17 Dokumentasi Penelitian
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Sampel
Hasil maserasi dari 20 kg rimpang temulawak, 18 kg daun meniran, 11 kg daun sambiloto, dan 6 kg rimpang temu ireng, masing-masing dihasilkan maserat (ekstrak) sebesar 200, 150, 150, dan 75 gram. Berdasarkan hasil tersebut, diperoleh rendemen masing-masing ekstrak sebesar
3.333%, 4.285%, 8.823%, dan 3.409% (Tabel 1).
Berdasarkan hasil tersebut, sambiloto memiliki persentase rendemen tertinggi dibandingkan ketiga jenis ekstrak lainnya, yaitu sebesar 8.823%, sedangkan persentase rendemen terendah dimiliki oleh temulawak, dengan nilai sebesar 3.33%. Senyawa bioaktif yang terlarut dalam etanol 96% tersebut diharapkan memiliki aktivitas antioksidan dan potensi hayati yang akan diuji pada tahap selanjutnya. Perbedaan jumlah rendemen pada setiap ekstrak tersebut dikarenakan pada ekstrak dengan rendemen tertinggi mengandung lebih banyak senyawa yang mudah larut dalam etanol 96%, sedangkan ekstrak dengan rendemen yang lebih rendah mengandung sejumlah senyawa yang kurang larut dalam etanol 96%. Ekstrak hasil maserasi dapat dilihat sebagaimana Gambar 6. Tabel 1 Persentase rendemen masing-masing
ekstrak
Jenis ekstrak Rendemen (%)
Temulawak 3.333 Meniran 4.285 Sambiloto 8.823 Temu ireng 3.409
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 6 Ekstrak temulawak (a), meniran (b), sambiloto (c), dan temu ireng (d).
Proses ekstraksi dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya jenis pelarut yang digunakan, dan luas permukaan simplisia. Jenis pelarut yang digunakan tergantung pada polaritas senyawa yang akan diekstrak. Pemilihan etanol 96% sebagai pelarut organik, didasarkan pada kemampuannya untuk mengisolasi sejumlah bahan bioaktif yang lebih optimal dibandingkan beberapa jenis pelarut lainnya. Pemilihan etanol 96% sebagai pelarut memiliki beberapa keuntungan, diantaranya dapat menyebabkan komponen senyawa yang terkandung di dalam sampel dapat terekstrak lebih banyak, karena dapat mengekstrak komponen kimia yang tahan panas dan tidak tahan panas (Harborne 1987). Etanol 96% dapat melarutkan secara keseluruhan semua zat aktif yang terkandung di dalam simplisia, baik yang bersifat polar, semi polar, maupun kurang polar. Menurut Harborne (1996), etanol dapat menarik senyawa alkaloid, steroid, saponin, flavonoid, antakuinon, dan glikosida. Luas permukaan dari simplisia, juga memengaruhi kelarutan sampel di dalam pelarut etanol 96%. Hal tersebut disebabkan karena, semakin kecil ukuran bahan, atau dengan kata lain semakin tinggi luas permukaannya maka peluang interaksi dengan pelarut akan semakin besar (Haryadi 2008).
Uji Aktivitas Antioksidan DPPH Senyawa bioaktif yang terkandung pada setiap sampel, akan bereaksi dengan menyumbangkan satu atom hidrogennya, sehingga akan menghasilkan senyawa DPPH- H yang berwarna kuning (Gambar7). Baris atas pada gambar menunjukkan reagen DPPH sebagai standar (tidak bereaksi dengan sampel), sedangkan baris bawah adalah DPPH-H yang merupakan hasil reaksi antara reagen DPPH dengan senyawa bioaktif.
Daya inhibisi dari masing-masing sampel diukur pada serapan (absorban) 517 nm. Daya inhibisi (IC50) dihitung berdasarkan
pengurangan absorban DPPH sebagai standar terhadap absorban sampel uji (Lampiran 6). Nilai IC50 sebagai parameter aktivitas
antioksidan, merupakan konsentrasi yang dibutuhkan untuk menghambat aktivitas radikal bebas (serapan radikal bebas) sebanyak 50% (Molyneux 2004). Nilai IC50
dari masing-masing sampel diperoleh berdasarkan persamaan garis yang dihasilkan dari hubungan antara persen inhibisi terhadap konsentrasi (Lampiran 7).
Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel ditunjukkan pada
Tabel 2. Semakin rendah nilai IC50 suatu
bahan, maka semakin tinggi aktivitas antioksidannya. Hal tersebut disebabkan, karena hanya dibutuhkan sejumlah kecil konsentrasi sampel untuk meredam 50% radikal bebas DPPH. Hasil penelitian (Tabel 2) menunjukkan bahwa, kombinasi dari keseluruhan ekstrak pada formula 4 (1:1:1:1) memiliki nilai IC50 sebesar 41.875 µg/mL
(setara 41.875 ppm). Sedangkan nilai kombinasi IC50 terendah dimiliki oleh formula
7 (1:0:0:1) yang merupakan kombinasi antara rimpang temulawak dan temu ireng, yakni sebesar 1.923 µg/mL.
Formula 7 memiliki nilai IC50 yang lebih
rendah dibandingkan nilai IC50 ekstrak
tunggal temulawak dan temu ireng. Ekstrak tunggal temulawak (formula 1) dan temu ireng (formula 14), masing-masing memiliki nilai IC50 sebesar 41.699 µg/mL dan 2.507
µg/mL. Penurunan nilai IC50 tersebut diduga
disebabkan oleh peningkatan kadar senyawa antioksidan terlarut pada setiap sampel, akibat perlakuan formulasi. Meskipun formula 7 memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi, namun parameter tersebut belum memenuhi kriteria sebagai obat fitofarmaka yang ditargetkan. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengukuran efek farmakologis dari masing- masing sampel uji melalui uji potensi hayati.
Hasil kombinasi antara ekstrak daun meniran dan daun sambiloto menghasilkan nilai IC50 sebesar 23.788 µg/mL. Nilai IC50
tersebut, lebih rendah apabila dibandingkan nilai IC50 ekstrak daun sambiloto tunggal
(formula 12), namun tidak lebih rendah dibandingkan nilai IC50 ekstrak daun meniran
tunggal (formula 8). Ekstrak tunggal daun sambiloto (formula 12) memiliki nilai IC50
sebesar 86.864 µg/mL, sedangkan ekstrak tunggal daun meniran (formula 8) memiliki nilai IC50 sebesar 4.801 µg/mL. Peningkatan
nilai IC50 tersebut diduga disebabkan oleh
peningkatan jumlah senyawa bioaktif di dalam sampel akibat perlakuan kombinasi dari masing-masing ekstrak.
13
Tabel 2 Nilai IC50 dari masing-masing
formula Formulasi Nilai IC50 (µg/mL) 1 41.699c 2 177.089e 3 170.997e 4 41.875c 5 6.714b 6 5.897a,b 7 1.923a 8 4.801a,b 9 23.788c 10 211.127e 11 24.671c 12 86.864d 13 47.295c 14 2.507a,b Keterangan:
Perlakuan yang memiliki variabel yang sama berarti tidak berbeda nyata (p α = 0.05).
Perlakuan formulasi 3 taraf (melibatkan 3 ekstrak) terdapat pada formula 2 (1:1:0:0), formula 3 (1:1:1:0), formula 5 (1:1:0:1), formula 6 (1:0:1:1), formula 10 (0:1:1:1), formula 11 (0:1:0:1), dan formula 13 (0:0:1:1) dengan nilai IC50 masing-masing sebesar
177.089, 170.997, 6.714, 211.127, 24.671, dan 47.295 µg/mL. Beberapa aktivitas antioksidan formula 3 taraf memiliki nilai IC50 yang lebih
besar dibandingkan formula ekstrak tunggal maupun formula kombinasi 2 taraf.
Peningkatan nilai IC50 tersebut, dapat
disebabkan oleh adanya interaksi berbagai senyawa bioaktif ketika proses formulasi, sehingga menghasilkan suatu produk tertentu yang tidak memiliki kemampuan sebagai donor elektron pada radikal bebas DPPH.
Hasil analisis statistik ANOVA menunjukkan nilai p-value sebesar 0.025 atau bernilai lebih kecil dibandingkan nilai α 5% (Lampiran 8), sehingga dapat diintrepertasikan bahwa, perlakuan formulasi berpengaruh terhadap nilai IC50 yang
dihasilkan. Pengambilan intrepertasi tersebut didasarkan pada hipotesis awal yang menyebutkan bahwa perlakuan formulasi berpengaruh pada nilai IC50 yang dihasilkan.
Blois (1958) diacu dalam Hanani et al. (2005) mengatakan bahwa suatu bahan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat apabila memiliki nilai IC50 kurang dari 200
ppm (setara 200 µg/mL). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, menunjukkan bahwa kombinasi yang dilakukan menghasilkan aktivitas antioksidan yang tinggi, kecuali pada formula10 (0:1:1:1) yang memiliki nilai IC50 sebesar 211.127 µg/mL.
Nilai aktivitas antioksidan yang tinggi disebabkan oleh banyaknya senyawa kimia yang berfungsi sebagai zat antioksidan, seperti flavonoid, kurkumin, xanthorrizol, polifenol, dan lignin yang terkandung di dalam ekstrak masing-masing sampel. Perbedaan nilai IC50
pada masing-masing formula, diduga disebabkan oleh perbedaan jumlah atau kadar senyawa bioaktif terlarut pada setiap formula.
Senyawa bioaktif pada masing-masing tanaman yang diduga berperan sebagai antioksidan diantaranya kurkuminoid, xanthorrizol (pada temulawak), turunan flavonoid, lignin, alkaloid (pada meniran), lakton, saponin, tanin, deoksiandrografolid (pada sambiloto), dan turunan kurkuminoid lainnya (pada temu ireng). Masing-masing senyawa tersebut akan berperan sebagai donor proton pada reagen DPPH, dan menghasilkan produk berupa DPPH-H. Atom hidrogen yang disumbangkan oleh masing- masing senyawa bioaktif akan berikatan dengan atom nitrogen yang terdapat pada cincin hidrazin (Ionita 2003). Reaksi penangkapan atom H oleh reagen DPPH dapat dilihat pada Gambar 8.
Senyawa bioaktif (RH) melepaskan atom H (hidrogen) membentuk produk (R ). Atom hidrogen terlepas akan bereaksi dengan radikal bebas DPPH membentuk produk turunan DPPH-H, atom H akan terikat pada cincin hidrazin yang semula memiliki elektron bebas, sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa bioaktif tersebut memiliki aktivitas antioksidan.
Gambar 8 Prinsip penangkapan H oleh DPPH. Uji Potensi Hayati BSLT
Nilai LC50 dari uji potensi hayati masing-
masing formula, ditunjukkan pada Tabel 3. Penentuan nilai LC50 dilakukan dengan
menggunakan analisis probit pada software SPSS 17. Melalui perangkat tersebut dapat ditentukan hubungan linearitas antara konsentrasi formula terhadap probit kematian dari larva udang. Jumlah letalitas larva udang dihitung secara manual dengan menggunakan
kaca pembesar. Kematian larva udang, disebabkan oleh perlakuan pemberian formula pada konsentrasi 10, 100, 500, dan 1000 ppm (Gambar 9). Hasil perhitungan nilai LC50
masing-masing formula dapat dilihat pada Lampiran 11.
Hasil uji potensi hayati menunjukkan bahwa efek farmakologis tertinggi dimiliki oleh formula 4 (1:1:1:1) dengan nilai LC50
sebesar 31.796 ppm. Efek farmakologis terendah dimiliki oleh formula 14 (0:0:0:1) dengan nilai LC50 sebesar 620.165 ppm.
Rendahnya nilai LC50 pada formula 4 di duga
disebabkan oleh peningkatan jumlah senyawa bioaktif pada sampel, akibat perlakuan kombinasi. Semakin rendah nilai LC50 akan
menunjukkan efek farmakologis yang tinggi, sedangkan semakin tinggi LC50 menunjukkan
bahwa sampel tersebut memiliki efek farmakologis yang rendah. Nilai potensi hayati dari masing-masing ekstrak tunggal diperoleh sebesar 458.912 ppm untuk temulawak, 472.767 ppm untuk meniran, 569.002 ppm untuk sambiloto, dan 620.165 ppm untuk temu ireng. Menurut Juniarti (2009), menyatakan bahwa suatu zat dikatakan memiliki potensi hayati bila memiliki nilai LC50 ≤ 1000 ppm untuk
ekstrak, sedangkan untuk senyawa murni memiliki nilai LC50≤ 30 ppm, sehingga dapat
dikatakan bahwa seluruh sampel memiliki potensi hayati, namun potensi hayati terbaik dimiliki oleh formula 4 (1:1:1:1) dengan nilai LC50 sebesar 31.796 ppm.
Hasil analisis statistik ANOVA, menunjukkan bahwa nilai p-value lebih kecil
dibandingkan nilai α 0.05. Nilai p-value diperoleh sebesar 0.018 dan menunjukkan
hasil yang lebih kecil dibandingkan nilai α
sebesar 0.05 (Lampiran 12). Berdasarkan hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa perlakuan dari masing-masing formula berpengaruh nyata terhadap nilai LC50 yang dihasilkan.
Menurut Meyer et al. (1982) suatu ekstrak turunan dari bahan alam bersifat toksik apabila memiliki nilai LC50 < 1.0 mg/mL.
Pernyataan tersebut didukung oleh hasil penelitian Syahmi et al. (2010) yang menunjukkan bahwa rentang nilai LC50
ekstrak metanol daun kelapa sawit (Elaeis guineensis) antara 3.87 mg/mL hingga 9.00 mg/mL, tidak berkorelasi terhadap pembentukan lesi pada studi histopatologi hati, jantung, paru-paru, dan limfa mencit. Kematian mencit terjadi akibat toksisitas secara akut ekstrak daun kelapa sawit pada konsentrasi 0.195 mg/mL. Sehingga secara keseluruhan hasil formulasi memiliki rentang
nilai LC50 yang aman untuk uji klinis pada
penelitian lanjutan.
Tabel 3 Nilai LC50 dari masing-masing
formula Formula Nilai LC50 (ppm) 1 458.912e,f 2 333.170c,d 3 170.768b 4 31.796a 5 173.941b 6 316.561c,d 7 383.948d,e 8 472.767e,f 9 218.444b,c 10 105.227a,b 11 461.264e,f 12 569.002f,g 13 501.960e,f 14 620.165g Keterangan:
Perlakuan yang memiliki variabel yang sama berarti tidak berbeda nyata (p α = 0.05).
Gambar 9 Uji potensi hayati BSLT. Uji Korelasi Kapasitas Antioksidan dan
Potensi Hayati
Setelah diketahui aktivitas antioksidan dan potensi hayati dari masing-masing sampel, kemudian dilakukan uji korelasi bivarian melalui software SPSS 17. Tujuan dari uji korelasi bivarian adalah untuk mengaitkan dan mengetahui seberapa besar hubungan antara aktivitas antioksidan terhadap efek farmakologis (potensi hayati) dari masing- masing sampel.
Syarat dari obat fitofarmaka yang ditargetkan adalah memiliki korelasi yang baik antara aktivitas antioksidan dan efek farmakologis dari sejumlah sampel yang diuji. Berdasarkan hasil penelitian, diketahui bahwa sampel uji yang memiliki nilai IC50 yang
rendah, ternyata belum tentu memiliki nilai LC50 yang rendah pula.
Formula 4 (1:1:1:1) memiliki hubungan nilai IC50 dan LC50 terbaik dibandingkan
15
dengan formula lainnya. Hasil tersebut dapat dilihat pada Gambar 10, yang menunjukkan bahwa formula 4 (1:1:1:1) memiliki nilai IC50
dan LC50 yang sama rendahnya. Nilai IC50 dan
LC50 dari formula 4 masing-masing sebesar
41.875 ppm dan 31.796 ppm.
Secara garis besar nilai IC50 dan LC50 tidak
memiliki korelasi, seperti yang ditunjukkan oleh nilai IC50 dan LC50 dari masing-masing
ekstrak tunggal, yaitu formula 1, 8, 12, dan 14, namun, perlakuan formulasi menyebabkan beberapa formula memiliki hubungan korelasi pada taraf yang seragam, yakni memiliki nilai pada titik yang hampir sama (Gambar 10).
Berdasarkan hasil uji korelasi secara bivariate, diketahui bahwa nilai IC50 dan LC50
memiliki nilai koefisien korelasi sebesar - 0.328, serta signifikan secara statistik dengan nilai p-value sebesar 0.34. Koefisien korelasi adalah angka yang menggambarkan tingkat keeratan hubungan antara dua peubah atau lebih, sehingga melalui nilai tersebut dapat diintrepertasikan bahwa nilai IC50 tidak
berkorelasi dengan baik, terhadap nilai LC50.
Secara garis besar dapat dikatakan bahwa jumlah senyawa bioaktif yang terdapat pada suatu sampel, belum tentu berpotensi atau memiliki aktivitas antioksidan yang baik.
Gambar 10 Hubungan antara nilai IC50 dengan
nilai LC50.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Formula 4 (1:1:1:1) memiliki hubungan nilai IC50 dan LC50 yang sama rendahnya,
yaitu sebesar 41.875 ppm dan 31.796 ppm. Formula 4 merupakan formula yang memiliki aktivitas antioksidan dan efek farmakologis terbaik dibandingkan formula lainnya. Hal tersebut didasarkan pada hubungan nilai IC50
dan LC50 yang sama rendahnya.
Saran
Perlu dilakukan penelitian yang lebih lanjut, untuk mengetahui secara spesifik senyawa bioaktif apa saja yang terkandung pada setiap formula melalui karakterisasi secara kimia pada masing-masing formula, serta perlu dilakukan pengukuran kadar fenol total pada setiap formula dan dikorelasikan dengan aktivitas antioksidan yang dihasilkan. serta perlu juga dilakukan analisis terhadap aktivitas antioksidan dan efek farmakologis secara in vivo. Selain itu, perlu dilakukan pengukuran nilai absorban dari etanol 96% dan DMSO sebagai kontrol pada analisis aktivitas antioksidan secara DPPH.
DAFTAR PUSTAKA
[BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2005. Gerakan Nasional Minum Temulawak. Jakarta : BPOM RI.
[Komnas Lasia] Komisi Nasional Lanjut Usia. 2010. Penyakit degeneratif [terhubung berkala]. http://www. Komnaslansia.org. id./penyakit degeneratif.html [25 Desember 2010].
Afifah E. 2003. Khasiat dan Manfaat Temulawak. Jakarta: Agromedia.
Aji W. 2009. Uji aktivitas antioksidan tablet effervescent kombinasi ekstrak etanol daun dewandaru (Egenia uniflora L) dan herba sambiloto (Andrographis paniculata Ness) dengan metode DPPH [skripsi]. Surakarta: Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Amelia G. 2006. Potensi rumput mutiara (Hedyotis corimbosa Lam.) sebagai antioksidan alami [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Batubara I. 2009. Anti-acne potency of Indonesian medicinal plants [thesis]. Gifu: United Graduate School, Gifu University. Blois MS. 1958. Antioxidant determination by
the use of stable free radical. Nature 181: 1191-1200.
Cahyaningsih UK, Setiawan, dan Ekastuti DR. 2003. Health-promoting properties of common herbs. Am J of Clinical Nutrition 70: 491-499.
Choudari A, Rangari V, Darvekar V. 2010. Formulation development for treatment and management HIV-AIDS. Int J Pharm Sci 3: 105-108.
Croghan PC. 1957. The osmotic and ionic regulation of Artemia salina. Zoology Journal 10: 219-232.
Damayanti K. 2009. Efek rimpang temu ireng (Curcuma aeruginosa) terhadap derajat kerusakan hati ayam petelur yang diinduksi cacing Ascaridia galli [skripsi]. Surabaya: Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga.
Decker JM. 2000. Introduction to Immunology 11th. Blackwell Science: 1-2. Deng WL. 1978. Preliminary studies on the
andrographis product sodium succinate. Newsletter of Chinese Herb Med 8: 26-28. terhubung http://www. Altcancer.com. Diah SH. 1991.Pembenihan udang galah
Macrobrahium rosenbergi de Man [laporan kerja praktik]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung.
Elfahmi. 2006. Phytochemical and biosynthetic studies of lignands with a focus on Indonesian medicinal plants [thesis]. Nedherlands: Facilitas Beddrif of Gronigen.
Fenton J. 2002. Toxicology : A Case Oriental Approach. Boca Raton; ORC Pr.
Finney DJ. 1971. Probit Analysis 3rd Ed. England: Cambridge University Press. Frank CL. 1995. Toksikologi Dasar. Edi,
penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari Basic of Toxicology
Gad SC. 2007. Animal Modeling in Toxicology: 2nd Edition. Boca Raton: ORC Pr.
Hafidz AF. 2003. Aktivitas anti-radikal bebas DPPH fraksi metanol Fagreaea auriculata dan Fagreaea ceilanica. Majalah Farmasi Airlangga III: 1 April 2003.
Halliwell B, Gutteridge JMC. 1989. Free Radical In Biology and Medicine. Ed ke-2. New York: Oxford University Press.
Hanani E, Munim A, Sekarini R. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian 3: 127- 133.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: ITB Press.
Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia. Ed ke- 2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung: ITB Press. Terjemahan dari: Phytochemical Method.
Haryadi Y. 2008. Pengaruh jenis pelarut, nisbah bahan baku pelarut dan waktu ekstraksi pada bioaktivitas ekstrak daun Aglia elliptica [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Heldt W. 2005. Plant Biochemistry. London: Elsevier.Inc.
Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya.
Hiriguchi H, Saito T, Okamura N, Yagi A. 1995. Inhibition of lipid peroxidation and superoxide generation by diterpenoid from Rasamarinus officinalis. Planta Medica 61: 333-336.
Hwang JK, Shim JS, Pyun YR. 2000. Antibacterial activity of xanthorrizol from Curcuma Xanthorriza againts oral pathogens. Fitotherapia 71: 321-323. Ionita P. 2003. Is DPPH stable free radical a
good scavenger for oxygen active species. Chem Pap 59: 11-16.
Irawati I. 2008. Perbandingan metode penentuan aktivitas antioksidan rimpang temulawak [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Jarukamjorn K, Nemoto N. 2008. Pharmacological aspect of Andrographis paniculata on health and its major diterpenoid constituent. Journal of Health Science 54 (4): 370-381.
Juniarti, Osmeli D, Yuhernita. 2009. Kandungan senyawa kimia, uji toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan
17
antioksidan DPPH dari ekstrak daun Abrus precatorius. Makara Sains 13: 50-54.
Kardian A, Kusuma FR. 2004. Meniran Penambah Daya Tahan Tubuh Alami. Jakarta: Agri Pustaka.
Koleva I, van Beek T, Linnssen JPH, de Groot A, Evstarieva LN. 2002. Screening of plant extracts for antioxidant activity: a comparative study on three testing methods: Phytochem Anal 13: 494-500. Kumalaningsih S. 2007. Antioksidan sumber
dan manfaatnya. Antioxidant Centre.
[terhubung berkala].
http://www.antioxidant centre.com. Kuncahyono I, Sunardi. 2007. Uji aktivitas
antioksidan ekstrak belimbing wuluh (Averhoa bilimbi. L) terhadap 1,1- diphenyl-2- picrilhidrazyl (DPPH). Seminar Nasional Teknologi:1-9.
Langseth L. 1995. Antioxidant and Their Effect on Health. Di dalam: Schmidl MK, P Labuza, editor. Essentials of Functional Food. Maryland: An Aspen Publication.
Liza. 2010. Temulawak, dari uji empiris hingga uji klinis. Mitra Sehat Alami Keluarga. [terhubung berkala]. http//www. Lizaherbal.com/main. Lestari TA. 2010. Profil kimiawi ekstrak
ramuan kunyit, temulawak, dan meniran berdasarkan aktivitas antioksidan [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Lupea AX, Chambire D, Iditoiou C, Szabro MR. 2006. Short communication improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric Assay. Chem Pap 3: 214-216.
Marpaung IM. 2008. Potensi aktivitas antioksidan pada kulit kayu dan daun tanaman akway (Drymis sp) [skripsi]. Bogor: Fakultas matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Mattjik A dan Sumertajaya I. 2006. Rancangan Percobaan. Bogor: IPB Press.
McLaughlin et al. 1991. “Bench top” bioassay for the discovery of bioactive natural product: An update. Di dalam Atta-Ur- Rahman (Ed). Studies in Natural Product Chemistry. Elsevier: Amsterdam.
Mc Laughlin, Rogers L. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Information Journal. Vol 32: 513- 524.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putman JE, Jacobson LB, Nichol DE, Mc Laughin JL. 1982. Brine Shrimps: A convenient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica 45: 31-34.
Molyneux P. 2004. The use of stable free radical dyphenilpicryl-hydrazil (DPPH) for estimating antioxidant activity. J. Sci. Technol: 211-219.
Moss B. 1937. Ecology of Fresh Waters. Norwich: Anglia.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwel VW. 2003. Biokimia Harper. Andry Hartono, penerjemah. Anna P Bani & Tiara MN, editor. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.
Nuratmi B, Adjirni, Paramitha DL. 1996. Penelitian farmakologis sambiloto (Andrographis paniculata). Warta Tumbuhan Obat Indonesia 3: 23. Jakarta: Pokjanas.
Nurcholis W. 2008. Profil senyawa penciri bioaktivitas tanaman temulawak pada agrobiofisik berbeda [tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Percival M. 1998. Antioxidants. Clinical Nutrition Insight : 1-4.
Philip K, Nurestry S, Sani W, Shin KS, Kumar S, Lai HS, Serm LG, Rahman S. 2009. Antimicrobial activity of some medicinal plants from Malaysia. American of Journal Applied Science 6: 1613-1617.
Planthus. 2008. Temu hitam (Curcuma aeruginosa Roxb.). terhubung http://www. iptek.net.id/html.
Priyototmo G. 2007. Kandungan umum air laut [terhubung berkala]. http://gudang- e-bookformaterialscience.
Puri A, Saxena RP, Saxena KC, Srivastava V, Tanden JS. 1993. Immunostimulant agent from Andrographis paniculata. J Nat Prod July 56 (7): 995-999. http://www.rechnature.com/products/her bal/articles/Aleanson.html.
Purwakusumah W. 2007. Artemia Salina (Brine Shrimp). [terhubung berkala]. http://www. O-fish.com/artemia/php. Puspita MDA. 2009. Pengoptimuman fase
gerak KLT menggunakan desain campuran untuk pemisahan komponen ekstrak meniran (Phyllanthus niruri) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Rahman F, Logawa ED, Hegartika H, Simanjutak P. 2008. Aktivitas antioksidan ekstrak tunggal dan kombinasinya dari tanaman Curcuma spp. J Ilmu Farmasi Indonesia 6: 69-74.
Rukayadi Y, Yong D, Hwang JK. 2006. In vitro Anticandidal of xanthorrizol isolated from Curcuma xanthorriza Roxb. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 57: 1231-1234.
Sanubari T. 2010. Toksisitas dan profil kimiawi ekstrak ramuan meniran, kunyit, dan temulawak [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Sari Y. 2007. Kajian proses pengayaan virgin oil dengan ekstrak zat pigmen dari temulawak, kunyit, dan angkak serta aplikasinya pada penggorengan bahan pangan [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Setiarto HB. 2009. Deteksi dan uji toksisitas LC50 senyawa aflatoksin B1, B2, G1, G2
pada kacang tanah (Arachis hypogeal L) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor. Subekti S. 1990. Khasiat pemberian rimpang
temulawak (Curcuma xanthorriza
Roxb.) terhadap ascaridiasis pada ternak ayam. Lembaga Penelitian Universitas Airlangga.
Sugiharto. 2004. Pengaruh infus rimpang temulawak (Curcuma Xanthorriza Roxb.) terhadap kadar hemoglobin dan jumlah eritrosit tikus putih yang diberi larutan timbal nitrat [Pb(NO3)2]. Jurnal
Hayati Berkala 10: 53-57.
Suhirman S dan Winarti C. 2010. Prospek dan fungsi tanaman obat sebagai imunomodulator. Bogor: Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik & Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. Sunarni T. 2005. Aktivitas antioksidan
penangkap radikal bebas beberapa kecambah dari biji tanaman familia papilanoceae. Jurnal Farmasi Indonesia 2: 53-61.
Supriadi D. 2008. Optimalisasi ekstraksi kurkuminoid temulawak (Curcuma Xanthorriza Roxb.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Syahmi M, Vijayarathna S, Sasidharan S, Latha Y, Kwan P, Lau L, Shin N, Chen Y. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elais guinnesis Jacq (Oil Palm Leaf) methanol exctract. J Molecules 10: 8111-8121.
Thyagarajan SP, Subramanian T, Venkateswaran, dan Blumberg BS. 1988. Effect of Phyllantus amarus on chronic cariers of hepatitic B virus. The Lancet. 764-766.
Tjandrawinata RR, Maat S, dan Noviyanty D. 2005. Effect of standarized Phyllantus niruri extract on changes in immunologic parameters: corelation between pre-clinical and clinic studies. Medika XXI (6): 367-371.
Tyzard I. 1987. Pengantar Imunologi Veteriner. Soehardjo Harjosworo, penerjemah. Terjemahan dari: Inttroduction to Veterinary Immunology 3: 18-25.
19
West G. 1995. Black Veterinary Dictionary 18th Ed. London: A & C Black.
Widyastuti N. 2010. Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode Cuprac,