esensial bagi program pemuliaan untuk memperbaiki karakteristik dari tanaman. Kultur jaringan tanaman merupakan salah satu sumber potensial terjadinya variasi genetik. Variasi yang dihasilkan dengan menggunakan siklus kultur jaringan dinamakan dengan istilah variasi somaklonal oleh Larkin dan Scowcroft (1981). Mereka mendefinisikan siklus kultur jaringan adalah suatu proses mengenai pembentukan (establishment) dan dediferensiasi sel atau organ tanaman pada
kondisi yang telah ditentukan.
Beberapa faktor yang mempengaruhi terjadinya variasi somaklonal diantaranya adalah (Chawla, 2002):
1. Genotipe; genotipe tanaman dapat mempengaruhi terjadinya frekuensi regenerasi dan frekuensi somaklon
2. Sumber eksplan; sumber eksplan yang telah mempunyai kromosom mosaik dan perbanyakan dengan menggunakan batang dapat menghasilkan jumlah kromosom bervariasi.
3. Lamanya pengkulturan; variasi dapat meningkat dengan ditingkatkannya lama pengkulturan.
4. Kondisi kultur; telah diketahui bahwa komposisi ZPT dalam media kultur dapat menyebabkan perubahan frekuensi karyotipik dalam kultur sel. Zat pengatur tumbuh tersebut adalah 2,4-D, NAA, BAP dan lain-lain yang secara umum dapat menyebabkan kromosom bervariasi.
Menurut Chawla (2002), yang menjadi dasar terjadinya variasi somaklonal adalah:
1. Perubahan karyotipe (karyotype changes): perubahan jumlah kromosom pada
berbagai tanaman secara umum berasosiasi dengan menurunnya pembuahan dan merubah rasio genetik pada progeni tanaman dari penyerbukan sendiri. 2. Perubahan pada struktur kromosom; ini terjadi karena delesi kromosom,
duplikasi, inversi dan penyusunan kembali kromosom yang timbal balik dan yang tidak timbal balik yang terjadi antara tanaman yang beregenerasi.
3. Mutasi gen tunggal; mutasi gen tunggal biasanya terjadi pada gen yang resesif. 4. Perubahan genetik sitoplasma, persilangan mitotik dan amplifikasi gen dan
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dimulai oleh
Williams et al. (1990) setelah berhasil mengamplifikasi DNA dan bersifat
polimorfik dengan menggunakan primer acak serta bantuan enzim Taq (Themus aquaticus) DNA polimerase. Teknik ini sudah banyak digunakan para peneliti di
dunia, karena mempunyai beberapa keuntungan. Menurut Williams et al. (1990),
metode RAPD lebih sederhana, cepat, DNA yang diperlukan sedikit dan tidak perlu terlalu murni, tidak menggunakan radioisotop maupun DNA probe, cocok
digunakan untuk sampel banyak, dan cukup menggunakan satu primer.
Teknik RAPD didasarkan pada penggunaan primer sekuens nukleotida yang berubah-ubah untuk mengamplifikasi segmen genomik DNA acak melalui pemanfaatan PCR (Polymerase Chain Reaction) sehingga menunjukkan
polimorfisme. Primer untuk analisis RAPD mengandung 9-10 basa panjangnya. Polimorfisme yang teramati dengan menggunakan RAPD diyakini karena adanya perubahan basa tunggal yang mencegah perpasangan primer dengan sekuens target, delesi sisi utama, insersi atau delesi yang memodifikasi ukuran DNA. Keuntungan dari metode ini adalah bahwa set oligonukleotida yang sama dapat digunakan untuk berbagai spesies atau organisme dan setelah amplifikasi selama 2-4 jam, polimorfisme ini dapat diamati secara langsung dengan agarose normal gel elektroforesis (Nasir, 2002).
Kary Mullis memperkenalkan PCR pada tahun 1983 dan publikasi PCR yang pertama muncul pada tahun 1985. Menurut Muladno (2002), PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada
target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara
puluhan sampai ribuan nukleotida. Teknik PCR memerlukan dNTPs yang mencakup dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP. Teknik RAPD ini juga telah digunakan untuk pemetaan genom, penanda gen dan penelitian kekerabatan tanaman. Analisis ini memerlukan sampel yang lebih sedikit dan tidak memerlukan waktu yang lama, serta pengerjaannya relatif mudah.
19 Dalam analisis RAPD ada empat tahap yang harus dilakukan, yaitu tahap ekstraksi DNA, tahap pengujian kuantitas DNA, tahap amplipfikasi DNA (PCR) dan tahap elektroforesis. Ekstraksi DNA pada prinsipnya adalah suatu proses pengisolasian DNA bahan amplifikasi dengan cara penggerusan dibantu oleh senyawa-senyawa kimia dengan metode tertentu sehingga didapat DNA yang terpisah dari kontaminan. Keberhasilan ekstraksi DNA dapat diketahui dengan pengujian kualitas dan kuantitas DNA. Uji kualitas dan kuantitas DNA dilakukan secara elektroforesis dengan me’running’ DNA pada bak elektroforesis yang
berisi cairan elektrolit. Pada tahap ini semua bahan yang ada dalam larutan DNA dapat terpisah sesuai dengan berat molekulnya masing-masing. Apabila pada UV transilluminator tidak tampak pita DNA, maka kemungkinan besar pengekstrak
tidak berhasil.
Menurut Sambrook (1989), daun yang masih muda dengan berat 0,2-0,3 g cukup untuk menghasilkan DNA sesuai dengan kebutuhan selama analisis. Menurut Kimball (1992), sel berkembang dengan cara menggandakan diri dan memperbesar volume sel. Oleh karena itu semakin muda suatu jaringan daun yang digunakan akan memberikan peluang yang lebih besar dalam menghasilkan DNA dalam jumlah besar dari pada daun yang sudah tua.
Kemajuan dalam pemanfaatan sistem biologi modern tidak terlepas dari prinsip dasar kimia kehidupan. Materi genetik DNA adalah persenyawaan yang terdiri dari gula, fosfat dan basa yang tersusun secara teratur inilah yang menentukan perkembangan dan pertumbuhan suatu organisme dan diturunkan pada generasi berikutnya. Suatu sekuen tertentu dari rantai gula-fosfat-basa ini disebut gen. Gen mengendalikan suatu sifat secara kimiawi melalui kerja enzim- enzim.
Melalui teknik tersebut kita dapat melakukan hal-hal seperti menentukan gen-gen dengan fungsi spesifik, mengisolasi gen yang spesifik tersebut, memasukkan gen spesifik yang kita inginkan ke dalam DNA organisme lain dan gen berekspresi memerintahkan sel inangnya untuk membuat bahan sesuai dengan kodenya (Tim, 1991).
PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah fragmen
kecil template kompleks. PCR merupakan suatu teknik yang sangat kuat dan sensitif yang dapat diaplikasi dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, diagnostik, genetika populasi dan analisis forensik.
PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua oligonukleotida primer yang komplementer dengan ujung 5’ dari kedua untaian sekuens target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR) untuk memungkinkan DNA template dikopi oleh DNA polimerase. Untuk mendukung terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali
diperlukan untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.
Suhu reaksi selanjutnya diturunkan untuk membiarkan terjadinya perpasangan sekuens dan akhirnya reaksi polimerisasi dilakukan oleh DNA polimerase untuk membentuk untai komplementer. Proses ini dikenal dengan siklus PCR (Nasir, 2002). Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda (double helix) (Gambar 6), basa nitrogen dari setiap nukleotida dalam satu
rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen dari setiap rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen (Muladno, 2002).
Gambar 6. Sel, Kromosom dan DNA Heliks Ganda (Anonim, 2006).
Menurut Muladno (2002), ada 5 komponen utama yang dibutuhkan dalam reaksi PCR yaitu 1) DNA target, 2) Primer, 3) Enzim Taq DNA polymerase 4)
dNTP dan 5) Larutan penyangga atau bufer. Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (30-60 detik) dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat, proses tersebut dapat dilihat pada Gambar 7. Ketiga tahapan suhu dan fungsinya adalah sebagai berikut :
21 1. Denaturasi (terbentuk rantai tunggal) suhu 95oC.
Pada tahap pertama ini utas ganda molekul DNA terpisah sempurna dan menghasilkan pita tunggal yang merupakan cetakan bagi primer. Suhu denaturasi biasanya 940 C selama 30 detik atau 970 C selama 15 detik. Dalam Muladno (2002) dinyatakan bahwa denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR.
2. Annealing(penempelan primer) suhu berkisar 50 oC -60oC
Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5 oC dibawah Tm,
dimana formula untuk menghitung Tm= 4(G + C) + 2(A + T). Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.
3. Ekstensi (pemanjangan primer) suhu 72 oC
Selama tahap ini, Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72 oC diperkirakan antara 35 sampai 1000 nukleotida per detik, tergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA (Muladno, 2002).
Gambar 7. Siklus Pembentukan Molekul DNA Baru dalam Proses PCR (Muladno, 2002).
Sub Penelitian I. Kultur Jaringan Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian Kultur Jaringan dilaksanakan di Unit Kultur Jaringan Laboratorium Konservasi Tumbuhan Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Pebruari sampai dengan Nopember 2006.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bibit gaharu berumur 4 bulan yang ditanam di rumah kaca dan planlet gaharu yang berumur 14
minggu hasil kultur in vitro, seperti yang terlihat pada Gambar 8.
B A
Gambar 8. Bahan Tanaman Sebagai Sumber Eksplan.
Keterangan: A: Bibit Gaharu di Rumah Kaca, dan B: Planlet Gaharu dalam Tabung Kultur.
Media dasar yang digunakan adalah Media MS (Murashige & Skoog, 1962) (Lampiran 1), sedangkan ZPT yang digunakan adalah BAP dan TDZ berbentuk bubuk.
Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan gaharu yaitu pinset, gunting,
scalpel, mikroskop binokuler dengan lampu, petridish, kertas tissue, laminar air
23
Metode Penelitian Sumber Eksplan
Sumber eksplan tunas aksilar diperoleh dari bibit gaharu berumur 4 bulan yang ditanam di rumah kaca Laboratorium Konservasi Sumberdaya Hutan Fakultas Kehutanan IPB sedangkan sumber eksplan tunas adventif adalah planlet gaharu yang diperoleh dari Laboratorium Kultur Jaringan Konservasi Sumberdaya Hutan Fakultas Kehutanan IPB. Bagian yang digunakan untuk perbanyakan dari kedua sumber eksplan adalah jaringan meristem dengan 1 primordia daun. Bagan alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 9.
Pohon Induk Sumber Eksplan (Tunas Aksilar) Sterilisasi Pengambilan Bagian Meristem Induksi Tunas Pada Media Perlakuan
Planlet
Sumber Eksplan (Planlet)
Eksplan dipotong Ukuran Lebih Kecil
Sub Kultur 1
Analisis RAPD
Sub Kultur 2 Analisis RAPD
(Genetic Background)
Evaluasi Stabilitas Genetik
Gambar 9. Bagan Alur Penelitian Kultur Jaringan dan Analisis RAPD untuk Evaluasi Stabilitas Genetik
Bahan Sterilisasi Eksplan
Bahan sterilisasi eksplan yang digunakan meliputi: detergen, HgCl2 0,01%,
NaOCl, Alkohol 70%, dan Betadine.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan perlakuan konsentrasi BAP (kontrol; 0,50 ppm; 0,75 ppm; 1,0 ppm) atau TDZ (kontrol; 0,25 ppm; 0,50 ppm; 0,75 ppm), dengan ulangan 3 unit, setiap unit terdiri dari 4 botol, setiap botol ditanam satu eksplan yang berasal dari tunas aksilar atau tunas adventif. Penelitian ini terdiri dari 4 percobaan secara terpisah yang disusun seperti di bawah ini.
Percobaan I:
Konsentrasi BAP : (B0) = Kontrol
(B1) = 0,50 ppm
(B2) = 0,75 ppm
(B3) = 1,0 ppm
Eksplan yang digunakan adalah tunas aksilar
Percobaan II:
Konsentrasi BAP : (B0) = Kontrol
(B1) = 0,50 ppm (B2) = 0,75 ppm (B3) = 1,0 ppm
Eksplan yang digunakan adalah tunas adventif
Percobaan III:
Konsentrasi TDZ : (T0) = Kontrol
(T1) = 0,25 ppm
(T2) = 0,50 ppm
(T3) = 0,75 ppm
Eksplan yang digunakan adalah tunas aksilar
Percobaan IV:
Konsentrasi TDZ : (T0) = Kontrol
(T1) = 0,25 ppm
(T2) = 0,50 ppm
(T3) = 0,75 ppm
Eksplan yang digunakan adalah tunas adventif
Setiap perlakuan diulang tiga kali, setiap ulangan terdiri dari 4 botol, setiap botol ditanam satu eksplan.
25
Model linier aditif dari rancangan tersebut adalah (Mattjik dan Sumertajaya, 2002):
Yij = µ + αi +
ε
iji = 1, 2, ....t (ZPT) j = 1, 2...r (ulangan) Keterangan:
Yij = Nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-i dan ulangan ke-j
µ = Rataan umum
αi = Pengaruh perlakuan ke-i
ε
ij = Pengaruh galat dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-jUntuk mengetahui pengaruh konsentrasi BAP atau TDZ terhadap pertumbuhan kultur dilakukan uji sidik ragam. Apabila F hitung > F tabel, maka percobaan berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95%. Hasil sidik ragam yang memberikan pengaruh nyata dilakukan uji lanjut wilayah berganda Duncan untuk mengetahui pengaruh terbaik konsentrasi ZPT terhadap masing-masing jenis meristem dalam proses induksi dan multiplikasi tunas gaharu. Pengolahan data
menggunakan program SPSS 13.0 for Windows.
Pelaksanaan Penelitian Persiapan Media Perlakuan
Media dasar yang digunakan dalam penelitian ini adalah Media MS (Murashige & Skoog, 1962) yang ditambah dengan ZPT BAP atau TDZ yang telah ditetapkan sebagai perlakuan. Media perlakuan ditetapkan pHnya 5,8 dengan menggunakan beberapa tetes NaOH atau HCl. Selanjutnya ke dalam media ditambah bahan pemadat berupa agar sebanyak 7 g/l dan glukosa (gula) 30 g/l, lalu dipanaskan sampai mendidih, setelah mendidih dituang dalam botol kultur sebanyak lebih kurang 15 ml/botol. Kemudian media disterilisasi dengan
menggunakan autoklaf dengan temperatur 1210C dan tekanan 21 psi (1,5 bar)
selama 30 menit. Setelah media disterilisasi kemudian didinginkan selama satu minggu sekaligus untuk menyeleksi media yang terkontaminasi. Media yang tidak terkontaminasi siap ditanam.
Penanaman Eksplan ke Dalam Media Kultur
Penanaman eksplan yang berasal dari meristem tunas aksilar dilakukan dengan cara memotong pucuk atau tunas aksilar bibit gaharu sepanjang 3 cm menggunakan gunting, daun-daun yang menempel dibuang, kemudian dilakukan sterilisasi dengan detergen cair selama 15 menit, dicuci dengan air mengalir
sampai detergen benar-benar bersih, kemudian direndam dalam HgCl2 0,01 %
selama 7 menit, NaOCl 10%, 7,5% dan 5% masing-masing 15-20 menit kemudian dibilas tiga kali dengan aquades steril, direndam dalam larutan Betadine 2 ml/100 ml selama 10 menit. Selanjutnya dilakukan pengambilan bagian meristem di bawah mikroskop binokuler dengan cara meletakkan pucuk gaharu di dalam cawan petri yang berisi air akuades steril. Bagian meristem yang diambil terdiri dari satu primordia daun kemudian dimasukan ke dalam media kultur sesuai dengan perlakuan yang telah ditetapkan.
Untuk penanaman eksplan yang berasal dari meristem tunas adventif tidak dilakukan proses sterilisasi karena sudah dalam kondisi aseptik, tetapi pengambilan bagian meristem dilakukan di dalam cawan petri yang berisi larutan betadine. Proses pengambilan bagian meristem dilakukan sama dengan proses pengambilan bagian meristem tunas aksilar yang berasal dari rumah kaca yaitu terdiri dari satu primordia daun. Bagian meristem yang diambil dimasukan ke dalam media kultur yang sudah ditetapkan sebagai perlakuan. Semua kultur di
inkubasi pada suhu 25 ± 20C dan diletakan pada rak kultur kemudian ditutup
dengan kertas koran, setelah lima hari kertas koran dibuka dan diberi cahaya lampu neon 40 watt pada photoperiode 16 jam terang dan 8 jam gelap.
Sub Kultur
Sub kultur tunas gaharu dilakukan sebanyak 2 kali dengan menggunakan media dasar MS tanpa penambahan ZPT. Sub kultur ini dilakukan untuk mendapatkan sampel daun yang akan digunakan untuk analisis stabilitas genetik tanaman gaharu guna melihat ada tidaknya perubahan struktur genetik yang terjadi selama proses pengkulturan.
27
Pengamatan dan Pengumpulan Data
Pengamatan dilakukan sejak hari pertama penanaman eksplan ke dalam media kultur, parameter yang diamati meliputi: Persentase pencokelatan (browning), persentase terkontaminasi dan visualisasi perkembangan eksplan, sedangkan pengamatan paramater jumlah tunas per eksplan, tinggi tunas per eksplan, dan jumlah daun per eksplan, dimulai pada minggu kedua setelah tanam. Pengamatan dilakukan pada kedua jenis sumber eksplan tersebut selama 12 minggu.
Sub Penelitian II. Evaluasi Stabilitas Genetik Tempat dan Waktu
Penelitian analisis RAPD dilaksanakan di Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Nopember 2006 sampai Januari 2007.
Bahan dan Alat Analisis RAPD
Bahan tanaman yang digunakan untuk evaluasi stabilitas genetik adalah sampel daun yang berjumlah sebanyak 22 sampel yang terdiri dari 6 sampel yang berasal dari pohon induk, 4 sampel dari sebelum dikultur (2 sampel dari bibit dan 2 sampel dari planlet), 4 sampel hasil kultur, 4 sampel subkultur I dan 4 sampel subkultur II. Sampel diambil dari dua sumber eksplan yang diteliti yang diberi perlakukan BAP 0,5 ppm dan 1,0 ppm. Semua bahan tanaman tersebut berasal dari kebun induk yang ada di Desa Cangkorawok Bogor. Diagram alir pengambilan sampel dapat dilihat pada Gambar 10. Bahan kimia yang digunakan
adalah Buffer TE, PVP (polyvinylpyrrolidone) 2%, agarose, ethidium bromida
(ETBR), buffer ekstrak CTAB, Cloroform IAA, phenol, propanol, NaCl , etanol 100%, Taq Polymerase dan Primer.
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi DNA, elektroforesis dan analisis
RAPD antara lain: tube, gelas piala, gelas ukur, sarung tangan, UV
transiluminator, kamera digital dan alat tulis serta alat-alat yang terlihat pada Gambar 11.
Analisis RAPD untuk Evaluasi Stabilitas Genetik
Pohon Induk (n=6)
Bibit (Bulk Seedling)
Tunas Aksilar
Sub Kultur II (n=2) (D) Sub Kultur II (n=2)
Tunas Adventif
Hasil Kultur (n=2) Hasil Kultur (n=2)
Sub Kultur I (n=2) Sub Kultur I (n=2)
Jaringan Meristematik Dikulturkan Bibit 1 Perlakuan BAP 0,5 ppm (n=1) Bibit 2 Perlakuan BAP 1,0 ppm (n=1) Planlet 1 Perlakuan BAP 0,5 ppm (n=1) Planlet 2 Perlakuan BAP 1,0 ppm (n=1) (C) (A) (B)
Gambar 10. Diagram Alir Pengambilan Sampel mulai dari Pohon Induk hingga Sub Kultur II, dalam Proses Evaluasi Stabilitas Genetik Tanaman Gaharu.
Keterangan: Garis Putus-putus Menunjukkan Pemisahan Tahapan, A: Tahap sebelum Kultur, B: Hasil Kultur, C: Sub Kultur I, D: Sub Kultur II dan n: Jumlah Sampel.
29 B C D E F G H A I
Gambar 11. Alat-alat yang Digunakan untuk Ekstraksi DNA, Elektroforesis dan Analisis RAPD.
Keterangan: A: Mortar dan Pestel, B: Hotplate Stirer dan Neraca Analitik, C: Vortex dan Peltier Thermal Cycler, D: Alat Elektroforesis, E: Tips dan Mikropipet, F: Mikrowave, G: Freezer, H: Desikator dan Sentrifugasi dan I: Waterbath.
Ekstraksi DNA
Potongan daun gaharu berukuran 2 x 2 cm digerus dalam pestel dengan menambahkan Buffer pengekstrak CTAB sebanyak 500 µl dan 100 µl PVP 2%,
kemudian dimasukan ke dalam tube, divortex lalu diinkubasi dalam waterbath
pada suhu 650C selama 60 menit, selama inkubasi setiap 15 menit diangkat dan
dikocok. Selanjutnya sampel didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit dan dicuci dengan menambahkan 500 µl Cloroform IAA dan phenol 10 µl. Campuran digoyang perlahan-lahan dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit. Setelah disentrifugasi supernatan (cairan bagian atas) diambil dan dipindahkan ke tube baru dengan menambahkan lagi 500 µl Cloroform IAA dan phenol 10 µl, dikocok dan disentrifugasi kembali pada 13000 rpm selama 2 menit. Ambil supernatan dan dimasukan ke tube baru, lalu ditambah 500 µl isopropanol dingin
dan NaCl 300 µl, kocok. Simpan dalam freezer selama 60 menit. Selanjutnya sentrifugasi kembali selama 2 menit dan cairan dibuang sehingga yang tertinggal dalam tube adalah pellet DNA. Ditambah etanol 100% sebanyak 300 µl, sentrifugasi kembali dan cairan dibuang lalu dikeringanginkan dalam desikator selama 15 menit.
Uji Kualitas DNA
Selama proses pengeringan pellet DNA, disiapkan agarose 1% (0,33 gram agarose dalam 33 ml TAE). Untuk proses elektroforesis, ditambahkan TE 20 µl pada pellet DNA lalu sentrifugasi, diambil 3 µl DNA ditambahkan 2 µl BJ (Blue Juice) 10 X dan running/elektroforesis pada tegangan 100 volt selama ± 30 menit. Hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan etidium bromide (ETBR)
10 µl per 200 ml aquades selama 3 - 5 menit dan selanjutnya dilihat pada UV
transiluminator.
Seleksi Primer
Sebelum dilakukan proses PCR terhadap DNA gaharu, terlebih dahulu diseleksi primer yang cocok untuk proses amplifikasi, karena belum ada penelitian sebelumnya yang telah mendapatkan primer yang dapat mengamplifikasi DNA
gaharu. Dalam penelitian ini ada 10 primer yang dipilih secara random, yaitu
primer dari golongan OPO dan OPY yang diproduksi oleh Operon Technology.
Sepuluh primer yang digunakan disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1. Sepuluh Primer yang Digunakan untuk Amplifikasi DNA dan Urutan Basanya.
No. Primer Urutan Basa No. Primer Urutan Basa
1. OPO-06 5’CCACGGGAAG’3 1. OPY-02 5’CATCGCCGCA’3
2. OPO-09 5’TCCCACGCAA’3 2. OPY-06 5’AAGGCTCACC’3 3. OPO-10 5’TCAGAGCGCC’3 3. OPY-08 5’AGGCAGAGCA’3 4. OPO-14 5’AGCATGGCTC’3 4. OPY-09 5’GTGACCGAGT’3 5. OPO-18 5’CTCGCTATCC’3 5. OPY-11 5’AGACGATGGG’3
DNA hasil ekstraksi diambil masing-masing 2 µl dicampur menjadi satu kemudian diencerkan dengan 49 µl aquabides. Ambil komponen campuran untuk reaksi PCR ( Master taq 7 µl, Nuclease-free water 2,5 µl, DNA mix masing-
31
masing 2 µl, dan Primer masing-masing 1,5 µl) disentrifugasi selama 5-10 detik. Kemudian dimasukan ke mesin PCR, atur suhu dan tahapan reaksi seperti yang disajikan dalam Tabel 3. Total siklus sebanyak 37.
DNA hasil PCR kemudian dielektroforesis dengan menggunakan agarose 2% (0,30 g agarose, 15 ml TAE) pada tegangan 90 volt selama 30 menit,
selanjutnya dilihat pada UV transiluminator. Primer yang menghasilkan pita atau
jumlah amplifikasi yang terbanyak selanjutnya digunakan untuk amplifikasi DNA dari 16 sampel yang diuji.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Sebelum melakukan amplifikasi PCR, DNA hasil ekstraksi diencerkan dengan aquabides. Perbandingan antara DNA dan aquabides tergantung dari resolusi pita DNA genomik dari hasil ekstraksi (misalnya pengenceran 90x artinya 89 µl aquabides dan 1 µl DNA hasil ekstraksi. Selanjutnya dari hasil seleksi primer, dipilih 2 primer yang digunakan untuk proses amplifikasi DNA.
Empat komponen yang digunakan dalam proses amplifikasi DNA dengan
PCR adalah Green Go Taq (sampel dari bibit dan sampel dari planlet sebelum
hingga sub kultur II) dan HotStar Mix (sampel dari pohon induk) (Tabel 2). Empat
komponen yang telah dicampur disentrifugasi selama 5 menit kemudian dimasukan ke dalam mesin PCR, diatur suhu PCR sesuai dengan tahapan dan siklus reaksi seperti yang terdapat dalam Tabel 3.
Tabel 2. Empat Komponen Bahan yang Digunakan dalam Reaksi PCR.
No. Nama Bahan 1 Sampel Reaksi X Sampel Reaksi
1. H2O 2 µl X x 2 µl
2. Green Go Taq / HotStar Mix 7,5 µl X x 7,5 µl
3. Primer 1,5 µl X x 1,5 µl
Tabel 3. Tahapan dalam Proses PCR
Tahapan Suhu (0C) Waktu (menit) Jumlah Siklus
Pre-denaturation 95 10 1 Denaturation Annealing Extension 95 37 72 1 3 2 35 Final Extension 72 10 1
DNA hasil PCR di elektroforesis dengan menggunakan konsentrasi agarose
2% (0,66 gram agarose dan 33 ml TAE) , di-running pada tegangan 90 volt
selama 45 menit. Kemudian direndam dalam larutan etidium bromide 10 µl per
200 ml aquades selama 3 - 5 menit. Visualisasi fragmen DNA dilakukan pada UV
transiluminator. Seragam tidaknya DNA diamati dari pita yang dihasilkan. Pita DNA diterjemahkan dalam data biner berdasarkan ada tidaknya pita, dengan ketentuan nilai 0 (nol) untuk tidak ada pita, dan nilai 1 (satu) untuk adanya pita pada suatu posisi yang sama dari setiap individu yang dibandingkan. Cara pemberian nilai dapat dilihat pada Gambar 12.
No A B C D E 1 2 3 4 5 6 7 No A B C D E 1 1 0 1 1 0 2 1 0 0 1 1 3 1 1 0 0 0 4 1 0 1 0 0 5 0 1 1 1 0 6 1 0 1 0 1 7 1 1 0 1 0 Diterjemahkan menjadi
Gambar 12. Pola Terjemahan Pita DNA
Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan software Popgene versi
1.31, dan kesamaan antar genotipe ditentukan menurut Nei & Li (1979).
Pengelompokan data matriks dan pembuatan dendogram dilakukan dengan
metode Unweighted Pair Group Method With Arithmetic (UPGMA), fungsi
Similarity Qualitative (SIMQUAL) menggunakan program komputer NTSYSpc versi 2. (Rohlf, 1993).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sub Penelitian I. Kultur JaringanUmum
Kultur jaringan tanaman terdiri dari sejumlah teknik untuk menumbuhkan
organ, jaringan dan sel tanaman secara in vitro sehingga mampu tumbuh menjadi