Radikal Bebas dan Antioksidan
HASIL DAN PEMBAHASAN Fraksi Lipoprotein Densitas Rendah (LDL) M. fascicularis
Hasil isolasi LDL menunjukkan adanya peningkatan protein LDL setelah monyet ekor panjang (MEP) diberi pakan aterogenik selama 3 bulan. Kondisi ini adalah normal akibat pemberian pakan dengan kolesterol tinggi karena konsentrasi kolesterol darah tergantung dari banyaknya kolesterol yang diperoleh dari makanan maupun dari sintesa de novo. Mekanisme reseptor LDL memegang
68 peranan penting dalam mendegradasi kolesterol di hati. Kolesterol disekresikan ke dalam kantong empedu untuk diubah menjadi empedu. Pembentukan kolesterol de novo di hati diatur oleh aktivitas enzim HMG-SKoA reduktase, dimana diet kolesterol dapat menurunkan aktivitas enzim tersebut (Hortan et al. 1996).
Pengaturan homeostasis plasma kolesterol diatur oleh reseptor LDL yang terdapat di hati dan sel non hepatik. Adapun jumlah reseptor LDL ini bervariasi bergantung pada sel non hepatik (Brown & Goldstein 1986). Jumlah protein LDL (mg/ml) diukur dengan menggunakan uji Lowry dan BSA (1 mg/ml) sebagai standar. Berdasarkan hasil penelitian, terjadi peningkatan konsentrasi total protein kolesterol setelah hewan diberi pakan aterogenik selama 3 bulan. Protein kolesterol yang diperoleh ini digunakan untuk pengukuran aktivitas kolesterol terhadap sel seluler.
Jumlah protein LDL hasil isolasi dari ke 5 MEP sebelum diberi pakan aterogenik diperoleh 2,30 mg /ml sebanyak 7 ml (A). Setelah diberi pakan pakan aterogenik selama 3 bulan diperoleh protein LDL 5,31 mg sebanyak 9 ml (B). Peningkatan total kolesterol dibandingkan dengan konsentrasi awal disebabkan pengaruh pakan aterogenik yang diberikan pada MEP selama 3 bulan. Rerata jumlah protein LDL disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Rerata jumlah lipoprotein (mg/ml) plasma darah monyet ekor panjang (MEP)
No Hasil Isolasi Plasma darah
A B 1 2 3 4 5 Kolesterol total Kolesterol LDL Kolesterol HDL Trigliserida Protein LDL 82,00 84,00 23,00 36,00 32,00 41,00 43,00 38,00 2,30 5,31 Keterangan: A: plasma darah diambil sebelum MEP diberi pakan aterogenik; B: plasma darah diambil setelah MEP diberi pakan aterogenik
Monyet ekor panjang biasa digunakan sebagai hewan model untuk penyakit kronis. Aterosklerosis terkait dengan metabolisme lipid, lipoprotein dengan MEP sebagai hewan model, dikarenakan anatomis serta ukuran arteri koronaria yang sama dengan manusia. Keunggulan lainnya adalah ukuran hewan lebih kecil dan lengkap informasinya. Monyet ekor panjang bila diovariektomi dan diberi pakan aterogenik selama tiga bulan akan mengalami peningkatan
69 konsentrasi total kolestrol plasma dan kolesterol densitas tinggi. Bila pemberian pakan diperpanjang sampai satu tahun akan mengalami aterosklerosis pada arteri koronaria (Adam et al 1985; Wiliam & Suparto 2004).
Kultur Primer Makrofag Peritoneal Mencit dan Makrofag Sel Darah Putih Beruk
Metode isolasi sel yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan cara yang berbeda antara makrofag mencit dan beruk. Isolasi makrofag mencit menggunakan asam tioglikolat. Asam tioglikolat digunakan untuk merangsang pembentukkan udema di dalam rongga perut (abdomen) mencit. Sedangkan makrofag yang berasal dari beruk diperoleh dengan cara memisahkan sel darah merah dari sel darah putih menggunakan Lymphocite Separation Medium (LSM) sehingga diperoleh monosit. Berdasarkan pengamatan selama menumbuhkan sel makrofag, ternyata makrofag beruk lebih cepat mati dibandingkan dengan makrofag mencit yang terlihat ketika sel makrofag dikultur. Hal ini diduga disebabkan oleh adanya perbedaan fisiologi sel makrofag sehingga mempengaruhi cara hidup dari sel makrofag(Gambar 14).
Gambar 14 Bentuk sel monolayer makrofag peritoneal mencit (A) dan sel darah putih beruk (B), perbesaran 278 kali.
Hasil isolasi makrofag peritoneum mencit dan beruk memperlihatkan bentuk sel yang berbeda. Monolayer makrofag mencit memiliki komposisi lebih longgar dibandingkan dengan monolayer makrofag sel darah putih beruk pada pasase ke-3. Jumlah makrofag mencit (20 ekor) dan beruk (3 ekor; 100 ml darah) yang diisolasi, berturut-turut diperoleh sebanyak 19,9 x 106 dan 9,2 x 106. Baik makrofag mencit maupun beruk, dapat tumbuh dengan baik dalam medium
70 DMEM/RPMI yang mengandung FBS 10%. Makrofag dapat tumbuh dengan baik setelah setelah 24 jam dan siap digunakan untuk percobaan berikutnya.
Makrofag merupakan turunan dari sel darah putih (monosit) yang berfungsi sebagai pemangsa dan penyaji sel antigen (antigen–presenting cells, APC) yang mensekresikan sitokina, kemokin, molekul pengatur pertumbuhan, metaloproteinase dan enzim hidrolitik lainnya. Kemampuan makrofag dalam menghasilkan sitokina contohnya TNF-IL1 dan Transforming Growth Factors
(TGF); enzim proteolitik contohnya metaloproteinase dan faktor pertumbuhan seperti Platlet Derivate Growth Factor (PDGF) dan Insuline-like Growth Factor 1 yang bertanggungjawab pada kerusakan dan perbaikan lesi aterosklerosis (Argmann et al. 2001; Ross 1999).
Efek Perbedaan Sel Makrofag terhadap Tingkat Oksidasi LDL
Data pada percobaan 1 dari gambar 15, menunjukkan sel makrofag mencit dan beruk yang diinkubasi dalam medium pertumbuhan selama 4 jam tanpa ditambahkan apapun ternyata menghasilkan MDA. Konsentrasi MDA pada mencit 3,2 % lebih tinggi dibandingkan dengan beruk. Hal ini menunjukkan bahwa sel makrofag mencit mempunyai reaktivitas lebih tinggi dibandingkan dengan sel makrofag beruk (P<0,01).
Perbedaan konsentrasi MDA ini disebabkan cara mengisolasi makrofag yang berbeda. Sel makrofag beruk diisolasi dari sel darah putih tanpa diberi perlakukan apapun, sedangkan sel makrofag mencit diisolasi dengan cara: mencit diinjeksi dengan asam tioglikolat secara intraperitoneal (Aviram et al. 2000). Kemungkinan yang lain adalah LDL yang digunakan dalam percobaan berasal dari plasma darah yang diisolasi dari monyet ekor panjang. Secara biologis, baik monyet ekor panjang maupun beruk mempunyai kesamaan bentuk anatomi dan fisiologis. Monyet ekor panjang peka terhadap pakan yang dapat menginduksi aterosklerosis pada arteri koronaria. Distribusi, karakter dan keparahan lesi aterosklerosis mirip juga dengan manusia (Clarkson et al. 1996). Dengan demikian LDL monyet yang diinkubasi ke dalam kultur sel makrofag beruk hanya sedikit memicu reaksi oksidasi. Sedangkan pada sel makrofag mencit yang diinkubasi dengan LDL monyet, reaksi oksidasi yang terjadi menjadi lebih besar.
71 Pada percobaan 2 digunakan untuk menentukan apakah inkubasi LDL dengan sel menyebabkan LDL teroksidasi. Disini terlihat bahwa nilai MDA dari masing-masing perlakuan konsentarsinya berbeda. Pada kontrol, partikel LDL yang diinkubasikan tanpa diberi sel makrofag diperoleh konsentrasi MDA sebesar 2,09 nmol/mg protein LDL. Konsentrasi MDA ini lebih rendah jika dibandingkan dengan LDL yang diinkubasikan dalam sel makrofag mencit sebasar 19, 95 dan 7, 89 untuk sel makrofag beruk. Hasil perhitungan persentase terhadap LDL yang diinkubasi dengan sel makrofag mencit, konsentrasi MDA lebih tinggi 5,8 % dibandingkan dengan sel makrofag beruk. Kondisi ini disebabkan sel makrofag mencit lebih aktif dibandingkan sel makrofag beruk. Disamping itu, sel makrofag yang diinkubasi dengan LDL dapat meningkatkan konsentrasi oksidasi LDL dibandingkan dengan LDL yang hanya diinkubasi dalam medium pertumbuhan (P<0,01)
Menurut Packard & Libby (2008) menyatakan bahwa, monosit yang berada dalam peredaran darah dapat berdiferensisai menjadi makrofag dan berada di intima. Dalam percobaan, makrofag yang berasal dari monosit beruk dapat juga dioksidasi oleh ion Cu2+. Peran penting makrofag adalah memediasi respon peradangan dan sebagai penyaji antigen (antigen-independent/innate).
Percobaan 3 dilakukan untuk melihat efek ion Cu2+ terhadap reaksi oksidasi LDL yang menghasilkan derajad oksidasi. Konsentrasi MDA sebesar 33,15 nmol/mg protein LDL untuk kontrol. Sedangkan untuk sel makrofag mencit yang diinkubasi dengan LDL dan ion Cu2+ diperoleh konsentrasi MDA sebanyak 36,77 nmol/mg protein LDL, dan sel makrofag beruk sebanyak 27,11 nmol/mg protein LDL. Bila dilihat dari nilai konsentrasi MDA antara sel makrofag mencit dan beruk, maka konsentrasi MDA makrofag mencit nilainya lebih tinggi 2,8 % dibandingkan makrofag beruk. Ion Cu2+ yang diinkubasi dengan LDL dan sel mampu meningkatkan reaksi oksidasi lipid. Bila dilhat dari percobaan 2 dan 3, dapat disimpulkan bahwa makrofag mencit mempunyai reaktivitas terhadap oksidasi LDL dibandingkan dengan makrofag beruk dengan p(<0,01).Namun bila dilihat dari kontrol, maka ion Cu2+ cukup tinggi dalam memberikan andil terejadinya reaksi oksidasi LDL pada sel makrofag.
72 Holvoet et al. (1994) menyatakan bahwa, makrofag dapat memproduksi radikal bebas sebagai efek dari ion Cu2+ yang dapat menimbulkan stres oksidatif terhadap sel yang dikultur secara in vitro. Selanjutnya dikatakan, makrofag berperan penting dalam kejadian aterosklerosis dan metabolisme lipoprotein. Pada aterosklerosis, akumulasi lipid yang teroksidasi akan ditangkap oleh mkrofag melalui reseptor scavenger. Mertens dan Holvoet (2001) menyatakan bahwa makrofag yang teraktivasi akan mensekresi mieloperoksidase untuk menghasilkan spesies reaktif yang nantinya akan mengoksidasi protein maupun lipid.
Keterangan: Percobaan 1 Percobaan 2 Percobaa Kontrol LDL LDL+ Cu2+ Makrofag mencit LDL+ Sel LDL+ Cu2+ Sel Makrofag beruk LDL+ Sel LDL + Cu2+ Sel Grafik 15 Efek Makrofag dan ion Cu2+ terhadap oksidasi LDL
yang diinkubasi selama 4 jam
Menurut Steinberg (1993), Riemersma (1994) dan Swhwenke (1998), proses oksidasi LDL diduga dimulai ketika oksigen reaktif mengambil atom hidrogen dari asam lemak tidak jenuh yang ada di dalam partikel LDL sehingga terbentuk lipid peroksida dan radikal aloksi. Selanjutnya akan menginisiasi oksidasi asam lemak disekitarnya. Apabila antioksidan di dalam LDL tidak mencukupi untuk mengeliminasi lipid peroksida yang terbentuk maka propagasi lipid terjadi, sehingga terbentuk aldehid, keton dan produk lain yang reaktif yang akan mengikat residu lisin dalam apolipoprotein B-100. Perubahan metabolit yang terbentuk ini disebabkan terbentuknya interaksi lipid-lisin dan merubah muatan
73 listrik LDL sehingga akan terbentuk epitop baru. Kondisi ini mempengaruhi fungsi biologis negatif LDL seperti aterogenik.
Partikel LDL dapat dioksidasi oleh ion metal, lipoksigenesis, mieloperoksidase dan spesies nitrogen reaktif. Secara in vitro, proses oksidasi– LDL oleh ion logam (Cu2+) terdapat tiga fase, yaitu inisiasi fase lag (mengambil antioksidan endogen), fase propagasi (dengan cepat terjadi oksidasi dari asam lemak tidak jenuh menjadi lipid hidroksiperoksida) dan fase dekomposisi (hidroksiperoksida diubah menjadi aldehid yang reaktif seperti malodialdehida, 4-hidroksinonenal). Interaksi yang terjadi antara aldehid dengan group ε-amino dari residu lisin yang bermuatan positif akan mengubah LDL menjadi bermuatan negatif. Efek yang ditimbulkan menyebabkan penurunan afinitas reseptor LDL namun afinitas reseptor scavenger makrofag meningkat. Partikel LDL yang teroksidasi dapat meningkatkan kejadian aterosklerosis dan penyakit jantung koroner (PJK).
Pengaruh Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga terhadap tingkat Oksidasi LDL
Pembentukan produk oksidasi MDA sangat dipengaruhi oleh lamanya waktu inkubasi dengan ion Cu2+. Semakin lama waktu inkubasi semakin banyak produk oksidasi LDL akan terbentuk. Data pada Tabel 7 memperlihatkan bahwa oksidasi LDL yang diinduksi oleh ion Cu2+ tanpa ekstrak yang diinkubasiselama 4 jam cenderung nilainya lebih rendah dibandingkan dengan yang inkubasi 6 jam, tetapi tidak signifikan (P>0,05). Pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga sebesar 2 - 8 ppm menyebabkan penurunan konsentrasi MDA dibandingkan dengan kontrol tanpa kurkuminoid, baik yang diinkubasi selama 4 jam maupun 6 jam (P<0,01).
Gambar 16 menunjukkan adanya peningkatan hambatan oksidasi LDL yang seiring dengan meningkatnya konsentrasi kurkuminoid, yakni sebesar 27,07% (inkubasi 4 jam) dan sebesar 21,21% pada inkubasi 6 jam dengan konsentrasi 8 ppm. Hal ini mengindikasikan bahwa kurkuminoid cukup kuat dalam menekan reaksi oksidasi LDL (P<0,01). Kurkuminoid yang ditambahkan dapat berfungsi mencegah ion Cu2+ dalam menginduksi peroksidasi lipid. Sesuai
74 pendapat yang dikemukan oleh Sreejevan & Rao (1997), bahwa LDL yang dioksidasi ion metal (Cu2+) dapat dihambat oleh kurkumin, namun aktivitas bisdemektoksi-kurkumin menjadi menurun.
Holvoet et al. (1994) menyatakan bahwa makrofag yang hanya diinkubasi dengan LDL normal secara in vitro tidak akan memproduksi sel busa, Keadaan ini akan berbeda apabila makrofag terakumulasi dengan LDL yang teroksidasi, sehingga dengan cepat ditangkap oleh reseptor scavenger. Salah satu sifat reseptor scavenger dari makrofag mempunyai spesifikasi ikatan dengan ligan yang luas. Ligan-ligan yang dapat diikat oleh reseptor scavenger dengan afinitas tinggi seperti: LDL terasetilasi, LDL teroksidasi, beberapa polinukleotida, beberapa polisakarida, fosfolipid terterntu dan lipopolisakarida bakteri. Menurut Mahlberg
et al. (1990) akumulasi kolesterol dalam makrofag akan menyebabkan pembentukan sel busa. Sel busa ini kemudian akan mensekresikan faktor pertumbuhan dan sitokina sehingga merangsang proliferasi sel otot polos dan pembentukan sel busa oleh sel-sel otot polos (Vijayagoval dan Glancy 1996). Tabel 7 Efek kurkuminoid temu mangga pada oksidasi LDL yang diinduksi
dengan ion Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg protein LDL)
Inkubasi 4 jam Inkubasi 6 jam
LDL 3 2,09 ±0,008 33,15±0,139 A 31,59±0,080 B 27,81±0,216 C 24,18±0,169 D 2,84±0,02 38,29A±0,28 33,53B±0,30 31,07C±0,14 30,18D±0,31 LDL+ Cu2++ E0 3 LDL+Cu2+ + E2 3 LDL+ Cu2++ E6 3 LDL+ Cu2++ E8 3
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid 2 ppm; E6 : 6 ppm, E8 8 ppm
Gambar 16 Penghambatan oksidasi LDL yang diinduksi ion Cu+2 oleh kurkuminoid pada
75 Pengaruh Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga terhadap Reaksi Oksidasi Lipid dalam Makrofag yang Diinduksi oleh Cu2+
Makrofag Mencit. Analisis malonaldehid (MDA) mengindikasikan terjadinya peningkatan peroksidasi lipid di dalam sel makrofag. Senyawa logam memegang peranan penting dalam pembentukkan oksidan yang dapat menginisiasi peroksidasi. Katalisasi-logam yang dihasilkan oleh radikal bebas merupakan faktor penting dalam progresi suatu penyakit (Halliwell & Gutteridge 1995).
Pengaruh kurkuminoid esktrak temu mangga dan lama waktu inkubasi terhadap reaksi oksidasi oleh sel makrofag mencit yang diinduksi dengan ion Cu2+ disajikan pada Tabel 8. Data menunjukkan bahwa ion Cu2+ dapat meningkatkan proses oksidasi di dalam sel makrofag mencit. Oksidasi lipid yang terbentuk pada sel makrofak tanpa kurkuminoid sebanyak 10,04±0,451 (inkubasi 4 jam) dan 10,64±0,11 (inkubasi 6). Keadaan ini berbeda ketika sel makrofag mencit diinkubasi dengan ion Cu2+5μM yang sebelumnya telah dipra-inkubasi dengan kurkuminoid selama 48 jam. Penambahan ion Cu2+5 μM meningkatkan proses oksidasi di dalam sel hampir 3 kali lipat. Peningkatan konsentrasi MDA menandakan oksidasi lipid yang terjadi di dalam sel makrofag meningkat. Sebagai kontrol dalam percobaan ini, sel makrofag mencit diinkubasi dengan ion Cu2+ tanpa kurkuminoid oksidasi lipid yang terbentuk sebanyak 2,2 % (4 jam) dan 2,3%. Hal ini menunjukkan bahwa waktu inkubasi tidak banyak mempengaruhi proses oksidasi lipid di dalal sel makrofag (P>0,05). Namun kenaikan oksidasi lipid ini dapat dihambat dengan pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga sebanyak 2 ppm. Penghambatan oksidasi lipid oleh kurkuminoid meningkat dengan ditingkatkan dosis kurkuminoid, baik pada sel makrofag yang diinkubasi 4 jam maupun 6 jam. Secara statistik, penurunan konsentrasi MDA sangat bermakna (P<0,01).
Pra-inkubasi sel makrofag dengan kurkuminoid kurkuminoid 8 ppm selama 48 jam, ternyata menghambat proses oksidasi selular hingga 23,29 % (P<0,01). Hasil analisis ragam (anova) menunjukkan bahwa lama inkubasi mempengaruhi reaksi oksidasi lipid di dalam sel makrofag terutama pada perlakuan yang diberi kurkuminoid 2 ppm dan 6 ppm (P<0,01). Sedangkan pada
76 percobaan yang diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga 8ppm dan di antara 4 jam dan 6 jam tidak ada perbedaan (P>0,05).
Penghambatan oksidasi LDL di dalam sel makrofag mencit yang diinduksi dengan ion Cu2+ akibat pemberian kurkuminoid hingga 23,29% (Gambar 17), yakni pada konsentrasi kurkuminoid 8 ppm (inkubasi 4 jam). Pola yang sama terlihat pada inkubasi 6 jam sebesar 19,82 %, namun penghambatannya tidak sebesar pada inkubasi 4 jam. Dalam percobaan ini, penghambatan oksidasi lipid dalam sel makrofag mencit tertinggi terjadi pada dosis kurkuminoid 8 ppm. Rao (1995) menyatakan bahwa kurkuminoid terutama kurkumin merupakan senyawa aktif yang banyak terkandung dalam temu-temuan berfungsi sebagai antioksidan, dan dapat menghambat proses oksidasi lipid serta menghambat proses degradasi oksidatif DNA.
Tabel 8 Efek kurkuminoid temu mangga terhadap reaksi oksidasi dalam sel makrofag mencit yang diinduksi ion Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg protein LDL) Inkubasi 4 Jam Inkubasi 6 jam
Sel 3 10,04±0,451 33,70±2,09 A 28,36±1,15 B 27,78±0,51 B 25,85±0,19 B 10,64±0,11 34,33±0,01 A 33,93±0,71 A 31,82±0,27 AC 27,57±2,64 BC Sel + Cu2+ + E0 3 Sel + Cu2+ + E2 3 Sel + Cu2++ E6 3 Sel + Cu2++ E8 3
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid konsentrasi 2 ppm; E6 : 6 ppm, E8 8 ppm
Gambar 17 Penghambatan oksidasi LDL dalam makrofag mencit yang diinduksi ion Cu2+ dan kurkuminoid selama 4jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm).
77 Menurut Quiles et al. (2002), kurkuninoid yang diisolasi dari Curcuma longa dapat menghambat peroksidasi lipoprotein secara invitro pada makrofag dan in vivo pada kelinci. Sedangkan jahe yang mengandung senyawa fenolik bersifat antioksidan, sifat antioksidan ini dapat melindungi sel dari kerusakan oksidatif terhadap sel (Kikuzaki dan Nakatani (1993). Kombinasi kedelai dan vitamin E dapat menurunkan konsentrasi LDL dan meningkatkan konsentrasi HDL secara nyata yang dilakukan pada monyet ekor panjang (Williams et al. 2001). Jadi dapat dikatakan bahwa kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam percobaan ini telah berfungsi sebagai antioksidan.
Makrofag Beruk. Tabel 9 menunjukkan peningkatan proses oksidasi lipid di dalam sel makrofag beruk dengan adanya ion Cu2+. Sel makrofag yang diinkubasi dengan ion Cu2+ 5 μM dan tanpa diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga, ternyata dapat meningkatkan oksidasi lipid sebanyak 4 kali lipat. Dalam percobaan ini, penambahan kurkuminoid ternyata mampu menghabat proses oksidasi lipid di dalam sel makrofag beruk pada semua tingkat konsentrasi yang ditambahkan secara signifikan (P<0,01).
Konsentrasi MDA yang terbentuk pada sel makrofag tanpa diberi kurkuminoid ekstrak dan ion Cu2+ sebesar 6,78± 0,06 ( inkubasi 4 jam) dan 7,69 ± 0,19 (inkubasi 6). Bila dibandingkan dengan sel makrofag yang diinkubasikan dengan ion Cu2+, terjadi peningkatan oksidasi lipid sebanyak 7,6% (inkubasi 4 jam) dan 5,2 % (inkubasi 6 jam). Namun berbeda hasilnya ketika sel makrofag dipra-inkubasi dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga selama 48jam, ternyata kurkuminoid ekstrak mampu menghambat proses oksidasi lipid. Penghambatan oksidasi lipid terbesar terjadi pada konsentrasi kurkuminoid 6 ppm dan 8 ppm yaitu sebesar 23, 26 % (inkubasi 4 jam) dan 23,90 % (inkubasi 6). Sel makrofag yang diinkubasi dengan Cu2+ dalam medium pertumbuhan dapat melakukan proses oksidasi lipid. Sedangkan lama waktu inkubasi tidak berpengaruh terhadap reaksi oksidasi di dalam sel makrofag beruk (Gambar 18).
78
Tabel 9 Efek kurkuminoid temu mangga pada oksidasi dalam sel makrofag beruk,
diinduksi ion Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg protein LDL)
Inkubasi 4 Jam Inkubasi 6 Jam
Sel 3 6,78± 0,06 26,39 ± 0,04 A 22,47± 0,052 B 20,25± 0,054 C 20,26± 0,081 C 7,69 ± 0,19 26,13± 0,07A 22,68 ± 0,01B 20,13± 0,81C 19,89± 0,07C Sel + Cu2+ + E0 3 Sel + Cu2+ + E2 3 Sel + Cu2+ + E6 3 Sel + Cu2+ + E8 3
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan
yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid konsentrasi 2 ppm; E6 : 6 ppm, E8 8 ppm
Gambar 18 Penghambatan oksidasi lipid dalam sel makrofag beruk yang diinduksi ion Cu2+ dan kurkuminoid, inkubasi selama 4jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm)
Ion Cu2+ merupakan katalis yang dapat mengoksidasi lipid (Libby 2002). Makrofag berperan penting dalam peradangan dan sistim imun yang dibawa sejak lahir. Mekanisme ini tergantung pada kemampuan makrofag dalam memproduksi radikal oksigen bebas, protease, faktor komplemen dan sitokina. Makrofag juga menginisiasi respon imun yang menyebabkan kerusakan antigen (sel-T), aktivitas semua ini dapat berperan penting pada aterogenesis (Hansson 2005; Hansson 2009). Aterogenesis ini dapat dipercepat dengan adanya ion Cu2+. Hal ini terlihat dengan adanya peningkatan nilai malonaldehida (MDA) dari masing-masing kultur sel makrofag. Namun reaksi aktivitas ion Cu2+ ternyata dapat dihambat dengan pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga.
79 Inkubasi sel makrofag mencit (4 jam) dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm selama 4 jam, menghasilkan hambatan oksidasi yang lebih besar daripada yang diinkubasi 6 jam, yaitu 23,29% vs 19,82 % (Gambar 17). Namun tidak demikian dengan sel makrofag beruk, hambatan oksidasi LDL yang dihasilkan setelah diinkubasi selama 4 jam dan 6 jam tidak menunjukkan adanya perbedaan (Gambar 18). Adanya perbedaan hambatan oksidasi lipid yang terjadi antara sel makrofag mencit dan beruk diduga karena profil LDL yang dimiliki berbeda. Dalam percobaan ini diperoleh adanya penurunan kadar MDA pada sel makrofag yang diinkubasi dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga, jika dibandingkan dengan sel makrofag yang tidak diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga.
Pengaruh Kurkuminoid Ekstrak Temu mangga terhadap Proses Oksidasi LDL oleh Sel Makrofag
Percobaan ini dilakukan untuk mengkaji kemampuan sel makrofag yang telah dipra-inkubasi dengan ekstrak dalam mengoksidasi LDL. Inkubasi LDL dan sel makrofag terjadi peningkatan konsentrasi MDA Tabel 10. Pada kontrol, LDL yang diinkubasi dengan sel makrofag selama 4 dan 6 jam, secara berturut-turut menghasilkan konsentrasi MDA sebesar 19,95 ± 0,01 dan 18,98 ± 0,04. Pada kontrol sel makrofag yang mengoksidasi LDL, menghasilkan konsentrasi MDA
36,77 ± 0,91 dan 36,054 ± 2,02. Bila dilihat dari data ini, konsentrasi MDA yang
dihasilkan sel makrofak lebih tinggi dibandingkan kontrol. Disini jelas terjadi peningkatan konsentrasi MDA disebabkan kontrol sel makrofag diinkubasi dengan
LDLdan ion Cu2+. Namun pada kontrol tidak ada perbedaan (P>0,005) dengan tingkat
persentase oksidasi sebesar 4,15% dan 4,10%.
Pada percobaan terhadap sel makrofag mencit yang diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga 2 ppm dan diinkubasi selama 4 jam dan 6 jam terjadi penurunan oksidasi LDL meskipun sangat kecil. Hal yang berbeda terjadi ketika percobaan diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga 6 ppm dan 8 ppm. Proses oksidasi LDL di dalam sel makrofag mencit dapat dihambat sebesar 13,07% yang diinkubasi 4 jam, sedangkan pada inkubasi 6 jam sebesar 4,19%. Hasil uji Tukey pada percobaan yang diinkubasi selama 4 jam, memperlihatkan perbedaab (P<0,01). Kondisi ini menandakan bahwa konsentrasi 6 ppm mampu menekan
80 peningkatan konsentrasi MDA selama proses oksidasi. Hasil yang berbeda ditunjukkan juga pada ditunjukkan pada sel makrofag yang diinkubasi selama 6 jam ada perbedaan nyata (P<0,01). Sebagai kontrol dalam percobaan ini digunakan sel makrofag yang diinkubasikan dengan LDL dan ion Cu2+ tanpa diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga.
Peningkatan hambatan oksidasi LDL terhadap sel makrofag mencit Gambar 19 memperlihatkan yang diinkubasi dengan LDL dan diinduksi oleh ion Cu2+ selama 4 jam, penghambatan oksidasi LDL sebasar 13,07% , dan 4,19% yang diikubasi 6 jam. Bila dibandingkan dengan kontrol selyang diikubasi dengan LDL dan ion Cu2+ tanpa kurkuminoid ekstrak temu mangga, hambatan oksidasi LDL sebanyak 3,73% (inkubasi 4 jam) dan 2,51% ( inkubasi 6 jam). Adanya perbedaan waktu inkubasi antara perlakuan di atas menandakan bahwa LDL yang diinduksi dengan ion Cu+2 memberikan reaksi yang cukup reaktif terhadap LDL teroksidasi. Namun kurkuminoid ekstrak yang dipra-inkubasi dalam percobaan ini, mampu menekan pembentukkan MDA sehingga oksidasi LDL dapat dihambat. Selain itu, ada ketergantungan dosis kurkuminoid ekstrak temu mangga yang diinkubasikan selama 4 jam, dan penghambatan oksidasi LDL dimulai dari 3,73 %, 10,4% dan 13,07% (Gambar 19). Dalam percobaan ini, lama waktu inkubasi antara 4 jam dan 6 jam untuk setiap perlakuan, secara statistik tidak memberikan pengaruh yang bermakna (P>0,05).
Tabel 10 Efek kurkuminoid temu mangga terhadap oksidasi LDL oleh sel