapat memecah asam amino tryptophan, dan menghailkan suatu senyawa berbau busuk yang disebut indol. Bakteri yangtelah diinkubasikan di dalam medium yang mengandung tryptophan, kemudian diberi tetesan pereaksi Kovacs yang mengandung amit alkohol, atau diberi kristal asam oksalat Adanya Indoi akan menyebabkan amil alkohol berubah warnanya menjadi merah tua, atau warna kristal asam oksalat berubah menjadi merah jambu (merah muda).
Uji yang menggunakan penunjukamil alkohol disebut metode Kovacs, sedangkan yang menggunakan penunjuk asam oksalat disebut metoda Gnesda. (b) Uji Methyl Red
Selama fermentasi, E.coli (fekal) akan menghasilkan asam lebih banyak daripada E.Aerogenes (nonfekal). Asam yang dihasilkan oleh E.colidapat menurunkan pH medium yang mengandung 0,5% glukosa sampai mencapai pH 5,0, yang menyebabkan methyl red yang dimasukkan ke dalam medium tersebut akan berwarna merah. Asam yang dihasitkan oleh E.aerogenes hanya dapat menurunkan pH sampai sekitar pH 6,0 atau lebih, sehingga methyl red akan berwarna kuning.
(c) Uji Voges Proskauer
Uji ini didasarkan atas pembentukan asetilmetilkarbinol (asetoin) oleh Eaerogenes, yaitu suatu hasitsampmg dari metaboHsme karbohidrat E.collitidak membentuk asetoin.
Asetoin dengan nadanya KOH dan udara akan teroksidasi menjadi asetil. Kemudian diasefil dengan adanya alfanaftol dan asam amino yang terdapat di dalam medium akan membentuk warna merah.
(d) Uji Sitrat
Uji ini didasarkan atas penggunaan sitrat di dalam medium oleh E.aerogenes, dimana sitrat merupakan satu satunya sumber karbon di dalam
medium tersebut E.Coli tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon.Adanya pertumbuhan dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan setelah 3- 4 hari.
Klasifikasi koliform berdasarkan uji IMViC dapat diiihat pada Tabel 1. Tabel 1. Kalsifikasi koliform berdasarkan Uji IMViC *)
Bakteri Indol Methyl Red Voges
Proskauer Sitrat Klasifikasi E.coli Var.I + + - - Fekal Var. II - + - - Fekal E. Freundii Var. I + + + ± Nonfekal Vap. II + - + Nonfekal E. aerogenes Var. I - - + ± Nonfekal Var. II + - + + Nonfekal *) Salle (1961)
Uji coliform, fecal coliform dan E.coli secara kuantitatif dapat dilakukan dengan metoda most probable number (MPN).
Adanya E.coli dalam produk basil ternak segar tidak secara absolut mengindikasikan bahwa produk tersebut telah tercemar oleh feeses atau tercemar oleh bakteri patogen. Adanya E.coli pada produk hasil ternak yang diolah menunjukkan bahwa proses pengolahan belum sempurna atau terjadi kontaminasi silang. Beberapa negara memiliki standar coliform, fecal coliform dan E.coli dalam produk bahan pangan yang sangat penting dalam pelaksanaan keamanan pangan untuk pasar eksport.
BAHAN PRAKTIKUM
Alcohol, batang gelas Bangkok, ose, loop, water-bath 44-45°C, inkubator 37°C, Untuk setiap grup mahasiswa:
5 Tabung reaksi berisi 9 ml larutan pepton steril 1 Botol berisi 90 ml pepton steril
14 Tabung reaksi berisi kaldu laktosa dan tabung Durham steril 14 CawanAgar EMBsteril
PELAKSANAAN PRAKTIKUM