DAFTAR PUSTAKA
FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.4. Mikrob dalam Pupuk Hayati 1. Azotobacter
2.4.3. Fungi Pelarut Fosfat
Mikrob Pelarut Fosfat (MPF) merupakan mikrob tanah yang memiliki kemampuan dalam melarutkan P tidak tersedia menjadi tersedia (Rao, 1982). MPF terdiri dari kelompok bakteri dan fungi. Populasi MPF kelompok fungi jauh lebih rendah dibandingkan kelompok bakteri. Fungi yang dapat melarutkan fosfat umumnya berasal dari kelompok Deutromycetes antara lain Aspergillus niger, A. Awamori, Penicillum digitatum, Fusarium dan Sclerotium (Alexander, 1977). Mikrob ini kebanyakan hidup di daerah perakaran karena banyaknya jumlah bahan organik. Hal itu menyebabkan aktivitas mikrob yang dekat perakaran akan lebih aktif daripada yang hidup jauh dari akar.
Fungi Pelarut Fosfat (FPF) mampu mensekresikan asam-asam organik yang dapat membentuk kompleks stabil dengan kation-kation pengikat P di dalam tanah dengan cara menurunkan pH dan memecahkan ikatan pada beberapa bentuk senyawa fosfat sehingga ketersediaan fosfat dalam larutan tanah meningkat. Asam organik yang dihasilkan oleh FPF dapat meningkatkan ketersediaan P di dalam tanah serta mengurangi daya racun Al yang dapat dipertukarkan (Al-dd) (Hue et al., 1986). Selain itu FPF secara nyata mampu mengurangi Fe, Mn dan Cu yang terserap oleh tanaman jagung pada tanah masam (Premono et al., 1992).
Pertumbuhan FPF sangat dipengaruhi oleh kemasaman tanah. Pada tanah masam, aktivitas mikrob didominasi oleh kelompok fungi sebab pertumbuhan fungi optimum pada pH 5.0 – 5.5. Fungi dalam tanah berbentuk miselium
vegetatif ataupun spora. Pertumbuhan fungi akan menurun seiring dengan peningkatan pH (Waksman dan Starkey, 1981).
2.5. Metode Sterilisasi Bahan Pembawa 2.5.1. Iradiasi Sinar Gamma Co-60
Sinar Gamma termasuk gelombang elektromagnetik yang diperoleh dari peluruhan zat radioaktif yang dipancarkan dari atom dengan kecepatan tinggi karena adanya kelebihan energi. Radioaktivitasnya tidak terpengaruh oleh suhu, kelembaban, tekanan dan lain-lain tetapi terpengaruhi oleh keadaan inti-inti isotopnya. Radiasi sinar Gamma dapat dipancarkan oleh Cobalt-60 dan Caesium-137 (Soeminto, 1985 dalam Darjanto, 1995).
Menurut Kustiono (1994) dalam Dwiatmoko (2000), iradiasi adalah sinar radiasi yang apabila mengenai bahan akan menyebabkan terjadinya penyerapan energi di dalam bahan tersebut dengan melalui berbagai macam proses atau interaksi. Jumlah energi radiasi yang diabsorbsi oleh suatu bahan tersebut dinyatakan dalam besaran dosis.
Dosis serap (D) didefinisikan sebagai rata-rata energi yang diserap bahan per satuan massa bahan tersebut. Satuan yang digunakan saat ini adalah Gray (Gy) dimana 1 Gray (Gy) = 1 Joule/kg sehingga diperoleh hubungan bahwa 1 Gray (Gy) = 100 rad. Menurut Kume (2005), radiasi Sinar Gamma memiliki efektivitas yang berbeda dalam mematikan mikrob seiring dengan besaran dosis yang diberikan (Gambar 1). Semakin besar dosis yang diberikan maka daya mematikan mikrobnya semakin besar pula.
Pengaruh iradiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap mikrob terlihat jelas pada suatu populasi yaitu berkurangnya jumlah koloni yang terbentuk pada Nutrient Agar. Menurut Suhadi (1976) dalam Darjanto (1995), hal tersebut terjadi karena bakteri tersebut terbunuh, tidak aktif atau terhambat pertumbuhannya, sedangkan sel-sel yang masih hidup mungkin disebabkan oleh perbedaan atau perubahan sifat kepekaan atau daya tahan terhadap radiasi.
Gambar 1. Efektivitas radiasi Gamma Ray dalam mematikan mikrob dengan berbagai dosis (Kume, 2005).
Radiasi sinar Gamma atau elektron berenergi tinggi disebut juga radiasi pengion karena energi radiasi yang terserap oleh benda akan berinteraksi dengan benda tersebut dan menimbulkan efek biologi yang mengubah proses kehidupan normal dari sel hidup. Pada mikrob dapat berpengaruh terhadap DNA sehingga mikrob tidak dapat membelah diri akibat perubahan yang ditimbulkan oleh radiasi pengion (Hilmy,1980).
2.5.2. Mesin Berkas Elektron
Mesin Berkas Elektron (MBE) atau Electron Beam Machine merupakan perangkat sumber elektron berenergi tinggi yang digunakan untuk mengolah bahan plastik atau polimer. Sesuai dengan perkembangan teknologi MBE mengikuti kebutuhan industri yaitu penggunaan proses iradiasi bahan yang relatif tebal atau untuk menghasilkan sinar-X. Penggunaan MBE yang berenergi tinggi ini dijadikan sebagai pengganti proses radiasi selama ini yang hanya mungkin dilakukan dengan menggunakan sinar Gamma yang dihasilkan oleh isotop radioaktif Cobalt-60 seperti misalnya sterilisasi alat kedokteran atau proses radiasi pengawetan makanan (Anonim, 1990).
Bahan yang diradiasi dengan MBE bebas dari radioaktivitas karena interaksi berkas elektron dengan bahan yang diradiasi hanya akan menyebabkan penyusunan ulang elektron terluar dari atom atau molekul bahan. Dengan kata lain proses radiasi tersebut hanya akan menimbulkan reaksi kimia dan bukan reaksi
inti sehingga tidak akan ada proses transmutasi inti dan dengan demikian tidak akan ada radioaktivitas (Anonim, 1990).
Menurut Kume (2005), daya penetrasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap bahan pembawa lebih tinggi jika dibandingkan dengan MBE. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 2 yang menyatakan penurunan bakteri dan fungi akibat radiasi Sinar Gamma lebih besar dibandingkan dengan penurunan bakteri dan fungi akibat radiasi MBE.
Gambar 2. Perbandingan penurunan jumlah mikrob bakteri dan fungi dengan Gamma Ray dan MBE (Kume, 2005).
Prinsip kerja MBE dimulai dari elektron berkecepatan rendah yang dihasilkan oleh sumber elektron berupa filamen atau katoda yang dipanaskan dengan arus listrik. Elektron tersebut dipercepat akibat adanya beda voltase medan listrik antara katoda dan anoda. Elektron yang telah dipercepat dipusatkan dan diarahkan selanjutnya dibelokkan menggunakan medan magnet atau scanner sehingga berkas elektron melebar dan siap untuk meradiasi bahan atau target (Sukarman, 2007).
2.5.3. Autoklaf
Teknik sterilisasi melalui pemanasan dijadikan pilihan yang umum digunakan dalam sterilisasi suatu populasi mikrob. Penggunaan panas lembab lebih efektif dibandingkan dengan panas kering karena lebih cepat mematikan mikrob. Beberapa cara metode panas lembab diantaranya adalah pendidihan, uap
bebas dan uap dengan tekanan. Uap dengan tekanan merupakan metode sterilisasi yang paling efisien karena membuat temperatur di atas mampu mendidihkan titik air. Temperatur tersebut berfungsi untuk mematikan spora bakteri yang sangat tahan panas. Sterilisasi uap digunakan dalam suatu ruangan bertekanan yang disebut autoklaf (Kusnadi, 2004).
Mekanisme kerusakan oleh panas ini ditandai dengan rusaknya produksi rantai-tunggal DNA. Hilangnya viabilitas sel oleh panas berhubungan langsung dengan pelepasan rantai DNA. Kerusakan DNA bersifat enzimatik, kemampuan sel untuk memperbaiki kerusakan dan memperoleh viabilitas bergantung pada tempat fisiologik dan susunan genetik organisme. Menurut Hadioetomo (1985), autoklaf merupakan pressure cooker yang sangat efektif mematikan mikrob karena pada suhu 1210C dapat melepaskan 686 kalori/g uap air.
Autoklaf terutama ditujukan untuk mematikan endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat mematikan sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100°C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121°C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit. Pada kondisi tersebut sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65°C (Kusnadi, 2004).
III. BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Institut Pertanian Bogor. Untuk penelitian sterilisasi bahan pembawa menggunakan iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan Mesin Berkas Elektron (MBE) yang dilakukan di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi-Badan Tenaga Nuklir Nasional Indonesia (PATIR-BATAN), Pasar Jumat, Jakarta Selatan. Penelitian dimulai dari bulan Maret 2010 hingga bulan Juli 2010.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah bahan pembawa berupa arang batok; zeolit yang berasal dari Cikembar, Sukabumi (Jawa Barat); arang kayu yang berasal dari pohon rambutan dan gambut dari Rawa Pening, Salatiga (Jawa Tengah). Isolat yang digunakan adalah Azospirillum, Azotobacter dan Fungi Pelarut Fosfat.
Media untuk menghitung total mikrob sebelum dan setelah sterilisasi adalah Nutrient Agar (Tabel Lampiran 8). Media yang digunakan untuk menguji viabilitas inokulan adalah Nitrogen Free Bromtymolblue (NFB) untuk Azospirillum, Nitrogen Free Manitol (NFM) untuk Azotobacter dan Pikovskaya untuk populasi Fungi Pelarut Fosfat (Tabel lampiran 5, 6 dan 7). Media perbanyakan yang digunakan adalah Nutrient Broth (Tabel lampiran 8) dan Potato Dextrose Agar (Tabel lampiran 9).
Alat yang digunakan untuk sterilisasi bahan pembawa adalah iradiasi Sinar Gamma Co-60, Mesin Berkas Elektron (MBE) dan autoklaf.
3.3. Metode Penelitian
Metode yang dilakukan pada penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu :
3.3.1. Persiapan Bahan Pembawa
Bahan pembawa arang batok, zeolit, arang kayu dan gambut Rawa pening dihaluskan hingga memiliki ukuran partikel 0.5 mm – 1.5 mm. Bahan pembawa terlebih dahulu dianalisis sifat kimianya untuk mengetahui karakteristik bahan itu sendiri. Pengukuran pH-H20 dilakukan menggunakan pH-meter dengan perbandingan sampel dan aquades sebesar 1:10. Pengukuran kadar air juga dilakukan melalui pengovenan dengan suhu 1050C selama 24 jam untuk mengetahui kelembaban bahan pembawa.
Penghitungan awal total mikrob dilakukan untuk mengetahui jumlah mikrob indigenus dalam bahan pembawa sebelum proses sterilisasi. Total mikrob ditumbuhkan dalam media Nutrient Agar dengan metode cawan hitung melalui seri pengenceran.
Masing-masing bahan pembawa dikemas ke dalam plastik sebanyak 10 g. Hal ini bertujuan untuk memudahkan dan meminimalkan kontaminasi pada saat melakukan seri pengenceran. Bahan pembawa dikemas ke dalam plastik tahan panas untuk sterilisasi autoklaf. Sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE menggunakan plastik HDP (High Density Plastic) kemudian kemasan disegel dengan rapat menggunakan sealer (Gambar Lampiran 1).
3.3.2. Proses Sterilisasi Bahan Pembawa
Sterilisasi menggunakan autoklaf dilakukan sebanyak dua kali selama dua hari berturut-turut dengan suhu mencapai 1210C selama 60 menit (Gambar Lampiran 4). Hal ini bertujuan untuk memberikan jeda waktu spora berkecambah sehingga pada saat pemanasan berikutnya dipastikan semua mikrob dapat terbunuh. Bahan pembawa sebanyak 10 g dimasukkan ke dalam plastik tahan panas kemudian ditutup menggunakan klip. Setelah selesai proses autoklaf , uap air dalam plastik dibiarkan mengering kemudian disegel dengan rapat menggunakan sealer pada akhir proses autoklaf hari kedua.
Sterilisasi Iradiasi Sinar Gamma Co-60 dilakukan dengan cara sejumlah bahan pembawa, yang masing-masing telah dikemas dalam plastik HDP sebanyak 10g per kemasan bahan pembawa, ditempatkan menjadi satu dalam satu wadah kontainer lalu diletakkan di dalam ruang radiasi atau irradiation chamber
(Gambar Lampiran 2). Ruang radiasi tersebut kemudian diberikan sinar gamma yang berasal dari sumber radiasi. Sumber radiasi tersebut dikendalikan oleh operator dari ruangan yang berbeda. Dosis radiasi yang diberikan adalah 50 kGy untuk semua sampel dengan laju dosis 7 kGy/jam.
Bahan pembawa yang disterilisasi menggunakan MBE permukaannya diratakan kurang dari 1 cm pada saat diletakkan di wadah yang akan melewati MBE. Hal ini perlu dilakukan karena pada MBE hanya terjadi tumbukan radiasi pada permukaan bahan yang akan dipancarkan. Wadah tersebut kemudian masuk ke dalam ruang berkas elektron dengan jalur khusus yang akan melewati pancaran elektron (Gambar Lampiran 3). Sampel bahan pembawa dilewatkan di bawah mesin berkas elektron sebanyak 5 kali yang setara dengan dosis 50 kGy.
3.3.3. Produksi Inokulan
Isolat Azospirillum dan Azotobacter diperbanyak menggunakan 100 ml Nutrient Broth kemudian dikocok selama tiga hari dengan kecepatan 120 rpm pada suhu kamar. Fungi Pelarut Fosfat (FPF) diperbanyak menggunakan 100 ml Pikovskaya cair yang dikocok selama tiga hari dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang setelah itu ditumbuhkan dalam media Potato Dextrose Agar. Spora fungi yang tumbuh dalam media tersebut kemudian dipanen.
Penetapan populasi masing-masing inokulan dilakukan untuk mengetahui jumlah sel awal inokulan yang dimasukkan ke dalam bahan pembawa yang telah disterilisasi oleh iradiasi Sinar Gamma Co-60, MBE dan autoklaf.
3.3.4. Proses Inokulasi
Proses inokulasi Azospirillum, Azotobacter dan FPF ke dalam bahan pembawa dilakukan secara aseptik di laminar flow. Sebanyak 5 ml inokulan dimasukkan ke dalam kemasan yang berisi 10 g bahan pembawa menggunakan jarum suntik setelah itu ditutup sehingga tidak memungkinkan terjadinya kontaminasi (Gambar Lampiran 5). Selanjutnya bahan pembawa dalam kemasan diratakan hingga homogen dan diberi label sesuai dengan nama bahan pembawa dan jenis inokulannya. Kemasan-kemasan bahan tersebut dimasukkan ke dalam kotak dan disimpan di dalam ruangan pada suhu kamar (250C).
Masing-masing bahan pembawa (arang batok, zeolit, arang kayu dan gambut Rawa Pening) diinokulasikan satu jenis mikrob, namun pengujian viabilitas inokulan hanya dilakukan pada bahan pembawa arang batok dan zeolit.
3.3.5. Uji Viabilitas Inokulan Selama Masa Penyimpanan
Pengujian viabilitas inokulan hanya dilakukan pada bahan pembawa arang batok dan zeolit sehingga pengujian terdiri dari :
1. Viabilitas inokulan dalam bahan pembawa arang batok
1.1. Viabilitas Azospirillum dalam arang batok steril Sinar Gamma Co-60 1.2. Viabilitas Azospirillum dalam arang batok steril MBE
1.3. Viabilitas Azospirillum dalam arang batok steril autoklaf
1.4. Viabilitas Azotobacter dalam arang batok steril Sinar Gamma Co-60 1.5. Viabilitas Azotobacter dalam arang batok steril MBE
1.6. Viabilitas Azotobacter dalam arang batok steril autoklaf 1.7. Viabilitas FPF dalam arang batok steril Sinar Gamma Co-60 1.8. Viabilitas FPF dalam arang batok steril MBE
1.9. Viabilitas FPF dalam arang batok steril autoklaf 2. Viabilitas inokulan dalam bahan pembawa zeolit
2.1. Viabilitas Azospirillum dalam zeolit steril Sinar Gamma Co-60 2.2. Viabilitas Azospirillum dalam zeolit steril MBE
2.3. Viabilitas Azospirillum dalam zeolit steril autoklaf
2.4. Viabilitas Azotobacter dalam zeolit steril Sinar Gamma Co-60 2.5. Viabilitas Azotobacter dalam zeolit steril MBE
2.6. Viabilitas Azotobacter dalam zeolit steril autoklaf 2.7. Viabilitas FPF dalam zeolit steril Sinar Gamma Co-60 2.8. Viabilitas FPF dalam zeolit steril MBE
2.9. Viabilitas FPF dalam zeolit steril autoklaf
Pengujian dilakukan selama masa penyimpanan dengan periode pengujian pada hari ke-7, hari ke-21, hari ke-42 dan hari ke-70 sehingga masing-masing pengujian dibutuhkan empat sampel bahan.
Uji viabilitas inokulan dilakukan dengan cara memasukkan satu kemasan 10 g bahan pembawa yang berisi 5 ml inokulan ke dalam 90 ml larutan fisiologis
(NaCl 0.85 %), kemudian dikocok selama 15 menit supaya larutan menjadi homogen dan setelah itu membuat seri pengenceran. Masing-masing inokulan ditumbuhkan pada media NFB untuk Azospirillum, NFM untuk Azotobacter dan Pikovskaya untuk FPF lalu diinkubasi selama 3 hari untuk Azotobacter dan FPF, 14 hari untuk Azospirillum. Penghitungan koloni dilakukan setelah diinkubasi.
3.3.5. Uji Sterilitas Bahan Pembawa
Uji sterilitas bahan pembawa dilakukan dengan menghitung total mikrob dalam bahan pembawa arang batok, zeolit, arang kayu dan gambut Rawa Pening yang telah disterilisasi. Media yang digunakan adalah Nutrient Agar. Efektivitas dari sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60, MBE dan autoklaf terhadap bahan pembawa dapat dilihat dengan membandingkan total mikrob sebelum dan setelah sterilisasi.
Pengujian sterilitas dilakukan pada bahan pembawa arang batok, zeolit, arang kayu dan gambut Rawa Pening sehingga pengujian terdiri dari :
1. Uji sterilitas bahan pembawa arang batok
1.1.Uji sterilitas arang batok steril Sinar Gamma Co-60 1.2.Uji sterilitas arang batok steril MBE
1.3.Uji sterilitas arang batok steril autoklaf 2. Uji sterilitas bahan pembawa zeolit
2.1. Uji sterilitas zeolit steril Sinar Gamma Co-60 2.2. Uji sterilitas zeolit steril MBE
2.3. Uji sterilitas zeolit steril autoklaf 3. Uji sterilitas bahan pembawa arang kayu
3.1. Uji sterilitas arang kayu steril Sinar Gamma Co-60 3.2. Uji sterilitas arang kayu steril MBE
3.3. Uji sterilitas arang kayu steril autoklaf
4. Uji sterilitas bahan pembawa gambut Rawa Pening
4.1. Uji sterilitas gambut Rawa Pening steril Sinar Gamma Co-60 4.2. Uji sterilitas gambut Rawa Pening steril MBE
Keseluruhan tahap penelitian dapat diilustrasikan pada Gambar 3 yang dimulai dari persiapan bahan pembawa hingga uji sterilitas bahan pembawa yang telah disterilisasi oleh berbagai metode sterilisasi.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Uji Sterilitas Penggunaan Iradiasi Sinar Gamma Co-60, Mesin Berkas