Evaluasi terhadap hasil pewarnaan dilakukan dengan cara melihat kepadatan titik-titik berwarna coklat-hitam yang muncul dalam satu lapang pandang. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan t-student yang tidak berhubungan.
43
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Hati
Penetapan kadar protein di dalam ekstrak hati memerlukan kurva baku yang diperoleh dengan mengukur nilai absorbansi dari rangkaian berbagai tingkat konsentrasi larutan baku BSA yang digunakan. Nilai absorbansi tersebut terpapar dalam Tabel 4.
Tabel 4. Nilai absorbansi larutan baku BSA yang digunakan untuk membuat kurva baku
Tabung Volume BSA Kadar BSA %T Absorbansi
(ml) (mg/l) 1 0 0,0000 100,0 0,0000 2 10 0,1000 83,8 0,0768 3 20 0,2000 71,0 0,1487 4 30 0,3000 60,0 0,2218 5 50 0,5000 48,0 0,3188 6 100 1,0000 16,2 0,7905
Berdasarkan pengukuran absorbansi di atas, diperoleh persamaan kurva baku (Gambar 7)
44 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Kadar BSA A b so rb an si Y = 0,7772 X - 0,0126
Gambar 7. Kurva baku yang diperoleh untuk menghitung kadar protein di dalam contoh ekstrak
Kadar protein dihitung dengan menggunakan persamaan di atas. Nilai absorbansi (Y) yang diperoleh dari larutan ekstrak protein diplotkan ke persamaan kurva baku tersebut. Kadar protein (X) ekstrak organ hati bebek yang diperoleh dari penelitian adalah 0,4310 mg/ml dan kadar protein dari ekstrak organ hati ayam adalah 0,3946 mg/ml.
Matriks AFB1
Isolasi PAB1 dilakukan menggunakan teknik khromatografi afinitas yang digunakan oleh Wibawan et al. (1992) dan Losonczy et al. (2000). Matriks yang sudah diaktifkan dengan bromsian (cyanogen bromide-CNBr) dijaga pH agar tetap dalam kisaran 11-15 karena bromsian akan bereaksi dengan grup –OH yang ada di matriks dalam keadaan pH basa untuk membentuk ester sianat atau imidokarbonat. Senyawa ester sianat sangat reaktif sehingga dapat segera berikatan dengan grup amin yang disentuhkan dengannya (Gambar 8). Oleh karena itu, ketika matriks aktif ini diinkubasi dengan AFB1 murni (20 ppb dalam DMSO, SIGMA) selama 24 jam pada suhu empat derajat Celcius di dalam gelas ukur, maka di atas matriks
45
akan terbentuk ligand ester sianat-AFB1. Selanjutnya, matriks dibasuh dengan larutan bufer tetraborat 0,05 M. Dengan demikian, matriks untuk menangkap PAB1 telah siap digunakan.
Protein yang berikatan dengan AFB1 Murni (PAB1)
Ekstrak protein yang sudah diperoleh dialirkan ke matriks kolom afinitas untuk menangkap protein-protein yang memiliki kemampuan berikatan dengan AFB1. Protein yang dilewatkan tersebut akan berikatan dengan ligand ester sianat-AFB1 yang ada di permukaan matriks. Setelah dilakukan elusi, maka protein yang dilepaskan dan ditampung dipastikan adalah protein yang pasti memiliki sifat mampu berikatan dengan AFB1 (AFB1-binding protein, PAB1). Kandungan PAB1 dari masing-masing organ hati adalah 0,2887 mg/ml pada organ hati bebek dan 0,2699 mg/ml pada organ hati ayam. Kadar protein dalam eluat yang dilepaskan dari matriks terdeteksi lebih rendah dibandingkan kadar protein yang ada di dalam ekstrak hati. Hasil ini mencerminkan bahwa tidak keseluruhan protein yang ada di dalam ekstrak hati berikatan dengan AFB1. Seleksi yang dilakukan dengan
NITROSE LULOSA OH OH OH -NaOH O* OH CNBr O OH C N NITROSE LULOSA OH OH OH -NaOH O* OH CNBr O OH C N
Gambar 8. Bagan pengaktifan nitroselulosa dengan menggunakan bromsian (CNBr) menjadi matriks penangkapan AFB1
46
menggunakan matriks menghasilkan hanya sebagian saja yang dapat berikatan dengan AFB1.
PAB1 dapat dideteksi dengan teknik elektroforesis. Protein yang tampil dalam jel elektroforesis diyakini sebagai PAB1 karena protein ini diisolasi dengan menggunakan AFB1 murni yang diaktifkan pada matriks CNBr. Penggunaan AFB1 murni dimaksudkan untuk memperkecil peluang tertangkapnya protein yang bukan menjadi sasaran AFB1. Dari hasil tersebut juga diperoleh data bahwa PAB1 dari hati bebek dan ayam memiliki berat molekul kira-kira 66 kDa. Ada satu protein dari ekstrak hati ayam yang memiliki bobot molekul kecil yakni di bawah 29 kDa (Gambar 9). Hal ini menunjukan bahwa fraksi penyusun PAB1 ayam berbeda dengan PAB1 bebek. Yang menarik adalah keduanya memiliki fraksi dengan bobot molekul 66 kDa. Dilihat dari besaran bobot molekulnya, fraksi ini diyakini mampu merangsang terbentuknya antibodi. Sampai saat penelitian ini dilakukan belum diperoleh informasi lain mengenai pemurnian protein yang berinteraksi dengan AFB1. Hanya, Hao et al. (1999) mendapatkan tiga protein dari ekstrak hati sapi yang berinteraksi dengan okharatoksin A dengan bobot molekul pada kisaran 32-85 kDa. Demikian juga dengan Haskard et al. (2001) yang mendapati adanya protein dinding sel bakteri asam laktat dengan bobot molekul 55 kDa yang mampu berikatan dengan AFB1.
47
Jarak pita protein penanda yang cukup jauh, yakni 66-97 kDa, memunculkan beberapa pemikiran bahwa bisa saja protein pada ekstrak hati ayam dan bebek tidak hanya satu, tetapi ada beberapa protein di sana. Atau, berat molekul yang diperoleh kemungkinan tidak tepat pada angka 66 kDa. Tetapi bisa saja dalam kisaran tersebut. Belum diperoleh informasi mengenai jenis protein yang memiliki bobot molekul pada kisaran 66 kDa. Hao et al. (1999) mendapatkan identitas protein yang memiliki bobot molekul 55 kDa adalah aldehida dehidrogenase klas 2 (ALDH2) dari mitokondra sapi. Dari data Anonim (2006) diperoleh data bahwa bobot molekul albumin serum dan ovalbumin masing-masing 66,2 dan 45 kDa.
29 kDa 45 kDa 66 kDa 97 kDa 116 kDa 215 kDa A B 29 kDa 45 kDa 66 kDa 97 kDa 116 kDa 215 kDa A B
Gambar 9. Pita protein PAB1 hati ayam (A) dan bebek (B) yang dimurnikan dengan teknik kromatografi afinitas
48
Antibodi Poliklonal PAB1
Eluat PAB1 yang telah dimurnikan, didialisis dan dipekatkan kadarnya untuk mendapatkan reaksi yang lebih jelas pada uji imunodifusi. Seluruh hewan coba kelinci disuntik dengan PAB1 melalui v. auricularis karena penyuntikan melalui jalur ini akan menghindari adanya tekanan balik dari pembuluh darah. Keuntungan penyuntikan PAB1 secara intravena menyebabkan antigen langsung menuju organ-organ parenkhim selanjutnya merangsang pembentukan antibodi. Seluruh hewan coba kelinci disuntik dengan PAB1 bertahan hidup sampai akhir periode pemeliharaan tanpa memperlihatkan adanya gangguan klinis. Larutan PAB1 yang disuntikkan memiliki sifat antigenik karena mampu menggertak produksi antibodi poliklonal anti PAB1 (APAB1) yang dideteksi dalam uji imunodifusi. Adanya antibodi yang homolog diperlihatkan oleh adanya garis presipitasi yang terletak diantara lubang yang berisi serum dengan lubang yang dan antigen (Gambar 10).
Perkembangan pembentukan antibodi terus diamati hingga diperoleh titer APAB1 yang cukup tinggi. Penyuntikan ulang (booster) dilakukan untuk meningkatkan kadar APAB1 yang akan dihasilkan. Pengukuran titer dilakukan setiap 5 hari setelah penyuntikan sehingga dapat dipantau peningkatan titer APAB1 yang dihasilkan. Antibodi kelinci terhadap PAB1 ayam telah dapat dideteksi pada
RAB1 Ab Ab Ab Ab Ab Serum (-) Serum (-) RAB1 Ab Ab Ab Ab Ab
A B
RAB1 Ab Ab Ab Ab Ab Serum (-) Serum (-) RAB1 Ab Ab Ab Ab AbA B
RAB1 Ab Ab Ab Ab Ab Serum (-) Serum (-) RAB1 Ab Ab Ab Ab AbA B
Gambar 10. Hasil reaksi positif uji presipitasi yang diwujudkan dalam bentuk garis presipitasi (tanda panah) antara antibodi poliklonal APAB1 (lubang pinggir) dan antigen PAB1 (lubang tengah) dari protein hati bebek (a) dan ayam (b)
49
minggu ke-3 periode penyuntikan dengan titer yang lebih tinggi. Sedangkan antibodi kelinci terhadap PAB1 bebek baru terdeteksi pada minggu ke-4. Panen serum untuk kedua preparat (PAB1 ayam dan bebek) dilakukan pada minggu ke-5 (Gambar 11). Antibodi terhadap PAB1 ayam dan bebek dapat dideteksi pada beberapa serum kelinci yang digunakan.
Adanya reaksi silang antara APAB1 bebek dan ayam diketahui dari hasil uji imunodifusi. Hasil uji tersebut diperoleh data bahwa APAB1 bebek berikatan secara homolog dengan PAB1 ayam. Demikian juga sebaliknya. Hasil pemeriksaan keduanya terpapar dalam Gambar 12 (a dan b) di bawah ini. Laporan ilmiah yang sejenis belum dapat diperoleh sampai saat ini.
Antibodi poliklonal APAB1 yang dihasilkan pada tahap ini selanjutnya akan digunakan pada uji imunohistokimiawi untuk direaksikan dengan PAB1 yang ada di sel hati. Reaksi mempertemukan antigen-antibodi melalui uji ini diyakini dapat memberikan hasil yang sama karena sifat homolog dari dua kelompok antibodi APAB1 yang dibuktikan dengan AGPT.
0 2 4 6 8 1 2 3 4 5 Minggu ke-T it e r A n ti b o d i Ayam Bebek
Gambar 11. Titer antibodi poliklonal APAB1 yang dihasilkan oleh kelinci yang disuntik dengan PAB1 dari hati ayam dan bebek melalui v. auricularis
50
Gambaran Histologik PAB1 di Preparat Jaringan Hati Sehat
Status kesehatan hati dilihat dari gambaran histologik hepatosit tersusun membentuk tuberkula-tuberkula dalam lobulus. Preparat jaringan hati terlebih dahulu diwarnai dengan pewarnaan HE sebelum memasuki tahapan uji imunohistokimiawi. Hasil pewarnaan HE dari jaringan hati ayam dan bebek memperlihatkan bahwa hepatosit tertata rapih membentuk lobulus-lobulus, gambaran sinusoid dan v. sentralis normal. Keadaan ini menunjukkan bahwa kedua organ tersebut dalam kondisi sehat (Gambar 13 dan 14). Uji imunohistokimiawi menggunakan jaringan hati yang sehat karena penelitian ini bertujuan untuk memperlihatkan keberadaan PAB1 di jaringan hati dalam kondisi fisiologis (in situ). Selain itu, keberadaan PAB1 yang utuh akan lebih mudah dikenali oleh APAB1.
Keberhasilan dari uji imunohistokimiawi yang dilakukan tergantung dari adanya ikatan antara PAB1 yang ada pada preparat jaringan hati di atas gelas obyek, APAB1 dan antibodi anti-kelinci. Setelah ketiga komponen ini berinteraksi sempurna, maka dengan memberikan label berupa enzim deaminobenzidin akan mempertegas interaksi ketiganya yang ditandai dengan munculnya endapan berwarna coklat-kehitaman. Lokasi endapan berwarna ini menandakan keberadaan PAB1 di jaringan hati (Gambar 15a-b). Dengan demikian, penyebaran
Ag Ab Ag Ab
(a) (b)
Gambar 12. Garis presipitasi (tanda panah) dari hasil uji silang antara PAB1 dari organ hati bebek dengan APAB1 yang digertak oleh PAB1dari organ hati ayam (a) dan PAB1dari organ hati ayam dengan APAB1 yang digertak oleh PAB1dari organ hati bebek (b)
Ab Ag
Ag Ab
51
PAB1 di jaringan hati dapat diketahui dengan baik. Warna endapan pada preparat hati bebek lebih coklat dibandingkan pada preparat hati ayam.
Dari data yang diperoleh bahwa populasi PAB1 pada organ hati bebek lebih padat dibandingkan dengan populasi protein yang ada di hati ayam (p<0,05). Perbedaan kepadatan PAB1 dapat dijadikan indikator untuk menerangkan perbedaan kerentanan ayam dan bebek terhadap AFB1. Kerentanan bebek terhadap keracunan AFB1 ternyata selaras dengan kepadatan PAB1 di jaringan hatinya. Sedangkan ayam yang kurang rentan terhadap AFB1 memiliki kepadatan PAB1 yang lebih rendah dibandingkan bebek..
h v h v h v h v
Gambar 13. Gambaran histologik ja-ringan hati ayam yang sehat (Pewar-naan: HE. Pembesaran obyektif: 10x)
Gambar 14. Gambaran histologik jaring-an hati bebek yjaring-ang sehat (Pewarnajaring-an: HE. Pembesaran obyektif: 10x)
Memperlihatkan hepatosit-hepatosit (h) yang tersusun rapih di sekitar vena sentralis (v)
52
Kepekaan bebek terhadap AFB1 dapat diterangkan lebih lanjut karena tidak hanya sebaran PAB1 di jaringan hati. Tetapi, PAB1 terdapat juga di endothelial pembuluh darah vena sentral jaringan hati (Gambar 16).
Adanya PAB1 di lokasi ini diduga karena peranannya untuk menangkap
(a) (b)
Gambar 15. Hasil pewarnaan imunohistokimiawi terhadap hati ayam (a) dan bebek (b). Endapan berwarna coklat-kehitaman (tanda panah) menandakan dilokasi tersebut terdapat PAB1. Pembesaran obyektif: 10x.
Gambar 16. Keberadaan PAB1 di dalam endothelial pembuluh darah vena sentralis (tanda pa-nah) dari hati bebek yang diwarnai dengan teknik imunohistokimiawi. Pembesaran obyektif: 20x.
53
AFB1 yang masuk melalui aliran darah vena sentral. Di dalam vena tersebut juga terlihat adanya endapan coklat-kehitaman yang memberikan indikasi bahwa di dalam pembuluh darah tersebut terdapat juga PAB1. Hasil tersebut menimbulkan dua kemungkinan. Yang pertama, endapan tersebut bukanlah PAB1. Melainkan adanya ikatan peroksidase yang ada di dalam darah dengan diaminobenzidin. Peroksidase yang terdapat di dalam darah adalah peroksidase bebas. Sedangkan peroksidase yang ada di dalam jaringan adalah peroksidase yang terikat pada antibodi sekunder anti kelinci. Yang kedua, endapan tersebut memanglah PAB1. Sabbioni et al. (1987) mendapati bahwa ikatan kovalen antara protein-AFB1 telah terjadi sejak di aliran darah, lumen usus dan dinding usus, sehingga tidak tertutup kemungkinan bahwa sebenarnya PAB1 tidak hanya berada di daerah jaringan hati, tetapi terdapat juga di plasma darah, lumen usus dan dinding usus.
Untuk melihat posisi protein PAB1, pengamatan mikroskopik diperjelas lagi dengan meningkatkan pembesaran lensa. Pada Gambar 17 terlihat jelas bahwa PAB1 tidak terletak di dalam hepatosit jaringan hati ayam maupun bebek, tetapi berada di dalam sinusoid. Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Hao et al. (1999) yang mendapatkan protein intraseluler terikat okhratoksin dari organ hati sapi. Diperlukan penelitian lebih mendalam untuk menelaah apakah perbedaan hasil ini dikarenakan toksin yang digunakan berbeda. Dari penelitian yang dilakukan oleh Ewaskiewicz et al. (1991) dijelaskan bahwa AFB1 dapat terikat dengan kuat pada mikrosom, sitosol, mitokondria dan inti (fraksi deoksiribonukleat).
54
Di daerah sinusoid terdapat beberapa sel non-parenkhim, diantaranya sel-sel endothelial, sel-sel Kupffer yang merupakan makrofag organ hati, pit cell dan
perisinusoidal stellate cells.. Sel Ito merupakan nama baru dari perisinusoidal stellate cells dan sel ini memiliki kandungan butiran lemak yang berlimpah. Sel
Ito berperan sebagai pusat metabolisme Vitamin A dan menerima karbon dioksida yang dikeluarkan oleh sel hati sehingga fungsi sel hati tidak mengalami gangguan. Fungsi utama sel Ito terlihat ketika sel-sel hati mengalami proses memperbaiki diri (Suematsu dan Aiso 2001). Bila melihat letaknya di daerah sinusoid, sel Ito kemungkinan melakukan kontak terlebih dahulu dengan AFB1 yang masuk melalui pembuluh darah. AFB1 bisa saja tertangkap oleh sel Ito karena sifat AFB1 yang lipofilik. Namun, masih belum diperoleh informasi mengenai proses yang terjadi di dalam sel Ito seandainya AFB1 terperangkap di sel tersebut. Informasi ilmiah mengenai keberadaan sistem enzim sitokrom P-450 di sel Ito belum diperoleh. Bila kemampuan sel Ito untuk menangkap AFB1 sudah mencapai batas kemampuan maksimum, maka ada AFB1 yang tidak tertangkap dan masuk ke dalam sel-sel hati. AFB1 yang sudah masuk ke dalam sel hati akan mengalami proses biotransformasi yang normal hingga terbentuknya AFB1-8,9-epoksida. Kecepatan reaksi yang diakibatkan oleh radikal epoksida dapat lebih cepat
(a) (b)
Gambar 17. Posisi protein yang berikatan dengan AFB1 pada sel hati ayam (a) dan bebek (b). Lokasi protein (tanda panah) berada di daerah sinusoid. Sedangkan hepatosit tidak terwarnai (h) (Pembesaran obyektif: 100x)
h
55
dibandingkan kemampuan sel Ito untuk memperbaiki sel-sel hati. Dengan demikian, akan terbentuk suatu proses kerusakan sel-sel hati baik berupa kanker hati maupun sirosis hati.
AFB1 telah diketahui berikatan dengan protein-protein plasma melalui ikatan kovalen (Chu 1994). Jumlah AFB1 yang berikatan dengan protein plasma akan meningkat lima kali lebih banyak dengan adanya mikrosoma (Yatim dan Sachan 2001). Plasma darah mengandung 7-8% protein dan albumin merupakan protein plasma yang paling banyak (50-60%). Oleh karena itu, sudah dipastikan bahwa di dalam darah AFB1 akan berikatan lebih dominan dengan albumin (Dirr dan Schabort 1986). Dari hasil penelitian ini diduga PAB1 memiliki peranan yang sama dengan albumin serum. Bila demikian, maka peranan PAB1 dan albumin sangat penting karena keduanya berperan sebagai pembawa AFB1 di dalam darah. AFB1 sebagai materi xenobiotik masuk ke organ hati melalui sirkulasi vaskular perifer (Wilson et al. 1985). Setelah melalui proses epoksidasi, akan dihasilkan AFB1-8,9-epoksida yang tetap berikatan dengan protein. Walaupun bentuk radikal epoksida ini akan segera berubah menjadi AFB1 dihidrodiol, mereka akan tetap berikatan dengan protein. AFB2a juga diketahui tetap berikatan dengan protein selama mengalami bioaktivasi (Sabbioni et al. 1987). Dengan demikian dapat diduga bahwa PAB1 memiliki peran yang penting dalam pemunculan efek toksik AFB1.
Di sisi lain ada pemikiran bahwa pengikatan AFB1 dengan albumin sebenarnya merupakan upaya untuk melindungi hati (Hsieh dan Wong 1994). Keberadaan AFB1 di dalam plasma protein dapat dipertahankan oleh karnitin (carnitine) sehingga AFB1 bebas yang akan ditangkap dan dimetabolisir oleh sel-sel hati menjadi sedikit. Karnitin dapat meningkatkan kualitas ikatan kovalen antara AFB1 dan protein-protein seluler sehingga memperkecil peluang untuk berikatan dengan DNA (Yatim dan Sachan 2001).
Dari hasil yang diperoleh, muncul pemikiran bahwa proses biotransformasi AFB1 di dalam sel hati dapat dimodifikasi seandainya reaksi PAB1 dan APAB1 dapat dibentuk lebih dahulu di dalam organ hati. Modifikasi proses tersebut
56
bertujuan untuk mencegah ikatan AFB1 dengan DNA dan protein dengan meminimalkan masuknya ke dalam sel hati, atau mempercepat proses biotransformasi AFB1.
57
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Dari ekstraksi hati bebek dan ayam telah diperoleh protein ekstrak. Kandungan protein dalam ektraks kasar ini sebanyak 0,4310 mg/ml dari ekstrak hati bebek dan 0,3946 mg/ml dari ekstrak hati ayam. Setelah diisolasi menggunakan AFB1 yang terikat di matriks, diperoleh larutan protein (PAB1) dengan kandungan 0,2887 mg/ml pada hati bebek dan 0,2699 mg/ml. Terdapat satu jenis PAB1 dari hati bebek dengan bobot molekul 66 kDa. Sedangkan pada hati ayam terdapat dua PAB1 dengan bobot molekul 66 kDa dan dibawah 29 kDa. PAB1 terdapat di daerah sinusoid jaringan hati bebek dan ayam. Penyebaran PAB1 lebih banyak di hati bebek dibandingkan sel-sel hati ayam. Penyebaran yang lebih banyak di hati bebek diduga merupakan salah satu faktor kerentanan ternak bebek terhadap keracunan aflatoksin.
Saran
Untuk melengkapi hasil penelitian yang sudah dilakukan, ada beberapa hal yang perlu dipelajari, yaitu seperti (i) keberadaan PAB1 yang terdapat juga di plasma darah, lumen usus dan dinding usus; (ii) perbedaan populasi dan penyebaran PAB1 di organ hati hewan lain dan manusia karena mereka juga dapat mengalami aflatoksikosis dengan tingkat kerentanan yang berbeda; (iii) penggunaan pengebalan pasif dengan pemberian APAB1 dapat diaplikasikan melalui mulut (oral), atau penyuntikan, (iv) melakukan sequencing asam-asam amino pada protein APAB1; dan (v) eksplorasi bahan lain yang memiliki mekanisme serupa APAB1 sehingga dapat menggantikan peranan APAB1 dalam pencegahan aflatoksikosis.
58
DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Malik, AY, Hasan, HAH, Bagy, MMK. 1995. Efficacy of hydrocarbons against soybean seed-borne fungi and aflatoxin production. Seed Sci Technol 23(1): 183-192.
Abdelsalam, EB, El-Tayeb, AE, Nor Eldin, AA, Abdulmagid, AM. 1989. Aflatoxicosis in fattening sheep. Vet Rec 124: 487-488.
Agnes, VF, Akbarsha, MA. 2001. Pale vacuolated epithelial cells in epididymis of aflatoxin-treated mice. Reproduction 122: 629-641.
Amad, M, Dharmaputra, OS. 1996. Pengaruh lada hitam terhadap populasi cendawan dan perkecambahan pada benih jagung selama penyimpanan. Makalah Seminar Nasional Mikrobiologi dan Pertemuan Ilmiah Tahunan PERMI. Malang, 12-13 November 1996.
Anonim. 2000. Biological control of aflatoxin contamination in groundnut. http://www.aflatoxin.info/biocontrol.asp. [10 Agustus 2005]
______. 2006. Biochemistry: Experimental Techniques Molecular Weight Determination.
http://www.rit.edu/~pac8612/Biochemistry/505(705)/molecular_weight_de termination.html [16 Februari 2006]
Ansher, SS, Dolan, P, Bueding, E. 1986. Biochemical effects of diothiolthiones.
Food. Chem. Toxicol 24: 405-415.
Azzam, AH, Gabal, MA. 1998. Aflatoxin and immunity in layer hens. Avian Pathol 27: 570-577.
Association of Official Analytical Chemists. 1990. Official methods of analysis. 15th ed. AOAC. Virginia.
Baertschi, SW, Roney, KD, Stone, MP, Haris, TM. 1988. Preparation of the 8,9-epoxide of the mycotoxin aflatoxin b1: the ultimate carcinogenic species. J Am Chem Soc 110: 7929-7931.
Bahri, S, Ohim, Maryam, R. 1994. Residu aflatoksin M1 pada air susu sapi dan hubungannya dengan keberadaan aflatoksin B1 pada pakan sapi. Dalam Kumpulan Makalah Lengkap Kongres Nasional Perhimpunan Mikologi Kedokteran Manusia dan Hewan Indonesia I dan Temu Ilmiah. Bogor, 21-24 Juli 1994. p. 269-275.
Bahri, S. 1998. Aflatoxin problems in poultry feed and its raw materials in indonesia. Media Veteriner 5(2): 7-14.
59
_______. 2001. Mewaspadai cemaran mikotoksin pada bahan pangan, pakan dan produk peternakan di Indonesia. Jurnal Litbang Pertanian 20(2): 55-64. Bahri, S, Maryam, R, Widiastuti, R. 2004. Tinjauan efek mikotoksin terhadap
performan unggas. J Mikol Kedok Indon 5(1-2): 53-64.
Bahri, S, Maryam, R, Widiastuti, R. 2005. Cemaran aflatoksin pada nahan pakan dan pakan di beberapa daerah Provinsi Lampung dan Provinsi Jawa Timur.
Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 10(3) (siap cetak)
Bahri, S, Widiastuti, R, Mustikaningsih, Y. 2005. Efek aflatoksin B1 pada embrio ayam. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner, 10(2) (siap cetak)
Bammler, TK, Slone, DH, Eaton, DL.. 2000. Effects of Dietary Oltipraz and Ethoxyquin on Aflatoxin B1 Biotransformation in Non-Human Primates.
Toxicol Sci 54: 30-41.
Bankole, SA, Adebanjo, A. 2003.
Mycotoxins in food in West Africa:
current situation and possibilities of controlling it.
African J Biotech2(9): 254-263.
Bastianello, SS, Nesbit, JW, Williams, MC, Lange, AL. 1987. Pathological findings in a natural outbreak of aflatoxicoses in dogs. Onderstepoort J Vet Res 54: 635-640.
Bata, A, Lasztity, R. 1999. Detoxification of mycotoxin-contaminated food and feed by microorganisme. Trends in Food and Technology, 10(6-7): 223-228.
Begue, JM, Baffet, G, Campion, JP, Guillouzo, A. 1988. Potential response of primary cultures of human and rat hepatocytes to aflatoxin B1-induced cytotoxicity and protection by the hepatoprotective agent (+)-cyanidanol-3.
Biol Cell 63(3): 327-333.
Bennett, JW, Klich, M. 2003. Mycotoxins. Clin Microbiol Rev 16(3): 497-516. Bhat, RV. 1991. Aflatoxin: Successes and failures of three decades of research. In.
Champ et al. (eds.) Fungi and Mycotoxins in Stored Products. Proceedings of an International Conference held at Bangkok, Thailand. 23-26 April 1991. p. 80-95.
Bhatnagar, D, McCormick, SP, Lee, LS, Hill, RA. 1987. Identificatiion of
O-methylsterigmatocystin as an aflatoxin B1 and G1 precursor in Aspergillus parasiticus. Appl Environ Microbiol 53: 1028-1033.
60
Bhatnagar, D, Cleveland, TE, Lillehoj, EB. 1989. Enzynes in late stages of aflatoxin b1 biosynthesis: strategies for identifying pertinent genes.
Mycopathologia 107: 75-83.
Bhattacharaya, RK, Prabhu, AL, Aboobaker, VS. 1989. In vivo effect of dietary factors n the molecular action of aflatoxin B1: Role of vitamin A on the catalytic activity of liver fraction. Cancer Lett 44: 83-88.
Bintvihok, A, Thiengnin, S, Doi, K, Kumagai, S. 2002. Residues of aflatoxin in the liver, muscle and eggs of domestic fowls. J Vet Med Sci 64(11): 1037-1039.
Bommakanti, AS, Waliyar, F. 2005. Importance of aflatoxins in human and livestock health. http://www.aflatoxin.info/health.asp