Deteksi Gen Manusia dari Saliva yang Dipreservasi

BAB IV HASIL PENELITIAN

4.3. Deteksi Gen Manusia dari Saliva yang Dipreservasi

Gambar 4.4 menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari darah (KP) dan DNA asal saliva yang sudah diekstraksi dan disimpan dalam suhu ruang tanpa pemberian antimikroba dan penghambat DNAse (TP) selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari. Keseluruhan KP menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen NOTCH2 (704 bp), CTLA4 (495 bp), OXTR (210 bp), EGF (297 bp) dan NR2F1 (175 bp), sementara pada kelompok TP, kualitas band mulai menurun pada H3 dan mulai tidak terlihat pada hari ke 10.

Gambar 4.4 Deteksi gen-gen (1) NOTCH2, (2) CTLA-4, (3) OXTR, (4) EGF dan (5) NR2F1 pada kontrol positif (KP) dan kelompok tanpa perlakuan (TP) kombinasi antimikroba dan penghambat DNase hingga 14 hari. PCR dilakukan untuk mendeteksi gen-gen tersebut. Keberadaan DNA mulai menurun pada H3 dan selanjutnya menghilang seluruhnya pada H14. H adalah lama hari penyimpanan saliva sebelum DNA diekstraksi. H7 menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari saliva yang telah disimpan dalam suhu ruang selama 7 hari. M adalah DNA ladder 100 bp.

Deteksi gen-gen NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, dan NR2F1 dilakukan dengan metode PCR dan kemudian divisualisasi dengan elektroforesis gel agarose 1%. Gambar 4.5. menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari saliva yang sudah disimpan dalam suhu ruang dengan perlakuan antimikroba dan penghambat DNase selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari. Semua sampel DNA menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen NOTCH2 (704 bp).

Gambar 4.5 Deteksi gen NOTCH2 (704 bp) pada sampel H0, H3, H7, H10 dan H14. H adalah lama hari penyimpanan saliva sebelum DNA diekstraksi. H7 menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari saliva yang telah disimpan dalam suhu ruang selama 7 hari. M adalah DNA ladder 100 bp; KP adalah kontrol positif, dan KN adalah kontrol negatif.

Gambar 4.6 menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari saliva yang sudah disimpan dalam suhu ruang dengan perlakuan antimikroba dan penghambat DNase selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari. Semua DNA menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen CTLA4 (495 bp).

Gambar 4.6 Deteksi gen CTLA4 (495 bp) pada sampel H0, H3, H7, H10, dan H14. H adalah lama hari penyimpanan saliva sebelum DNA diekstraksi. H7 menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari saliva yang telah disimpan dalam suhu ruang selama 7 hari. M adalah DNA ladder 100 bp; KP adalah kontrol positif, dan KN adalah kontrol negatif.

Gambar 4.7 menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari saliva yang sudah disimpan dalam suhu ruang dengan perlakuan antimikroba dan penghambat DNase selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari. Semua DNA menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen OXTR (210 bp).

Gambar 4.7 Deteksi gen OXTR (210 bp) pada sampel H0, H3, H7, H10 dan H14.

H adalah lama hari penyimpanan saliva sebelum DNA diekstraksi. H7 menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari saliva yang telah disimpan dalam suhu ruang selama 7 hari. M adalah DNA ladder 100 bp; KP adalah kontrol positif, dan KN adalah kontrol negatif.

Gambar 4.8 menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari saliva yang sudah disimpan dalam suhu ruang dengan perlakuan antimikroba dan penghambat DNase selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari. Semua DNA menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen EGF (297 bp).

Gambar 4.8 Deteksi gen EGF (297 bp) pada sampel H0, H3, H7, H10 dan H14. H adalah lama hari penyimpanan saliva sebelum DNA diekstraksi. H7 menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari saliva yang telah disimpan dalam suhu ruang selama 7 hari. M adalah DNA ladder 100 bp; KP adalah kontrol positif, dan KN adalah kontrol negatif.

Gambar 4.9 menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari saliva yang sudah disimpan dalam suhu ruang dengan perlakuan antimikroba dan penghambat DNase selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari. Semua DNA menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen NR2F1 (175 bp).

Gambar 4.9 Deteksi gen NR2F1 (175 bp) pada sampel H0, H3, H7, H10 dan H14.

Gambar 4.10 menunjukkan hasil PCR dari DNA yang diekstraksi dari darah (KP) dan DNA dari saliva yang sudah diekstraksi dan disimpan dalam suhu ruang dengan pemberian antimikroba dan penghambat DNAse (P) selama 0, 3, 7, 10, dan 14 hari bersama dengan kontrol positif (darah) dari masing-masing gen.

Keseluruhan sampel (KP dan P) menunjukkan keberadaan hasil PCR dari gen NOTCH2 (704 bp), CTLA4 (495 bp), OXTR (210 bp), EGF (297 bp), dan NR2F1 (175 bp).

Gambar 4.10 Deteksi gen-gen: (1) NOTCH2, (2) CTLA-4, (3) OXTR, (4) EGF, dan (5) NR2F1 pada kelompok perlakuan (P) kombinasi antimikroba dan penghambat DNase hingga 14 hari. H adalah lama hari penyimpanan saliva sebelum DNA diekstraksi. H7 menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari saliva yang telah disimpan dalam suhu ruang selama 7 hari. M adalah DNA ladder 100 bp, KN adalah kontrol negatif (tanpa DNA), dan KP adalah kontrol positif (sampel berasal dari DNA darah).

BAB V

PEMBAHASAN PENELITIAN

5.1. Konsentrasi dan Kemurnian DNA dari Saliva

Sebelum digunakan untuk analisis PCR, sampel DNA diuji atas kualitas dan kegunaan meliputi kemurnian dan integritas DNA. DNA dengan kemurnian tinggi dinyatakan memiliki rasio absorbansi 260/280 nm antara 1,6-2,0 (Garbieri et al., 2017; Koni et al., 2011), meskipun ada pula yang menyebut pada kisaran 1,8-2,0 (Murtiyaningsih, 2017) sebagai indikator kemurnian sampel DNA.

Umumnya, nilai 1,8 telah diterima sebagai nilai murni untuk sampel DNA. Rasio yang lebih rendah (≤1,6) menunjukkan adanya protein, fenol, atau kontaminan lain (Lucena-Aguilar et al., 2016) pada ekstraksi DNA metode phenol-chloroform-isoamyl alcohol, sementara rasio >2,0 dapat menunjukkan kontaminasi molekul kecil/ionik lainnya (Koni et al., 2011).

Volume saliva untuk ekstraksi DNA dalam penelitian ini adalah 1 mL.

Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil ekstraksi bervariasi. Kemurnian DNA asal saliva pada penelitian ini memiliki rata-rata 1,80 dengan absorbansi 260/280 yang menunjukkan bahwa DNA saliva memiliki purity yang baik. Nilai rata-rata kemurnian DNA saliva pada absorbansi 260/280 dengan menggunakan DANAGENE Saliva Kit adalah 1,85 (Acedo & Navarro, 2014), kemudian 1,93 dengan menggunakan MagMAX™ Saliva gDNA Isolation Kit (Marroushi et al., 2019), 1,71 dengan prepIT.L2P reagent (DNA Genotek, Canada) (Gudiseva et al., 2016), 1,84+1,74 dengan metode spin column (Siregar, 2021), 1.82 ± 0.15 dengan menggunakan Promega, Wizard^Ⓡ Genomic DNA Purification kit (Kim & Kim,

2006), 1.79 pada saliva segar kemudian 1.85 pada 8 bulan setelahnya dengan menggunakan Oragene^TM DNA Self-Collection Kit (Nunes et al., 2012).

Pada penelitian ini didapatkan rata-rata konsentrasi DNA adalah 27,70 ng/µL. Pada penelitian skala besar dengan melibatkan anak-anak sebagai subjek yang mengumpulkan 2 mL saliva per orang memakai kit Oragene DNA (Genotek Inc., Canada) didapatkan nilai konsentrasi DNA yaitu 14,36 µg/mL (Koni et al., 2011). Dengan kit yang sama, peneliti lain mendapatkan konsentrasi DNA berada pada 6,89-9,98 µg/mL (Garbieri et al., 2017). Penelitian menggunakan metode salting out dengan 2 mL saliva, mendapatkan rata-rata konsentrasi DNA 48,4 µg/mL (28,5-61,5 µg/mL) (Khare et al., 2014). Penelitian lain menggunakan sampel swab mulut dan Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit, mendapati konsentrasi DNA antara 1,38-54,2 pg/µL, sementara pada sampel saliva dengan menggunakan QIAamp Blood DNA Kit mendapati konsentrasi DNA antara 1,01-8,20 ng/μL (Hughes & Chapleau, 2019). Tampaknya, meskipun berasal dari volume saliva yang lebih besar, tidak secara langsung menghasilkan konsentrasi DNA yang lebih besar (Nunes et al., 2012).

5.2. Efek Pemberian Kombinasi Antimikroba dan Penghambat DNase terhadap DNA asal Saliva

Penelitian ini mendapati bahwa pada kelompok sampel dengan pemberian kombinasi antimikroba dan penghambat DNase menunjukkan band-band hasil PCR yang spesifik sebagai representasi masing-masing gen NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, dan NR2F1 mulai dari H0, H3, H7, H10, dan H14. Sementara itu, kelompok sampel tanpa perlakuan (TP), band DNA mulai memudar pada H3 dan menghilang pada H10 dan H14 (Gambar 4.4).

Pemberian antimikroba diharapkan mampu mencegah replikasi/membunuh mikroorganisme seperti bakteri dan jamur yang dapat mengganggu preservasi DNA manusia. Selain itu, Streptococcus grup A menghasilkan DNase ekstraseluler (Sumby et al., 2005) dan turut berpotensi menghancurkan DNA manusia dalam sampel saliva yang telah dikumpulkan.

Gentamisin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida broad spectrum yang memiliki efek bakterisidal dan juga berperan sebagai penghambat DNAse. Gentamisin berkonsentrasi >35 μg/mL dapat menghambat aktivitas 2,5 μg/mL DNAse, dan pada konsentrasi 1.120 μg/mL mampu menghambat aktivitas 2,5 μg/mL DNAse secara keseluruhan (McGuire et al., 2015). Pengobatan dengan klindamisin mengurangi DNase ekstraseluler in vivo, sedangkan konsentrasi klindamisin subinhibitor menginduksi ekspresi dan aktivitas DNase Streptococcus pyogenes in vitro (Andreoni et al., 2017). Aminoglikosida terdiri dari banyak jenis antibiotika seperti gentamisin, streptomisin, apramisin, tobramisin, amikasin, neomisin, plazomisin, dan arbekasin (Krause et al., 2016). Tidak didapatkan penghambatan degradasi yang diobservasi dengan menggunakan streptomisin dan kanamisin, sedangkan neomisin pada konsentrasi 2 mM sepenuhnya menghambat degradasi DNA plasmid secara in vitro (Woegerbauer et al., 2000). Penghambatan aktivitas DNase dapat dilakukan dari berbagai cara lainnya, yaitu actinomycin D maupun neomycin B dari bakteri genus Streptomyces (Kolarevic et al., 2014) juga actin pada aliran darah (Vancevska & Nikolic, 2013), dimana G-actin diketahui sebagai penghambat alami DNAse I (Shiokawa & Tanuma, 2001).

Selain antimikroba, propylene glycol, glycerine, dan polyethylene glycol 1000 (PEG 1000) dapat memberikan efek bakterisidal pada konsentrasi 100%.

Propylene glycol efektif menunjukkan aktivitas bakterisidal pada tiga organisme yaitu S. mutans (50%), E. faecalis (25%) dan E. coli (50%), kemudian PEG 1000 efektif terhadap S. mutans dan E. coli pada 25% (Nalawade et al., 2015). Efek dari kombinasi ketiga senyawa ini belum diuji untuk preservasi DNA.

Cara paling efektif dan universal untuk menghilangkan DNA genomik yaitu reaksi enzimatik dengan DNase I. Dengan adanya ion magnesium (Mg²⁺), DNase I memotong setiap untai DNA secara independen sementara dengan adanya ion mangan (Mn²⁺), kedua untai dibelah di tempat yang hampir sama. Ion Mn²⁺ dapat digunakan pada konsentrasi sepuluh kali lebih rendah (0,66 mM) daripada ion Mg²⁺ (Wiame et al., 2000). EDTA yang merupakan indirect inhibitor dari DNase I bekerja dengan mengkelatkan ion-ion (Ca²⁺, Mg²⁺) yang berperan penting untuk struktur enzim dan aktivitas enzimatik DNase I secara keseluruhan (Barra et al., 2015). Rosenberg (1987) dan Yagi et al. (1996) menunjukkan bahwa pemberian 1 mM EDTA dapat menghambat aktivitas DNase. Dosis yang lebih sedikit yaitu 0,05 M EDTA yang ditambahkan dalam Tris-HCl buffer juga mampu menghambat aktivitas DNase (Macanovic & Lachmann, 1997). Peningkatan dosis EDTA secara bertahap mulai dari 4,5 x10^-3M sampai dengan 5×10⁻² M menunjukan penghambatan pada aktivitas enzimatik khususnya pada DNAse I.

Konsentrasi EDTA 5×10⁻²M memberikan hasil tidak adanya aktivitas DNAse pada sampel yang diamati (Barra et al., 2015). Hasil penelitian lain menunjukkan bahwa Merkuri (Hg²⁺), Arsenik (As³⁺), Timbal (Pb²⁺), Cadmium (Cd²⁺) dan Tembaga (Cu²⁺) dapat menghambat aktivitas DNase I yang bergantung konsentrasi dengan nilai IC₅₀ masing-masing sebesar 0,37 mM, 2,7 mM, 5 mM, 5,3 mM dan 7,8 mM (Zhao et al., 2017). Nikel (Ni²⁺) mampu menghambat DNase

I, DNase X, dan DNase γ dengan IC50 masing-masing 3 mM, 3 mM, dan 1,4 mM sedangkan Seng (Zn²⁺) mampu menghambat semua DNase pada IC50 diperkirakan masing-masing sebesar 80 mM DNase I, 60 mM DNase X, 50 mM DNase γ, dan 60 mM DNAS1L2 (Shiokawa & Tanuma, 2001)

Cara konvensional yang digunakan untuk menginaktivasi DNAse I yaitu dengan pemanasan pada suhu 100 ^oC selama 15 menit (Lahiri & Singh, 1990), atau 75 °C selama 5 menit (Wiame et al., 2000). Namun cara ini jarang dilakukan karena memakan waktu, rumit, tidak selalu bekerja dengan baik (Santos et al., 2016) dan dapat mendenaturasi sebagian besar protein (Daniel et al., 1996).

Hanaki et al. (2000) menunjukkan bahwa pemanasan DNase I pada suhu 95 °C selama 10 menit dalam buffer PCR tidak adekuat untuk menginaktivasi DNase I.

DNase I dapat diinaktivasi dengan panas jika pH larutan DNase I lebih rendah dari 7 atau lebih tinggi dari 9, atau dengan tambahan buffer yang mengandung dithiothreitol (DTT) pada konsentrasi 0,1 mM atau lebih tinggi (Hanaki et al., 2000).

Selain itu, metode penghambatan DNase yang efektif dan sederhana adalah dengan cara melarutkan pelet DNA dalam standard saline citrate (SSC) termodifikasi yang mengandung 0,1 M natrium klorida (NaCl) dan 0,05 M sodium sitrat (pH 7,6). Metode ini menghemat waktu dan tidak memerlukan pemanasan atau pendinginan untuk inaktivasi enzim (Kolarevic et al., 2014;

Lahiri & Singh, 1990). Perbandingan efektivitas masing-masing metode dalam penghambatan aktivitas DNase belum ditemui.

Kombinasi antimikroba dan penghambat DNase I dalam penelitian ini mampu mempreservasi DNA saliva manusia hingga 14 hari (Gambar 4.10).

Pemberian kombinasi antimikroba seperti gentamisin, klindamisin, dan ketokonazol serta EDTA menunjukkan hasil yang baik dalam mempreservasi DNA saliva manusia.

5.3. Deteksi Gen Manusia dari DNA asal Saliva

Deteksi dari masing-masing gen yang telah dilakukan pada 5 kelompok lama hari perlakuan yaitu H0, H3, H7, H10 dan H14 menunjukkan bahwa keseluruhan gen-gen yang disasar dalam penelitian ini (NOTCH2, CTLA4, OXTR, EGF dan NR2F1) berhasil ditemukan dan terlihat dengan visualisasi menggunakan elektroforesis. Pada masing-masing gen dijumpai single band yang jelas dan spesifik. Hal ini menunjukkan bahwa set primer yang didesain sudah spesifik dengan tidak ditemukannya band lain atau unintended homologies.

Beberapa penelitian telah menjadikan saliva sebagai sumber DNA untuk mendeteksi gen tertentu. Menggunakan sepasang primer gen human beta globin (HBB) yaitu (Forward CAACTTCATCCACGTTCACC dan Reverse GAAGAGCCAAGGACAGGTAC) dan sepasang primer bakteri E. Coli 16s

(Forward CCTACGGGAGGCAGCAG dan Reverse

ATTACCGCGGCTGCTGG), Poehls et al. (2018) menentukan rasio kandungan DNA manusia dan bakteri pada DNA saliva manusia. Penelitian juga dilakukan untuk mendeteksi gen B-Actin (351 bp) dengan set primer (Forward

AACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTT; dan Reverse

AGCAGCCGTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC) yang diambil dari saliva segar dan swab mulut pada subjek manusia dan menunjukkan hasil baik secara kualitatif yang dilihat dari hasil elektroforesis pada hari ke 7 dan hari ke 180 (Carvalho et al., 2010). Deteksi dengan primer gen Prothrombin untuk mendeteksi

polimorfisme (Rudqvist-Rylander et al., 2006) dan primer gen SARS-Cov2 dengan real time (RT) PCR (Sun et al., 2021) juga dapat dilakukan dengan baik menggunakan saliva manusia.

Dalam banyak situasi, saliva berkontribusi untuk pemeriksaan laboratorium, seperti diagnosis penyakit oral (Javaid et al., 2016), penyakit menular, neoplasia ganas, pemantauan obat terlarang, penyakit autoimun, analisis hormonal, dan membantu kedokteran forensik (Lima et al., 2010). Saliva sebagai sumber DNA manusia untuk pemeriksaan berbagai penyakit, seperti mendeteksi DNA bakteri H. pylori penyebab penyakit ulkus peptikum maupun gastritis (Yu et al., 2015), HBV pada hepatitis B (Van Der Eijk et al., 2004), kanker kepala dan leher (Franzmann et al., 2007), dan kanker payudara (Poehls et al., 2018). Deteksi penyakit autoimun seperti penyakit Sjögren dengan mRNA (Zimmermann et al., 2007), menilai garis keturunan/paternitas (Ma et al., 2006; Patidar et al., 2015) juga dapat dilakukan dengan menggunakan saliva.

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan

1. Pemberian kombinasi antimikroba dan penghambat aktivitas DNAse mampu mempreservasi DNA genom manusia dengan saliva yang disimpan dalam wadah tertutup pada suhu ruang hingga 14 hari.

2. Dengan menggunakan metode spin-column, rata-rata konsentrasi DNA saliva adalah 27,7 ng/µL dan rata-rata kemurnian DNA saliva adalah 1,80.

3. Gen target NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, dan NR2F1 dapat terdeteksi dalam DNA saliva yang dipreservasi pada suhu ruang hingga 14 hari

6.2. Saran

1. Identifikasi dengan antimikroba lain untuk mendapatkan hasil yang lebih spesifik pada mikroba mulut ataupun saliva.

2. Identifikasi efektifitas dari konsentrasi antimikroba yang diberikan untuk membasmi seluruh mikrooroganisme pada mulut atau saliva

3. Penentuan inhibitor DNAse yang spesifik dalam menghambat DNA pada saliva manusia.

4. Memperluas penelitian dengan lebih banyak gen sebagai representative pada human genome.

5. Metode maupun cara dalam penelitian ini dapat dipertimbangkan untuk digunakan dalam menguji sampel pada kasus klinis.

DAFTAR PUSTAKA

Abdel-Latif, A., & Osman, G. (2017). Comparison of three genomic DNA extraction methods to obtain high DNA quality from maize. Plant Methods, 13(1), 1–9. https://doi.org/10.1186/s13007-016-0152-4

Acedo, A., & Navarro, D. (2014). Purification of High-quality DNA from Saliva Samples with DANAGENE Saliva System applied to TargetSeq-NGS protocols. BioTechniques, 56(5), 276. https://doi.org/10.2144/000114172 Adhiyanto, C., Hendarmin, L., & Puspitaningrum, R. (2020). Pengenalan Dasar

Teknik Bio-Molekuer. 82.

(2020). In vitro activity of arbekacin against multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, xxxx, 8–11. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2020.08.018

Ambarkova, V. (2018). The Bacterial Flora in A Healthy Oral Cavity. Advances in Dentistry & Oral Health, 9(5), 10–11.

https://doi.org/10.19080/adoh.2018.09.555773

Amerongen, N. A. V., & Veerman, E. C. I. (2002). Saliva - The defender of the oral cavity. Oral Diseases, 8(1), 12–22. https://doi.org/10.1034/j.1601-0825.2002.1o816.x

Amon, P., & Sanderson, I. (2017). What is the microbiome? Archives of Disease in Childhood: Education and Practice Edition, 102(5), 258–261.

https://doi.org/10.1136/archdischild-2016-311643

Anchordoquy, T. J., & Molina, M. C. (2007). Preservation of DNA. Cell

Preservation Technology, 5(4), 180–188.

https://doi.org/10.1089/cpt.2007.0511

Andrade, J. T., Lima, W. G., Sousa, J. F., Saldanha, A. A., Nívea Pereira De Sá, Morais, F. B., Prates Silva, M. K., Ribeiro Viana, G. H., Johann, S., Soares, A. C., Araújo, L. A., Antunes Fernandes, S. O., Cardoso, V. N., & Siqueira Ferreira, J. M. (2021). Design, synthesis, and biodistribution studies of new analogues of marine alkaloids: Potent in vitro and in vivo fungicidal agents against Candida spp. European Journal of Medicinal Chemistry, 210.

https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2020.113048

Andreoni, F., Zörcher, C., Tarnutzer, A., Schilcher, K., Neff, A., Keller, N., Maggio, E. M., Poyart, C., Schuepbach, R. A., & Zinkernagel, A. S. (2017).

Clindamycin affects group a streptococcus virulence factors and improves clinical outcome. Journal of Infectious Diseases, 215(2), 269–277.

https://doi.org/10.1093/infdis/jiw229

Arsal, A. F. (2018). GENETIKA I : Arif Memahami Kehidupan.

Atawodi, S., Atawodi, J., & Dzikwi, A. (2011). Polymerase chain reaction:

Theory, practice and application: A review. Sahel Medical Journal, 13(2), 53–63. https://doi.org/10.4314/smj2.v13i2.64834

Aygan, A. (2006). Nucleic acid extraction from clinical specimens for PCR applications. Turkish Journal of Biology, 30(2), 107–120.

Babteen, N. A., Fawzy, M. S., Alelwani, W., Alharbi, R. A., Alruwetei, A. M., Toraih, E. A., & Elshazli, R. M. (2020). Signal peptide missense variant in cancer-brake gene CTLA4 and breast cancer outcomes. Gene, 737(January), 144435. https://doi.org/10.1016/j.gene.2020.144435

Badr, M. T., Blümel, B., Baumgartner, S., Komp, J. M. A., & Häcker, G. (2020).

Antimicrobial susceptibility patterns and wild-type mic distributions of anaerobic bacteria at a german university hospital: A five-year retrospective

study (2015–2019). Antibiotics, 9(11), 1–11.

https://doi.org/10.3390/antibiotics9110823

Barra, G. B., Santa Rita, T. H., Vasques, J. de A., Chianca, C. F., Nery, L. F. A.,

& Costa, S. S. S. (2015). EDTA-mediated inhibition of DNases protects circulating cell-free DNA from ex vivo degradation in blood samples.

Clinical Biochemistry, 48(15), 976–981.

https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2015.02.014

Benn, A. M., & Thomson, W. M. (2014). Saliva : an overview Report Saliva : An Overview. New Zealand Dental Journal, September, 92–96.

Bertrand, F. E., Eckfeldt, C. E., Lysholm, A. S., & LeBien, T. W. (2000). Notch-1 and Notch-2 exhibit unique patterns of expression in human B-lineage cells.

Leukemia, 14(12), 2095–2102. https://doi.org/10.1038/sj.leu.2401942

Borgers, M., Van den Bossche, H., & De Brabander, M. (1983). The mechanism of action of the new antimycotic ketoconazole. The American Journal of Medicine, 74(1 PART 2), 2–8. https://doi.org/10.1016/0002-9343(83)90507-7

Bracamonte-Wolf, C., Orrego, Patricio R, Muñoz, C., Herrera, D., Bravo, J., Gonzalez, J., Varela, H., Catalán, A., & Araya, J. E. (2019). Observational cross-sectional study of Trichomonas tenax in patients with periodontal disease attending a Chilean university dental clinic. BMC Oral Health, 19(1), 1–9. https://doi.org/10.1186/s12903-019-0885-3

Brooks, G. F., Carroll, K. C., Butel, J. S., Morse, S. A., & Mietzner, T. A. (2018).

Medical Mycology. In a LANGE medical book: Jawetz, Melnick, &

Adelberg’s Medical Microbiology Twenty-Sixth Edition.

https://doi.org/10.1016/B978-0-323-40181-4.00114-6

Brown, K. K., Alkuraya, F. S., Matos, M., Robertson, Richard L. Kimonis, V. E.,

& Morton, C. C. (2010). NR2F1 Deletion in a Patient with a de novo Paracentric Inversion, inv(5)(q15q33.2), and Syndromic Deafness. Am J Med Genet A, 149(5), 931–938. https://doi.org/10.1002/ajmg.a.32764. NR2F1 Brunner-Weinzierl, M. C., & Rudd, C. E. (2018). CTLA-4 and PD-1 control of

T-cell motility and migration: Implications for tumor immunotherapy.

Frontiers in Immunology, 9(NOV), 1–8.

https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02737

Buchbinder, E. I., & Desai, A. (2016). CTLA-4 and PD-1 Pathways. In American Journal of Clinical Oncology (Vol. 39, Issue 1, pp. 98–106).

https://doi.org/10.1097/coc.0000000000000239

Burrows, A. M., Kasu, M., & D’Amato, M. E. (2019). Preservation of DNA integrity in biological material. Forensic Science International: Genetics

Supplement Series, 7(1), 416–418.

https://doi.org/10.1016/j.fsigss.2019.10.034

Burrows, A. M., Ristow, P. G., & D’Amato, M. E. (2017). Preservation of DNA from saliva samples in suboptimal conditions. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, 6(September), e80–e81.

https://doi.org/10.1016/j.fsigss.2017.09.050

Carvalho, S. P. M., Sales-Peres, A., Ribeiro-Bicudo, L. A., & Silva, R. H. A. da.

(2010). Quality evaluation of DNA obtained from stored human saliva and its applicability to identification in Forensic Dentistry. Revista Odonto Ciência (Online), 25(1), 48–53. https://doi.org/10.1590/s1980-65232010000100010

Chaves, B. J., & Tadi, P. (2020). Gentamicin - StatPearls - NCBI Bookshelf. In

StatPearls Publishing (pp. 1–24).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK557550/

Cho, Y. D., Kim, K. H., Lee, Y. M., Ku, Y., & Seol, Y. J. (2021). Oral microbiome and host health: Review on current advances in genome-wide analysis. Applied Sciences (Switzerland), 11(9), 1–16.

https://doi.org/10.3390/app11094050

Chojnowska, S., Baran, T., Wilińska, I., Sienicka, P., Cabaj-Wiater, I., & Knaś, M. (2018). Human saliva as a diagnostic material. Advances in Medical Sciences, 63(1), 185–191. https://doi.org/10.1016/j.advms.2017.11.002 Cintoni, M., Rinninella, E., Scaldaferri, F., Ianiro, G., Franceschi, F., Mele, M. C.,

Gasbarrini, A., Tor, R., Avanzata, N., Gastroenterologiche, S., Nefro-urologiche, M., Policlinico, F., & Gemelli, U. A. (2019). The oral microbiota in oral and systemic diseases. Microbiota in Health and Disease, 1(April 2018), 1–6, [cit. 2020-10-18].

Coico, R. (2005). Gram Staining Basic Protocol Commonly Used Techniques.

Current Protocols in Microbiology, 3–4.

Conrad, R., & Vlassov, A. V. (2015). The Human Microbiota: Composition, Functions, and Therapeutic Potential. Medical Science Review, 2(October), 92–103. https://doi.org/10.12659/msrev.895154

Contaldo, M., Fusco, A., Stiuso, P., Lama, S., Gravina, A. G., Itro, A., Federico, A., Itro, A., Dipalma, G., Inchingolo, F., Serpico, R., & Donnarumma, G.

(2021). Oral microbiota and salivary levels of oral pathogens in gastro‐

intestinal diseases: Current knowledge and exploratory study.

Microorganisms, 9(5), 1–16.

https://doi.org/10.3390/microorganisms9051064

Corstjens, P. L. A. M., Abrams, W. R., & Malamud, D. (2016). Saliva and viral infections. Periodontology 2000, 70(1), 93–110.

https://doi.org/10.1111/prd.12112

Daniel, P. N., Koh, D., Choo, S., & Chia, K. S. (2006). Saliva as a viable alternative source of human genomic DNA in genetic epidemiology. Clinica Chimica Acta, 367(1–2), 81–85. https://doi.org/10.1016/j.cca.2005.11.024 Daniel, R. M., Dines, M., & Petach, H. H. (1996). The denaturation and

degradation of stable enzymes at high temperatures. Biochemical Journal,

317(1), 1–11. https://doi.org/10.1042/bj3170001

Dawes, C. (2003). Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of the oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology, 48(5), 329–336.

https://doi.org/10.1016/S0003-9969(03)00014-1

de Freitas, E. M., Monteiro, L. C., da Silva Fernandes, M. B., Martelli Junior, H., Bonan, P. R. F., & Nobre, S. A. M. (2015). Antifungal susceptibility in vitro determined by the etest® for Candida obtained from the oral cavity of irradiated and elderly individuals. Brazilian Dental Journal, 26(2), 99–104.

https://doi.org/10.1590/0103-6440201300115

Demerec, M. (1933). WHAT IS A GENE? Publishing, Electronic Scholarly, 368–

378. Therapeutic, Comparative Study). Journal of Cosmetics, Dermatological

Sciences and Applications, 08(04), 264–271.

https://doi.org/10.4236/jcdsa.2018.84028

Ehtisham, M., Wani, F., Wani, I., Kaur, P., & Nissar, S. (2016). Polymerase Chain Reaction (PCR): Back to Basics. Indian Journal of Contemporary Dentistry, 4(2), 30. https://doi.org/10.5958/2320-5962.2016.00030.9 Mantalas, G. L., Novak, A. M., van den Bout, A., Bishara, A., Rosenkrantz, J. L., Lorig-Roach, R., Field, A. R., Haeussler, M., Russo, L., Bhaduri, A., Nowakowski, T. J., Pollen, A. A., Dougherty, M. L., Nuttle, X., … Haussler, D. (2018). Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell, 173(6), 1356-1369.e22.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.051

Franzmann, E. J., Reategui, E. P., Pedroso, F., Pernas, F. G., Karakullukcu, B. M., Carraway, K. L., Hamilton, K., Singal, R., & Goodwin, W. J. (2007). Soluble CD44 is a potential marker for the early detection of head and neck cancer.

Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 16(7), 1348–1355.

https://doi.org/10.1158/1055-9965.EPI-06-0011

Fredy, G., Estupiñan, M., & Galindo, A. (2004). Presence Of Streptococcus Mutans In Saliva and Its Relationship With Dental Caries: Antimicrobial

Dalam dokumen DETEKSI GEN NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, DAN NR2F1 MENGGUNAKAN DNA PRESERVASI ASAL SALIVA MANUSIA YANG DIBERI KOMBINASI ANTIMIKROBA DAN PENGHAMBAT DNAse (Halaman 54-0)