4.2 Kultivasi C.acetobutylicum B-527 dan C.beijerinckii B-597 dengan Prosedur
4.2.2 Evaluasi Prosedur Awal
Evaluasi prosedur kultivasi dilakukan untuk memprediksi letak kegagalan prosedur awal. Evaluasi prosedur awal diarahkan untuk menentukan titik masuknya mikroorganisme kontaminan serta menganalisis kemungkinan prosedur pengerjaan yang kurang tepat. Evaluasi prosedur awal yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 4.6.
54 B1.1314.B.1 Sterilisasi menggunakan
autoklaf Sterilisasi menggunakan
autoklaf
Pembagian medium ke dalam botol serum steril @50 ml menggunakan syringe dalam biosafety cabinet
Pembagian medium ke dalam botol serum steril @50 ml menggunakan syringe dalam biosafety cabinet
Purging medium dengan nitrogen non-high purity dengan jarum syringe
5 ml selama 3 menit
Purging medium dengan nitrogen non-high purity dengan jarum syringe
5 ml selama 3 menit
Oksigen dalam medium dikeluarkan dengan jarum syringe 1 ml selama
purging berlangsung
Oksigen dalam medium dikeluarkan dengan jarum syringe 1 ml selama
purging berlangsung
Nitrogen untuk purging disaring menggunakan saringan kapas dan
filter 45µm
Nitrogen untuk purging disaring menggunakan saringan kapas dan
filter 45µm
Sterilisasi anaerobik chamber menggunakan etanol 70%
Sterilisasi anaerobik chamber menggunakan etanol 70%
Pengaliran nitrogen ke dalam anaerobik chamber yang telah disaring dengan saringan kapas steril
Pengaliran nitrogen ke dalam anaerobik chamber yang telah disaring dengan saringan kapas steril
Inokulasi liofilisasi dengan memasukkan 1 ml cairan ke dalam
tabung liofilisasi kemudian memasukannya ke dalam medium 50
ml medium menggunakan syringe
Inokulasi liofilisasi dengan memasukkan 1 ml cairan ke dalam
tabung liofilisasi kemudian memasukannya ke dalam medium 50
ml medium menggunakan syringe
Penutupan botol serum berisi medium menggunakan karet butil dan
crimper
Penutupan botol serum berisi medium menggunakan karet butil dan
crimper
Inkubasi kultur starter dalam inkubator bersuhu 37oC selama 15-
20 jam
Inkubasi kultur starter dalam inkubator bersuhu 37oC selama 15-
20 jam
Pemindahan 50 ml kultur ke dalam 500 ml medium fermentasi (CRM) di
dalam anerobik chamber menggunakan syringe
Pemindahan 50 ml kultur ke dalam 500 ml medium fermentasi (CRM) di
dalam anerobik chamber menggunakan syringe
Inkubasi kultur dalam inkubator bersuhi 37oC selama ±3 hari
Inkubasi kultur dalam inkubator bersuhi 37oC selama ±3 hari
Pengambilan sampel di udara terbuka menggunakan syringe yang jarumnya telah dibakar. Sampel diambil dengan menjungkir balikkan botol kultur.
Pengambilan sampel dilakukan di dekat api bunsen
Pengambilan sampel di udara terbuka menggunakan syringe yang jarumnya telah dibakar. Sampel diambil dengan menjungkir balikkan botol kultur.
Pengambilan sampel dilakukan di dekat api bunsen
Pembersihan tutup butyl rubber menggunakan alkohol dan pembakaran jarum syringe 5 ml untuk preparasi pengambilan sampel
Pembersihan tutup butyl rubber menggunakan alkohol dan pembakaran jarum syringe 5 ml untuk preparasi pengambilan sampel
Pelepasan CO2 di dalam medium
dilakukan secara berkala tanpa menginjeksikan nitrogen kembali
Pelepasan CO2 di dalam medium
dilakukan secara berkala tanpa menginjeksikan nitrogen kembali
Glukosa non-glukosaKomponen
Medium DLB dan RCM @ 1 L
Purging medium dengan nitrogen non-high purity menggunakan jarum
syringe 5 ml selama 3 menit
Purging medium dengan nitrogen non-high purity menggunakan jarum
syringe 5 ml selama 3 menit
KETERANGAN
Titik kemungkinan kontaminasi masuk Kemungkinan prosedur yang kurang tepat
Gambar 4.6 Evaluasi prosedur awal
Berdasarkan Gambar 4.6, titik-titik yang diduga merupakan tempat masuknya mikroorganisme kontaminan dan kemungkinan prosedur yang kurang tepat dipaparkan sebagai berikut:
1. Medium glukosa dan non-glukosa pada prosedur awal disterilisasi secara
terpisah untuk menghindari reaksi karamelisasi antara glukosa dengan komponen bernitrogen. Akan tetapi, proses pencampuran kedua medium
B1.1314.B.1 55 dilakukan dengan membuka tutup medium steril sehingga memungkinkan masuknya mikroorganisme kontaminan. Meski pencampuran medium glukosa
dan non-glukosa dilakukan dalam biosafety ca binet yang telah disterilisasi,
kontaminasi masih dapat terjadi apabila ternyata proses sterilisasi tidak efektif untuk membunuh kontaminan di dalam kabinet. Oleh karena itu, risiko kontaminasi ini perlu direduksi dengan mengautoklaf glukosa dan non-glukosa pada satu wadah. Alternatif pengerjaan ini dapat meminimalisir risiko kontaminasi dengan tidak membuka tutup medium yang sudah disterilisasi.
2. Prosedur kultivasi solventogenic clostridia dengan volume sebesar 30 mL dan
tahap penyiapan inokulum selama 15-20 jam kemungkinan besar belum tepat. Menurut Lemme dkk. (1985), bakteri liofilisasi baru dapat tumbuh dalam 24-48 jam pada kondisi kultivasi yang baik dan sesuai. Kemungkinan besar, waktu penyiapan inokulum yang digunakan pada prosedur awal tidak cukup untuk
mengaktifkan C. acetobutylicum B-527 dan C. beijerinckii B-597. Menurut Das
(2014), fasa lag dari kultur C.acetobutylicum berlangsung selama 18-20 jam.
Dengan demikian, diperkirakan pada jam ke 15-20, kultur C. acetobutylicum B- 527 dan C. beijerinckii B-597 masih berada dalam fasa lag.
Berdasarkan Talip (2010) dan Das (2014), diperkirakan solventogenic clostridia
mulai tumbuh pada jam ke-72 – 78 dari bentuk liofilisasi awalnya. Setelah
tumbuh, Clostridium mencapai fasa lag selama 18 – 20 jam. Dengan demikian,
waktu total untuk pengembangan inokulum dalam volume tertentu adalah
selama 90 – 96 jam atau sekitar 4 hari.
3. Volume inokulum yang digunakan pada prosedur awal adalah 30 mL dan
langsung diinokulasikan ke dalam medium fermentasi bervolume 300 mL. Padahal menurut Norris dan Ribbons (1972), volume kultivasi harus ditingkatkan secara bertahap untuk menjaga tingginya konsentrasi sel di dalam medium. Konsentrasi sel yang tinggi di dalam medium dapat mempersingkat
56 B1.1314.B.1 memiliki fasa lag lebih panjang dari bakteri aerobik. Fasa lag yang singkat dapat mengurangi kemungkinan dominasi medium oleh agen kontaminan.
4. Pada pengerjaan prosedur awal, tidak dilakukan pengecekan nilai optical density
(OD) pada akhir tahap penyiapan inokulum. Padahal menurut Talip (2010), proses fermentasi baru dapat dilakukan hanya apabila OD inokulum telah melebihi 0,7.
Berdasarkan analisis di atas, dirumuskanlah suatu formulasi metodologi baru yang akan
digunakan untuk menumbuhkan strain solventogenic clostridia lainnya. Prosedur
pengerjaan ini disebut sebagai prosedur generasi II seperti yang terlampir pada Gambar 4.7.
B1.1314.B.1 57
Pembuatan medium RCM
Pembuatan medium RCM
Pembagian 5 dan 9,5 ml medium ke dalam tabung reaksi bertutup serta 40 dan 50 ml medium ke dalam botol
serum bertutup
Pembagian 5 dan 9,5 ml medium ke dalam tabung reaksi bertutup serta 40 dan 50 ml medium ke dalam botol
serum bertutup
Sterilisasi medium menggunakan autoklaf pada T=121oC
Sterilisasi medium menggunakan autoklaf pada T=121oC
Inokulasi kultur C. butyricum dari kultur cair/agar ke medium bervolume 5 mL dengan jarum ose.
Penusukan dilakukan di dekat api sembari mengalirkan N2 atau CO2 ke
dalam medium
Inokulasi kultur C. butyricum dari kultur cair/agar ke medium bervolume 5 mL dengan jarum ose.
Penusukan dilakukan di dekat api sembari mengalirkan N2 atau CO2 ke
dalam medium
Purging medium 5 mL berisi kultur C. butyricum selama 1 menit
Purging medium 5 mL berisi kultur C. butyricum selama 1 menit
Inkubasi kultur pada inkubator bersuhu 37oC selama 4 hari
Inkubasi kultur pada inkubator bersuhu 37oC selama 4 hari
Purging gas N2 atau CO2 disaring
menggunakan saringan kapas selama ±1 menit
Purging gas N2 atau CO2 disaring
menggunakan saringan kapas selama ±1 menit
Pemindahan 0,5 ml kultur ke dalam 9,5 ml medium. Pemindahan dilakukan sembari mengalirkan gas N2
atau CO2 ke dalam kultur dan
medium
Pemindahan 0,5 ml kultur ke dalam 9,5 ml medium. Pemindahan dilakukan sembari mengalirkan gas N2
atau CO2 ke dalam kultur dan
medium
Purging medium berisi kultur C. butyricum selama 1 menit
Purging medium berisi kultur C. butyricum selama 1 menit
Inkubasi kultur pada inkubator bersuhu 37oC selama 4 hari
Inkubasi kultur pada inkubator bersuhu 37oC selama 4 hari
Pemindahan 10 ml kultur ke dalam 40 ml medium. Pemindahan dilakukan sembari mengalirkan gas N2 atau CO2
ke dalam kultur dan medium
Pemindahan 10 ml kultur ke dalam 40 ml medium. Pemindahan dilakukan sembari mengalirkan gas N2 atau CO2
ke dalam kultur dan medium
Pengecekan morfologi kultur di bawah mikroskop
Pengecekan morfologi kultur di bawah mikroskop
Purging medium berisi kultur C. butyricum selama 1 menit
Purging medium berisi kultur C. butyricum selama 1 menit
Glukosa Nutrien
Medium RCM 1 L
Pengecekan morfologi kultur di bawah mikroskop
Pengecekan morfologi kultur di bawah mikroskop
Inkubasi kultur pada inkubator bersuhu 37oC selama 4 hari
Inkubasi kultur pada inkubator bersuhu 37oC selama 4 hari
Pengecekan morfologi kultur di bawah mikroskop
Pengecekan morfologi kultur di bawah mikroskop 10 ml kultur
5 ml kultur
50 ml kultur
Gambar 4.7 Prosedur generasi II