H. Polymerase Chain Reaction (PCR)
6. Faktor-faktor yang Menentukan Keberhasilan PCR
Keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu : a. deoksiriboukleotida triphosphat (dNTP)
b. oligonukleotida primer c. DNA template (cetakan) d. Komposisi larutan buffer e. Jumlah siklus reaksi f. Enzim yang digunakan
g. Faktor teknis dan non teknis misalnya kontaminasi
Keunggulan metode PCR adalah kemampuannya dalam melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga dapat mencapai 109 kali lipat. Dengan demikian, kontaminasi fragmen DNA dalam jumlah sangat sedikit sekalipun dapat menyebabkan terjadinya kesalahan yaitu dengan didapatkannya produk amplifikasi yang tidak diinginkan. Kontaminasi tersebut dapat berasal dari beberapa sumber, antara lain dari
reaksi-reaksi PCR yang dilakukan sebelumnya. Oleh karena itu, dalam melakukan PCR perlu diperhatikan beberapa hal seperti berikut;
Deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP)
Larutan stok dNTP yang akan digunakan dalam PCR sebaiknya dinetralkan menjadi pH 7,0. Untuk menentukan konsentrasinya sebaiknya digunakan metode spektroskopi. Larutan stok tersebut kemudian perlu dituang dalam volume kecil (aliquot) dengan konsentrasi 1mM dan disimpan pada suhu -200C. konsentrasi masing-masing dNTP yang diperlukan dalam PCR berkisar antara 20 – 200 µM dan keempat dNTP yang digunakan sebaiknya mempunyai konsentrasi yang sama untuk memperkecil kemungkinan kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerisasi. Sebagai patokan, konsentrasi masing-masing dNTP sebesar 20 µM dalam 100 µM secara teoritis cukup menyintesis 2,6 µg atau 10 pmol DNA yang mempunyai panjang 400 bp (Gelfand dan White, 1990 dalam Yuwono, 2006)
Oligonukleotida primer
Konsentrasi primer yang optimal berkisar antara 0,1 – 0,5 µM (Gelfand dan White, 1989 dalam Yuwono, 2006) meskipun konsentrasi primer sampai 1,0 µM masih dapat menghasilkan produk yang sangat spesifik (Yuwono, 1991). Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0 µM dapat menyebabkan terakumulasinya hasil polimerisasi non spesifik.
Panjang oligonukleotida yang digunakan sebagai primer umumnya 18 –
29 nukleotida dan mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60%.
Sekuen oligonukleotida primer sebaiknya dicek apakah mempunyai kemungkinan membentuk hibrid antara primer yang satu dengan primer yang lain. Disamping itu, jika memungkinkan sebaiknya dihindari pula rancangan primer yang mempunyai nukleotida C atau G secara berurutan tiga atau lebih pada ujung 3’ karena hal ini dapat menyebabkan kesalahan peng-awal-an (mispriming) terutama pada daerah-daerah yang kaya akan sekuen G + C (Gelfand dan White, 1990 dalam Yuwono, 2006)
Urutan sekuen oligonukleotida primer dapat berupa urutan yang dapat berhibridisasi secara spesifik dengan suatu molekul DNA cetakan atau dapat bersifat universal. Primer universal adalah suatu primer yang komplementer dengan suatu sekuen nukleotida yang umum terdapat dalam banyak molekul DNA sehingga dapat berhibridisasi dengan bermacam-macam DNA cetakan. Sebagai contoh, gen yang mengkode RNA ribosom pada bakteri mengandung suatu urutan nukleotida yang terdapat pada semua bakteri. Dengan demikian, primer universal dapat dirancang sehingga bersifat komplementer dengan sekuen tersebut.
DNA Cetakan
DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul. DNA cetakan yang digunakan dapat berupa DNA yang sudah dimurnikan dengan sentrifugasi gradien CsCl maupun dengan menggunakan sel yang dicampur dengan komponen PCR yang lain. Pada
waktu suhu inkubasi PCR mencapai 950C, yang dimaksudkan untuk mendenaturasi DNA, sudah cukup untuk merusak sel yang memungkinkan oligonukleotida primer menempel pada DNA cetakan yang ada dalam sel. DNA yang digunakan sebagai cetakan dapat berupa rantai tunggal maupun rantai ganda. Efisiensi amplifikasi biasanya lebih tinggi jika menggunakan molekul DNA yang sudah dilinierkan dengan suatu enzim restriksi tertentu dari pada kalau menggunakan molekul DNA yang berbentuk sirkular (Sambrook , 1989 dalam Yuwono, 2006)
Larutan Buffer
Buffer yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 10 – 50 mM Tris-HCl, pH 8,3 – 8,8 (pada suhu 200C). untuk membantu proses penempelan primer (primer annealing), dapat juga ditambahkan KCl sampai konsentrasi 50 mM. di atas konsentrasi ini, KCl justru akan menghambat aktifitas Taq DNA polymerase. Di samping itu perlu juga ditambahkan 1,5mM MgCl2. Komponen lain yang perlu ditambahkan adalah gelatin atau BSA (bovine serum albumin) sebanyak 0,1 % (berat/volume) dan deterjen non ionik seperti Tween 20 sebanyak 0,05 – 0,1% untuk mempertahankan kestabilan enzim Taq DNA polymerase.
Siklus Reaksi
Pada umumnya PCR dilakukan dengan mengulangi siklus reaksi pelipatgandaan sebanyak 20 – 30 kali siklus. Akan tetapi, banyaknya siklus yang diperlukan tergantung terutama pada konsentrasi awal
molekul DNA target yang akan dilipatgandakan. Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.
Siklus PCR dilakukan dengan beberapa kondisi suhu yang berbeda. Pada akhir siklus biasanya dilakukan inkubasi tambahan pada suhu pemanjangan primer (biasanya pada suhu 720C jika digunakan Taq polymerase) selama 5 – 15 menit untuk menyempurnakan proses polimerisasi.
Enzim yang Digunakan
Beberapa macam enzim yang dapat digunakan untuk melakukan PCR antara lain Taq DNA Polimerase, Tth DNA Polimerase, Pwo DNA Polimerase, Pfu dan Tli DNA Polimerase. Secara umum konsentrasi enzim yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 2,5 unit/reaksi.
Sering penggunaan 1 unit enzim Taq polymerase sudah optimum untuk melakukan PCR dengan jumlah siklus reaksi 20 – 25 kali. Untuk siklus yang lebih banyak maka sebaiknya digunakan unit yang lebih besar pula, tetapi sebaiknya tidak melebihi 2,5 unit karena konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan menurunkan spesifitasnya.
Pemisahan Pekerjaan PCR dari Reaksi Lain
Jika memungkinkan, sebaiknya tempat untuk melakukan PCR dipisahkan dari tempat untuk melakukan manipulasi genetik yang lain.
Pekerjaan manipulasi genetik, misalnya ligasi dan analisis restriksi, merupakan sumber kontaminasi yang paling potensial karena akan melibatkan fragmen-fragmen DNA. Jika fragmen-fragmen DNA tersebut mengontaminasi tabung yang digunakan untuk melakukan PCR misalnya, hal ini dapat memberikan hasil positif palsu. Untuk menghindari hal ini sebaiknya PCR dilakukan di dalam ruangan khusus.
Penyimpanan Reagensia
Reagensia atau bahan kimia yang digunakan untuk PCR sebaiknya disiapkan tersendiri dan dituang di dalam tabung-tabung khusus. Volume reagensia yang disimpan dalam tabung-tabung tersebut diusahakan tidak terlalu besar sehingga kalau dibuang karena adanya kontaminasi tidak terlalu merugikan. Sebaiknya tabung-tabung yang berisi reagensia untuk PCR diberi nomor dan nomor tesebut dicatat pada waktu melakukan PCR.
Dengan demikian, kalau terjadi kontaminasi maka sumber kontaminasinya akan mudah ditelusuri kembali. Oligonukleotida yang digunakan untuk PCR sebaiknya disintesis di dalam tabung-tabung yang bebas dari fragmen-fragmen DNA yang lain.
Pipet
Pipet dan tip yang digunakan untuk mengambil reagensia adalah sumber kontaminasi yang rawan. Oleh karena itu, sebaiknya digunakan positive displacement pipettes yaitu suatu pipet yang menggunakan tip khusus. Tip khusus tersebut mempunyai plunger didalamnya yang digunakan sebagai penekan cairan yang akan dimasukkan ke dalam tabung dan sekaligus memisahkan cairan reagensia dari pipet mikro penyedotnya sendiri sehingga tidak ada kemungkinan cairan reagensia tersebut masuk ke dalam pipet mikro penyedotnya. Perlu diketahui bahwa pipet mikro penyedot yang digunakan untuk manipulasi genetik sering terkontaminasi oleh fragmen-fragmen DNA terutama pada bagian dinding sebelah dalamnya.
Kecermatan dalam Teknik Laboratorium
Faktor lain yang perlu diperhatikan dalam melakukan PCR adalah kecermatan atau ketelitian terutama dalam hal penangannan sampel.
Usaha untuk mencegah kontaminasi silang antar sampel dilakukan dengan selalu memakai sarung tangan dan gantilah sarung tangan tersebut jika sudah terkotori oleh komponen tertentu. Usaha lain yaitu mencegah cipratan komponen reaksi dari tabung saat dibuka atau ditutup.
Sebelum tabung yang berisi komponen reaksi dibuka, sebaiknya disentrifugasi secara cepat sehingga seluruh komponen ada di bagian bawah, sehingga tidak menciprat keluar saat dibuka.
Penggunaan control
Untuk mengecek ada tidaknya kontaminan di dalam komponen reaksi yang digunakan, sebaiknya digunakan kontrol. Caranya adalah dengan mencampurkan komponen-komponen reaksi seperti biasa, tetapi tidak ditambahkan DNA cetakan, kemudian dilakukan inkubasi seperti biasa. Selain itu, dapat juga digunakan kontrol yang lain yaitu suatu fragmen DNA, seperti DNA plasmid, yang secara teoritis bukan merupakan DNA cetakan. Gunakan fragmen DNA tersebut untuk menggantikan DNA cetakan dalam reaksi kontrol.
Sumber Kontaminasi yang Lain
Beberapa faktor yang juga merupakan sumber kontaminasi adalah;
(1). DNA plasmid atau phage yang mengandung sekuen target yang akan diamplifikasi. (2). Fragmen DNA restriksi yang telah dipurifikasi dan akan digunakan sebagai sekuen target. Jika fragmen restriksi tersebut diisolasi dari gel agarosa maka sebaiknya alat elektroforesis yang akan digunakan untuk memisahkan fragmen tersebut direndam dulu dalam larutan 1 N HCl. Sebaiknya digunakan pisau yang masih baru untuk memotong fragmen dari gel. Pada waktu memotong fragmen DNA dari gel, letakkan di atas plastik sehingga gel tersebut tidak menempel langsung pada transiluminator UV yang digunakan untuk mengetahui letak fragmen DNA.
(3). Mesin sentrifugasi. (4). Campuran es kering– etanol yang digunakan untuk mengendapkan DNA (Yuwono, 2006)