(SSR) UNTUK Jatropha spp.
26. EU586351 F TAGAAGTTTTGTGATTAGGT 105 44 (GT)5 R GACTGCGTACCAATTCAT
27. EU586349 F CAAAATAAGTCGAAACAAAC R TATAGGCTCTTGCATAAATC 143 44 (A)6..(A)8..(CA)4
28. EU099534 F AGAAGAAAGAGGCGACAGGA R AAATTCTTGTTGTTCATGAGGATG 150 54 (GAA)7
Keterangan : * sumber : ; F = primer forward, R = primer reverse, Ta = temperatur annealing
32
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Semua aksesi sekuen DNA yang digunakan untuk mendesain primer SSR berasal dari DNA genom jarak pagar. Dua puluh lima aksesi adalah DNA genomik yang mempunyai mikrosatelit di dalamnya dengan panjang antara 129-
415 bp. Dua askesi merupakan bagian dari promoter gen ribosom inactivating
protein (489 bp [EF612741] dan 620 bp [EF612739]) sedangkan satu aksesi
sisanya adalah gen curcin precursor dengan panjang 1.802 bp (AF469003).
Berdasarkan runutan nukleotida aksesi DNA yang digunakan, pola ulangan mikrosatelit yang ditemukan adalah dinukleotida tunggal TG (6 aksesi), CA (5 aksesi), GT (3 aksesi) dan TC (1 aksesi), trinukleotida tunggal CTT, GAA, atau TAA (masing-masing satu aksesi) atau pola ulangan kombinasi antara dua dinukleotida (GT-AG, TA-TG, TA-CA), dinukleotida dan mononukleotida (TA- CA-C-A, AC-C, GT-G, CA-A) serta trinukleotida dan mononukleotida (TAA-A). Panjang primer hasil desain berkisar antara 18 – 26 bp. Suhu penempelan primer (primer annealing) bervariasi antara 44oC, 45oC, 54oC atau 55oC. Primer yang
telah didesain terbukti berhasil mengamplifikasi genom jarak pagar dengan konfirmasi pada gel agarosa 1.5% (Gambar 4).
Gambar 4 Elektroferogram hasil evaluasi produk amplifikasi PCR dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Pewarnaan gel agarosa
dilakukan dengan ethidium bromide dan foto gel diambil di bawah
pencahayaan sinar UV. Hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan templat genom jarak pagar dan pasangan primer (1) EF612741, (2) EU586345, (3) EF612739, (4) EU586340, (5) EU586343, (6) EU586344, (7) EU586346, (8) EU586347, dan (9) EU586348
33 1 2 3 4 5 6 7 EU586340 M EU586348 1 2 3 4 5 6 7 200 bp 400 bp 300 bp EU586344 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 EU586347 EU099522 1 2 3 4 5 6 7 M 200 bp 400 bp 300 bp
Hasil pemisahan ukuran produk amplifikasi dengan PAGE menunjukkan bahwa 28 pasangan primer yang dievaluasi menghasilkan produk amplifikasi dengan templat DNA genomik jarak pagar. Sembilan belas pasang primer diuji
pada templat DNA genomik J. multifida dan 14 di antarnya teramplifikasi. Jumlah
pita DNA hasil amplifikasi PCR yang muncul terdiri atas satu atau dua pita. Terdapat 12 pasang primer yang menunjukkan polimorfisme dengan ukuran pita
berbeda antara aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida. Empat belas primer
menunjukkan polimorfisme yaitu hanya muncul pada J. curcas (Gambar 5).
Gambar 5 Representasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan PAGE untuk lima aksesi tanaman jarak pagar dan dua
aksesi J. multifida dengan lima primer spesifik SSR. M: Marka DNA
(100 bp ladder), Aksesi tanaman: (1) J. multifida # 2, (2) J. multifida
# 1, (3) J. curcas PT 26-2, (4) IP -1A-2, (5) HS 49-2, (6) SP 6-3, dan
34
Hasil running PAGE menunjukkan bahwa dari 19 pasang primer yang
digunakan dapat menghasilkan 44 alel di mana 35 di antaranya (80%) merupakan alel polimorfik dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara 100 bp – 360
bp. Polimorfisme hanya terjadi antar alel-alel pada J. curcas dengan alel-alel J.
multifida. Sebaliknya, antar lima aksesi jarak pagar yang dievaluasi menunjukkan
pola pita yang sama. Kesamaan pola pita DNA hasil amplifikasi juga diamati
untuk kedua aksesi J. multifida yang diuji. Polimorfisme antara alel-alel yang
muncul di antara aksesi J. curcas dengan yang muncul di antara aksesi J. multifida
dapat berupa perbedaan ukuran pita DNA hasil amplifikasi atau berupa adanya
hasil amplifikasi untuk aksesi jarak pagar dan tidak ada hasil amplifikasi (null
alele) untuk aksesi J. multifida (Tabel 3).
Tabel 3 Konstitusi genetik berdasarkan hasil skoring alel marker SSR yang
diamplifikasi dari templat lima aksesi J. curcas dan dua aksesi J.
multifida dengan menggunakan 19 pasangan primer SSR yang didesain
dalam penelitian No
Primer 1 J. curcas 2 3 4 5 J. multifida6 7
1. EU586348 13 13 13 13 13 24 24 2. EU586340 13 13 13 13 13 12 12 3. EU586346 12 12 12 12 12 12 12 4. EU586347 13 13 13 13 13 12 12 5. EU586343 12 12 12 12 12 22 22 6. EU586344 22 22 22 22 22 11 11 7. EF612741 12 12 12 12 12 12 12 8. EU099521 12 12 12 12 12 11 11 9. EU099522 12 12 12 12 12 - - 10. EU099523 11 11 11 11 11 22 22 11. EU099524 12 12 12 12 12 - - 12. EU099526 11 11 11 11 11 - - 13. EU099529 11 11 11 11 11 - - 14. EU099530 12 12 12 12 12 - - 15. EU099531 11 11 11 11 11 22 22 16. EU099533 14 14 14 14 14 23 23 17. EU586351 13 13 13 13 13 22 22 18. EU586349 33 33 33 33 33 12 12 19. EU099534 12 12 12 12 12 11 11
Catatan: (-) null alele, pasangan primer SSR yang digunakan tidak menghasilkan produk amplifikasi dengan tempat DNA J. multifida. Individu dengan konstitusi genetik yang direpresentasikan oleh dua angka yang sama (contoh: 11, 22, atau 33) berarti homosigot untuk masing-masing alel sedangkan jika dua angka yang berbeda (contoh: 12, 13, 14, 23 dan 24) diduga berarti heterosigot.
35 Pembahasan
Ekstraksi DNA
Metode ekstraksi DNA yang digunakan pada penelitian ini dimulai dengan mengacu pada metode CTAB standar (Doyle dan Doyle, 1990) yang telah digunakan untuk jarak pagar (Basha dan Sujatha, 2007), tetapi ternyata sulit dilaksanakan karena tidak berhasil menghilangkan kontaminasi klorofil. Molekul DNA yang berupa benang-benang putih tidak didapatkan dan muncul endapan berupa serbuk putih. Selain itu, hasil ekstraksi yang didapat menggunakan protokol yang digunakan Basha dan Sujatha (2007) sulit dilarutkan dalam buffer TE dan molekul DNA genomik yang didapatkan juga mempunyai kualitas rendah. Sampel DNA juga terlihat banyak tertinggal pada sumur gel agarosa, yang mengindikasikan tingginya kontaminan protein, polisakarida atau metabolit
sekunder pada sampel DNA (Do dan Adams, 1991; Sharma et al., 2002).
Jarak pagar dan J. multifida termasuk dalam famili Euphorbiaceae yang
banyak menghasilkan getah sehingga diduga kualitas serta kuantitas DNA yang kurang bagus dari hasil ekstraksi ini berkaitan keberadaan kontaminan tersebut. Berdasarkan penelusuran pustaka diperoleh metode modifikasi untuk ekstraksi DNA tanaman yang mengandung banyak protein dan polisakarida yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan penambahan NaCl
konsentrasi tinggi pada saat presipitasi (Sudheer et al., 2009). Modifikasi dalam
prosedur isolasi DNA ini telah diterapkan, yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dari 1.4 M menjadi 3.5 M dan menambahkan NaCl hinga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi bersamaan dengan penambahan isopropanol.
Berbagai modifikasi tahapan isolasi DNA yang digunakan tersebut masih belum sepenuhnya dapat menghilangkan kontaminan yang terbawa selama proses ekstraksi DNA, namun demikian kualitas DNA yang didapat sudah memadai untuk keperluan amplifikasi PCR. Penggunaan marka SSR tidak menuntut
kualitas DNA sangat tinggi untuk pelaksanaannya (Semagn et al. 2006). Jika
hasil ekstraksi DNA tanpa purifikasi telah memadai untuk proses amplifikasi PCR maka langkah ini dapat dilewati untuk efisiensi.
36 Desain primer
Aksesi yang diperoleh dengan pencarian menggunakan kata kunci umum
Jatropha curcas ternyata tidak semua menghasilkan sekuen yang berasal dari
jarak pagar. Pengembangan primer dalam penelitian ini dimaksudkan untuk mendapatkan primer spesifik yang berasal dari jarak pagar sehingga kata kunci
pencarian dipersempit. Kata kunci Jatropha curcas + microsatellite digunakan
dan mendapatkan 39 aksesi sekuen DNA. Dari jumlah luaran pencarian yang diperoleh mengidikasikan penelitian tentang jarak pagar khususnya yang berkaitan dengan marka SSR masih sangat sedikit. Aksesi-aksesi yang diperoleh ini sebagian besar berasal dari penelitian tahap awal untuk mengidentifikasi SSR pada jarak pagar. Sebagian besar aksesi yang diperoleh mempunyai SSR di dalamnya karena kata kunci yang digunakan sudah sangat spesifik, tetapi tidak semua dapat didesain primernya.
Primer SSR baru dapat didesain dari sekuen DNA jika sekuen yang
bersangkutan memiliki flanking region minimal 20 bp. Primer terbaik didesain
dengan beberapa pertimbangan di antaranya adalah GC content atau perbandingan
kandungan nukleotida G dan C dalam primer sehingga panjang 20 bp pada sisi-
sisi forward dan reverse SSR seringkali tidak mencukupi untuk dapat dibuat
primer. Beberapa aksesi yang ditemukan tidak dapat didesain primernya karena sekuen yang terlalu pendek. Posisi SSR dari sekuen yang ditemukan juga menentukan bisa atau tidaknya sebuah primer didesain. SSR yang berada pada ujung sekuen menyebabkan primer tidak dapat didesain dari sekuen yang bersangkutan.
Pengujian pasangan primer spesifik SSR yang didapat untuk melakukan amplifikasi PCR menggunakan templat DNA jarak pagar mengindikasikan bahwa semua pasangan primer mampu menghasilkan produk amplifikasi. Ini paling tidak mengindikasikan dua hal, yaitu bahwa kualitas dan kuantitas DNA yang diekstraksi cukup memadai untuk digunakan sebagai templat dan pasangan primer hasil desain yang dilakukan mampu menghasilkan produk amplifikasi PCR. Kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar (Gambar 5) dapat diartikan bahwa pada genom tanamannya terdapat satu lokus (misalnya lokus EU586347) dan dalam lokus EU586347 yang dianalisis terdapat dua alel. Dengan demikian,
37
konstitusi genetik aksesi yang dianalisis bersifat heterosigot (misalnya dengan
pasangan alel 12), mengingat bahwa SSR adalah marka ko-dominan (Robinson et
al., 2004) yang mampu membedakan individu heterosigot (12) dari yang
homosigot (11 atau 22). Sebagai alternatif, kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar yang diuji juga dapat mengindikasikan kemungkinan adanya lebih dari satu lokus di dalam genom tanaman (duplikasi) dan masing-masing lokusnya mempunyai konstitusi alel dalam kondisi homosigot (misalnya lokus EU586347-1 dengan alel 11 dan lokus EU586347-2 dengan alel 22). Pembuktian terhadap dua kemungkinan ini dapat dilakukan dengan mengevaluasi segregasi pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan primer terpilih pada
populasi tanaman jarak pagar F1 hasil selfing.
Jika dua pita yang dihasilkan merupakan alternatif alel dalam satu lokus yang sama (misalnya lokus EU586347 dengan pasangan alel 12), maka pada
populasi tanaman jarak pagar F1 diharapkan terjadi segregasi tanaman F1 dengan
konstitusi alel pada lokus EU586347 sebagai 11 (homosigot, proporsi 25%), sebagai 12 (heterosigot, proporsi 50%) dan sebagai 22 (homosigot, proporsi 25%). Sebaliknya, jika dua pita tersebut merupakan representasi dari dua lokus (lokus EU586347-1 dan lokus EU586347-2) dan konstitusi alel untuk kedua lokus tersebut homosigot (lokus EU586347-1 dengan alel 11 dan lokus EU586347-2
dengan alel 22) maka semua individu F1 yang dievaluasi akan mempunyai produk
amplifikasi dengan dua pita yang sama sebagaimana tetua yang digunakan untuk
menghasilkan tanaman F1.
Selfing beberapa individu jarak pagar telah dilakukan oleh peneliti lain. Dari
hasil analisis yang dilakukan terhadap 16 individu F1 hasil selfing (aksesi J.
curcas no 4) yang telah dilakukan menunjukkan bahwa dua pita yang muncul
pada tetua juga dijumpai pada F1 . Di antara 16 individu F1 yang diuji, tidak
diamati adanya segregasi dari pita-pita DNA hasil amplifikasi. Hal tersebut mengindikasikan bahwa dua pita yang didapatkan dari hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer spesifik SSR tersebut merepresentasikan dua lokus yang berbeda (duplikat lokus) dengan alel yang homosigot dan bukan satu lokus yang heterosigot. Representasi hasil amplifikasi PCR menggunakan tujuh
38
Gambar 6 Representasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) untuk empat
individu tanaman jarak pagar F1
Berdasarkan hasil evaluasi, pasangan primer spesifik SSR yang didesain dalam penelitian ini tidak polimorfik untuk sejumlah aksesi tanaman jarak pagar yang dievaluasi. Deteksi tingkat polimorfisme yang rendah menggunakan pasangan primer yang dikembangkan dapat menjadi indikator rendahnya tingkat keragaman genetik tanaman yang diuji atau tingginya tingkat konservasi bagian genom yang digunakan untuk mendesain primer.
Polimorfisme yang rendah bisa terjadi sebagai akibat sampling pada bagian genom dengan tingkat konservasi runutan DNA yang tinggi. Akibat tingginya tingkat konservasi bagian genom yang diamplifikasi dengan primer spesifik SSR, meskipun aksesi yang dievaluasi mempunyai keragaman genetik yang tinggi maka akan tetap menghasilkan produk amplifikasi yang monomorf untuk semua aksesi jarak pagar yang dievaluasi.
(A-D), dengan menggunakan pasangan primer (1) EU586345, (2) EU586343, (3) EF612741, (4) EU586347, (5) EF612739, (6) EU586346, dan (7) EU586340.
Salah satu keuntungan penggunaan marka SSR adalah sifatnya yang dapat
diamplifikasi menggunakan templat tanaman sekerabat (cross specific
amplification ability) (Rossetto et al., 1999; Park et al., 2009). Pasangan primer
yang didesain dalam penelitian ternyata mampu menghasilkan produk amplifikasi
dan polimorf antara jarak pagar dengan J. multifida. Dengan demikian, pasangan
primer tersebut paling tidak akan dapat digunakan untuk identifikasi hasil
persilangan F1 inter-spesies antara J. curcas x J. multifida atau kemungkinan
1 2 3 4 5 6 7 A 1 2 3 4 5 6 7 B 1 2 3 4 5 67 D 1 2 3 4 5 6 7 C
39
dengan spesies lain. Evaluasi lebih lanjut pemafaatan primer spesifik SSR yang
telah dikembangkan untuk menganalisis lebih banyak aksesi J. curcas, aksesi J.
multifida, dan aksesi Jatropha spp. lainnya masih perlu dilakukan untuk
mengetahui efektivitas pemanfaatan primer spesifik SSR yang telah dikembangkan.
Kesimpulan
DNA jarak pagar dapat terekstraksi dengan baik menggunakan protokol CTAB yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan pada saat presipitasi. Dua puluh delapan pasang primer spesifik SSR telah berhasil didesain menggunakan aksesi DNA genomik asal jarak pagar yang
ditemukan pada basis data GenBank DNA. DNA genomik asal jarak pagar dan J.
multifida dapat digunakan dengan efektif sebagai templat untuk amplifikasi PCR.
Primer yang didesain dalam penelitian ini tidak menghasilkan pita hasil
amplifikasi yang polimorfik antar aksesi jarak pagar yang diuji atau antar aksesi J.
multifida. Marker SSR yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak
pagar dengan aksesi J. multifida sehingga dapat digunakan sebagai marka untuk
mendeteksi hasil persilangan F1
Do N, Adams RP. 1991. A simple technique of removing plants polysaccharides
contaminants from DNA. Biotechniques. 10:162-166
inter-spesies J. curcas x J. multifida.
Daftar Pustaka
Asbani N, Heliyanto B. 2008. Kompatibilitas persilangan interspesifik Jatropha
curcas x J. integerrima. Infotek Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) 3(2):7
Basha SD, Sujatha M. 2007. Inter and intra-population variability of Jatropha
curcas L. characterized by RAPD and ISSR markers and development of
population-specific SCAR markers. Euphytica 156:375–386
Dieffenbach CW, Lowe TM and Dveksle GS. 1993. General concepts for PCR
primer design. Genome Res. 3: S30-S37
Divakara BN, Upadhyaya HD, Wani SP, Laxmipathi Gowda CL. 2010. Biology
and genetic improvement of Jatropha curcas L.: A review. Applied Energy
40
Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13–
15
Fairless D. 2007. Biofuel: The little shrub that could maybe. Nature 449:652-655
Guerra-Sanz JM. 2004. New SSR markers of Phaseolus vulgaris from sequence
databases. Plant Breeding 123: 87-89
Heller J. 1996. Physic nut Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use
of under utilized and neglected crops. International Plant Genetic Resources Institute. Rome
sequence alignments.
Kaushik N, Kumar K, Kumar S, Kaushik N, Roy S. 2007. Genetic variability and
divergence studies in seed traits and oil content of Jatropha (Jatropha
curcas L.) accession. Biomass and Bioenergy 31:497-502
Makkar HPS, Becker K, Sporer F, Wink M. 1997. Studies on nutritive potential
and toxic constituents of different provenances of Jatropha curcas. J.
Agric. Food Chem. 45:3152-3157
Ou WJ, Wang WQ, Li KM. 2009. Molecular genetic diversity analysis of 120
accessions Jatropha curcas L. germplasm. Chinese Journal of Tropical
Crops 30:287-292
Park YJ, Lee JK, Kim NS. 2009. Simple sequence repeat polymorphisms (SSRPs) for evaluation of molecular diversity and germplasm classification of
minor crops. Molecules 2009, 14, 4546-4569
Rakoczy-Trojanowska M. 2004. Characteristics and a comparison of three classes
of microsatellite-based markers and their application in plants. Cellular &
Molecular Biology Letters 9:221-238
Robinson AJ, Love CG, Batley J, Barker G, Edwards D. 2004. Simple sequence
repeat marker loci discovery using SSR primer. Bioinformatics
Application Note 20(9):1475-1476
Röder MS et al. 1995. Abundance, variability and chromosomal location of
microsatellites in wheat. Mol. Gen. Genet. 246: 327-333
Rosado TB et al. 2010. Molecular marker reveal limited genetic diversity in a
large gerplasm collection of the biofuel crop Jatropha curcas L. in Brazil.
Crop Science 50:2372-2382
Rossetto M, Shepherd M, Cordeiro GM, Harriss FCL, Lee LS and Henry RJ. 1999. Cross species amplification of microsatellite loci: a valuable tool for genetic studies in plants. Paper presented to the Plant and Animal Genome VII Conference, San Diego, California, USA, 17-21 January
41
Rozen S, Skaletsky HJ. 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Di dalam: Krawetz S, Misener S. editor.
Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology.
Humana Press, Totowa, NJ. hlm 365-386
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York, USA
Sanwen H et al. 2000. Development of pepper SSR markers from sequence
databases. Euphytica 117:163–167
Semagn K, Bjørnstad Å, Ndjiondjop MN. 2006. An overview of molecular
marker methods for plants. African Journal of Biotechnology 5(25):2540-
2568
Sharma AD, Gill PK, Sigh P. 2002. DNA isolation from dry and fresh samples of
polysaccharides-rich plants. Plant Mol Biol Rep. 20: 415 a-f
Sudheer PDVNS, Meenakshi, Sarkar R, Boricha G, Reddy MP. 2009. A simplified method for extraction of high quality genomic DNA from
Jatropha curcas for genetic diversity and molecular marker studies. Indian Journal of Biotechnology 8:187-192
Tatikonda L, Suhas WP, Seetha K. 2009. AFLP-based molecular characterization
of an elite germplasm collection of Jatropha curcas L. a biofuel plant.
42