BAHAN DAN METODE
TAHAP 4 Pengamatan Morfologi :
4. Evaluasi Keragaman Genetik
Tunas in vitro hasil perkecambahan embrio somatik kemudian disubkultur setiap empat minggu ke media MW (Husni et al. 2010) tanpa zat pengatur tumbuh sampai empat kali subkultur untuk pendewasaan tunas. Evaluasi keragaman
genetik dilakukan dengan karakterisasi secara morfologi dan secara molekuler dengan penanda ISSR.
a. Karakterisasi morfologi Pengamatan dilakukan terhadap :
Tinggi tunas (cm), pengukuran menggunakan mistar dari pangkal batang hingga pucuk
Jumlah daun, penghitungan berdasarkan jumlah daun yang telah terbuka penuh
Jumlah cabang
Jumlah akar
Bentuk, warna dan tepi daun
Pengamatan terhadap bentuk, warna dan tepi daun dilakukan berdasarkan deskripsi yang dikeluarkan oleh IPGRI (1999).
Analisis stomata
Sampel yang digunakan adalah daun yang berasal dari planlet yang telah tumbuh sempurna. Pengamatan stomata dilakukan pada irisan paradermal. Metode analisis stomata menggunakan sediaan preparat segar (Mulyono 2011). Sampel daun dipotong dengan ukuran 0.2 x 0.2 cm, kemudian bagian bawah daun ditempelkan pada selotip yang panjangnya + 2 cm. Daun dikupas secara perlahan dengan menggunakan pisau silet dan sedikit air, sampai terbentuk lapisan tipis dan terlihat transparan. Lapisan tipis yang tertinggal pada selotip merupakan lapisan epidermis daun. Kemudian selotip tersebut diletakkan di atas gelas preparat dan ditutup dengan gelas penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop pada perbesaran 400 kali. Luas bidang pandang mikroskop pada perbesaran 400 kali adalah 0.19625 mm2. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah stomata dan ukuran stomata. Pengamatan jumlah stomata pada setiap daun dilakukan pada 3 bidang pandang yang berbeda. Jumlah stomata setiap perlakuan merupakan rata-rata jumlah stomata dari 3 daun. Ukuran stomata setiap perlakuan merupakan rata-rata ukuran stomata dari 3 daun. Tiap daun diukur 5 stomata secara acak.
b. Analisis Molekuler dengan Penanda ISSR
Sampel daun diambil dari planlet hasil karakterisasi morfologi. Tahapan analisis ISSR : isolasi DNA dengan menggunakan metode Doyle dan Doyle (1990); uji kualitas DNA berdasarkan metode Sambrook et al. (1989) serta optimasi program PCR dan amplifikasi DNA berdasarkan penelitian Martasari et al. (2012). Primer ISSR yang digunakan berasal dari penelitian sebelumnya oleh Husni (2010), sebanyak delapan primer yaitu ISSR-1 sampai ISSR-8 (Tabel 1).
Tabel 1 Susunan basa delapan primer ISSR yang digunakan
No Nama Primer Susunan Basa
1 ISSR-1 5’-CAACACACACACACACA-3’ 2 ISSR-2 5’-ACACACACACACACACCA-3’ 3 ISSR-3 5’-ACACACACACACACACTG-3’ 4 ISSR-4 5’-TAATCCTCCTCCTCCTCC-3’ 5 ISSR-5 5’-TCCTCCTCCTCCTCCGC-3’ 6 ISSR-6 5’-CGTTCCTCCTCCTCCTCC-3’ 7 ISSR-7 5’-GTGTGTGTGTGTGTGTTC-3’ 8 ISSR-8 5’-AGAGAGAGAGAGAGAGTC-3’
Isolasi DNA Total
Isolasi DNAdilakukan dengan metode CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Daun sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam mortar yang berisi nitrogen cair, kemudian digerus sampai hancur. Buffer ekstraksi CTAB sebanyak + 700 µ l ditambahkan ke dalam mortar dan digerus hingga merata. Sampel dipindahkan ke dalam 1.5 ml microtube menggunakan pipet, kemudian microtube direndam dalam waterbath bersuhu 650C selama 30 menit. Sampel selanjutnya diinkubasi di suhu ruang selama 10 menit. Sampel kemudian ditambah CIA (Chloroform :
Isoamylalcohol 24:1) sebanyak + 700 µl dan dibolak-balik secara perlahan hingga tercampur merata. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 40C selama 10 – 15 menit. Larutan DNA yang berwarna bening di bagian atas akan memisah dari larutan chloroform yang tercampur dengan bagian sel yang lainnya (berwarna hijau). Fase atas tersebut (+ 500 – 650 µl) dipindahkan ke
microtube baru. Isopropanol dingin sebanyak 1x volume sampel ditambahkan ke dalam microtube dan dibolak-balik secara perlahan. Sampel kemudian diinkubasi di suhu ruang selama 10 menit, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 40C selama 10 – 15 menit. Fase atas dibuang, dan endapan DNA di dasar microtube dicuci dengan 70% ethanol. Endapan DNA dikeringanginkan di suhu ruang selama 15 – 20 menit, kemudian dilarutkan dengan 50 – 100 µ l air bebas ion untuk dijadikan stok DNA dan disimpan pada suhu -200C.
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan menggunakan larutan agarose 0.8% dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1X yang dialirkan arus listrik dari muatan negatif ke muatan positif selama 50 menit pada voltase 50 volt. Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Reaksi amplifikasi PCR dilakukan menggunakan 25 µ l yang terdiri dari 1 µ l DNA, 2 µ l primer (40 µM), 1 µ l dNTP (10 mM), 0.2 µ l DNA Taq polymerase (5 unit/µl), 3 µl buffer PCR, 1.5 µl MgCl2 (25 mM) dan 16.3 µl air bebas ion.
Denaturasi awal dilakukan pada suhu 940C selama 3 menit. Tahapan PCR
meliputi 35 siklus, yaitu denaturasi awal pada suhu 940C selama 54 detik,
annealing pada suhu 430C selama 45 detik dan ekstensi pada suhu 720C selama 2 menit. Siklus PCR diakhiri dengan satu siklus ekstensi akhir pada suhu 720C selama 5 menit (Martasari et al. 2012).
Visualisasi Hasil PCR
Elektroforesis dilakukan untuk mengetahui hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR, dilakukan melalui elektroforesis horizontal dengan 1.8% agarose yang dilarutkan dalam 100 ml buffer TAE 1X, pada tegangan 57 voltase selama 3 jam. Selanjutnya gel direndam dalam 0.5 µg/ml EtBr dalam ruang gelap
selama 15 menit dan dibilas dalam H2O selama 10 menit. Visualisasi dilakukan di atas lampu UV dengan menggunakan alat BiodocAnalyze.
c. Analisis Data Hasil Evaluasi Keragaman Genetik
Data hasil pengamatan morfologi dan molekuler dianalisis dengan menggunakan program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versi 2.02 (Rohlf 1998).
Karakter morfologi yang diamati, diasumsikan setara dengan jenis primer pada penanda molekuler, sedangkan sub karakter setara dengan lokus pita pada penanda molekuler. Data karakter morfologi tersebut diubah menjadi data biner dengan skoring data. Apabila karakter morfologi tidak dimiliki oleh regeneran maka diberikan nilai skor 0, sedangkan nilai skor 1 diberikan apabila regeneran memiliki karakter yang diamati.
Pengamatan pada analisis molekuler (penanda ISSR) dilakukan terhadap pola pita hasil elektroforesis. Pengamatan ditujukan pada pola pita dengan jarak migrasi yang sama. Apabila pada jarak migrasi yang sama tidak terdapat pita, maka diberikan nilai skor 0. Sebaliknya apabila pada jarak migrasi tersebut terdapat pita, maka diberikan nilai skor 1.
Koefisien kemiripan berdasarkan penanda morfologi, molekuler dan data gabungan dianalisis berdasarkan SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data) pada program NTSYSpc versi 2.02. Tingkat kemiripan dihitung menggunakan koefisien Dice. Analisis pengelompokan digunakan SAHN (Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested) – UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Average), disajikan dalam bentuk dendogram.