Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk kulit alpukat dengan sediaan berupa infusa. Kulit alpukat dikumpulkan dari Depot Es Teler 77 Galeria Mall pada bulan Juni 2017. Determinasi tanaman dilakukan di Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Berdasarkan hasil determinasi terbukti bahwa tanaman yang diuji adalah benar merupakan tanaman Persea americana Mill.
Penetapan kadar air serbuk kulit alpukat
Penetapan kadar air dilakukan menggunakan alat moisture balance yang bertujuan untuk mengetahui kandungan air yang terdapat dalam serbuk apakah telah memenuhi persyaratan serbuk yang baik (kurang dari 10%) (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Pada penetapan kadar air diperoleh kadar air 7,384% b/b. Hal tersebut membuktikan bahwa serbuk kulit alpukat memenuhi persyaratan serbuk yang baik.
7
Uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan dosis diklofenak sebagai kontrol positif dan menentukan selang waktu pemberian karagenin 1% yang paling efektif. Hasil rata-rata AUC total dapat dilihat pada tabel I.
Tabel I. Rata-rata AUC total (mm.menit) pada uji pendahuluan dosis efektif
kalium diklofenak dan selang pemberian karagenin 1% (n=4)
Kelompok Rata-rata AUC
total (mm.menit) (x̄ ± SE)
Nilai p
Diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB waktu pemberian 15 menit
380,97 ± 8,51 0,484 (N)
Diklofenak dosis 9,1 mg/kg BB waktu pemberian 15 menit
422,57 ± 2,70 0,118 (N)
Diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB waktu pemberian 30 menit
251,45 ± 7,04 0,061(N)
Diklofenak dosis 9,1 mg/kg BB waktu pemberian 30 menit
447,61 ± 4,23 0,050(N)
Keterangan : x̄ = rata-rata
SE = Standard Error (SD/√𝑛) N = distribusi data normal (p>0,05)
Rata-rata AUC total menggambarkan seberapa besar udema yang dihasilkan karagenin 1% pada kaki hewan uji. Semakin kecil nilai rata-rata AUC total maka semakin besar aktivitas antiinflamasi yang dihasilkan oleh senyawa uji.
Dosis diklofenak dan selang waktu pemberian karagenin 1% yang paling efektif ditentukan dengan cara melihat perbandingan hasil nilai rata-rata AUC total antar kelompok. Untuk mengetahui perbedaan antar kelompok maka dilakukan analisis Post Hoc menggunakan uji LSD. Hasil uji LSD dapat dilihat pada tabel II.
Tabel II. Hasil uji LSD AUC total (mm.menit) pada uji pendahuluan dosis efektif
8 Kelompok Diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB : 15 menit Diklofenak dosis 9,1 mg/kg BB ; 15 menit Diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB ; 30 menit Diklofenak dosis 9,1 mg/kg BB; 30 menit Diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB : 15 menit - BB BB BB Diklofenak dosis 9,1 mg/kg BB ; 15 menit BB - BB BB Diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB ; 30 menit BB BB - BB Diklofenak dosis 9,1 mg/kg BB ; 30 menit BB BB BB - Keterangan : BB = Berbeda Bermakna (p<0,05)
BTB = Berbeda Tidak Bermakna (p>0,05)
Berdasarkan hasil uji LSD pada selang waktu yang sama yakni 15 menit dapat dilihat bahwa dengan dilakukan peningkatan dosis dari 4,48 menjadi 9,1 mg/kg BB terjadi peningkatan AUC yang besar yakni dari 380,97±8,51 menjadi 422,57±2,70 mm.menit. Hal ini menandakan bahwa peningkatan dosis pada selang waktu yang sama yakni 15 menit justru menghasilkan rata-rata AUC total yang lebih besar dibandingkan dosis rendah. Jika faktor yang diubah yakni selang waktu pemberian 15 menit menjadi 30 menit pada dosis 4,48 dan 9,1 mg/kg BB dapat dilihat bahwa rata-rata total AUC pada dosis 4,48 lebih rendah dibandingkan dosis 9,1 mg/kgBB yakni 251,45±7,04 dibanding 447,61±4,23 mm.menit. Hal ini menunjukkan bahwa pada perubahan terhadap selang waktu pemberian dari 15 menit menjadi 30 menit pada dosis yang ditingkatkan menghasilkan perbedaan rata-rata AUC total yang sangat rendah pada dosis diklofenak 4,48 mg/kg BB. Dari data diatas dapat pula dilihat bahwa pada kelompok dosis 4,48 mg/kg BB pada selang waktu pemberian 15 menit dan 30 menit memiliki nilai rata-rata AUC total yang lebih rendah dibandingkan dosis 9,1
9
mg/kg BB selang waktu 15 menit dan 30 menit. Dan jika dibandingkan dosis 4,48 mg/kg BB selang waktu 15 menit dan 30 menit dapat dilihat bahwa nilai rata-rata AUC total paling rendah adalah rata-rata AUC total pada kelompok diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB selang waktu 30 menit yakni 251,45±7,04 mm.menit. Pada kelompok diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB selang waktu 30 menit diketahui memiliki perbedaan bermakna dan rata-rata AUC total yang paling kecil diantara kelompok lainnya dengan dosis dan selang waktu pemberian yang berbeda yakni 4,48 mg/kg BB selang waktu 15 menit serta dosis 9,1 mg/kg BB selang waktu 15 dan 30 menit. Hal ini menunjukkan bahwa dengan pemberian diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB selang waktu pemberian 30 menit dapat memberikan penurunan tebal udema lebih besar daripada dosis 4,48 mg/kg BB selang waktu 15 menit serta dosis 9,1 mg/kg BB selang waktu 15 dan 30 menit. Pada penelitian ini digunakan diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB selang waktu pemberian 30 menit untuk senyawa lainnya karena dengan pemberian diklofenak dosis rendah dan selang waktu pemberian 30 menit mampu memberikan penurunan tebal udema yang paling signifikan (p>0,05).
Uji aktivitas antiinflamasi infusa kulit alpukat
Pengujian aktivitas antiinflamasi dilakukan untuk mengetahui aktivitas antiinflamasi sediaan infusa kulit alpukat, mengetahui persen penghambatan inflamasi dan dosis efektif infusa kulit alpukat yang dapat menimbulkan aktivitas antiinflamasi. Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit jantan galur Swiss. Hewan uji yang digunakan juga memiliki keseragaman pada berat badan yaitu 20-30 g dan umur 2-3 bulan. Hal ini bertujuan untuk memperkecil variasi biologis antar hewan uji sehingga dapat memberikan respon yang seragam. Sebelum mendapat perlakuan, hewan uji dipuasakan ± 15 jam dan hanya diberi minum berupa air untuk menghindari kemungkinan adanya pengaruh makanan terhadap absorbsi senyawa uji dan dapat mempengaruhi efek antiinflamasi yang dihasilkan.
Pada kelompok kontrol negatif, hewan uji diberikan aquades dengan dosis 33,3 g/kg BB secara peroral kemudian diberikan injeksi karagenin 1% secara subplantar. Aquades digunakan sebagai kontrol negatif karena aquades
10
merupakan pelarut dari infusa kulit alpukat dan pelarut kalium diklofenak. Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui apakah pelarut yang digunakan memiliki aktivitas antiinflamasi atau tidak.
Pada kelompok kontrol positif, hewan uji diberikan Cataflam Fast® yang mengandung kalium diklofenak dengan dosis 4,48 mg/kg BB secara peroral. Kemudian diberikan injeksi karagenin 1% secara subplantar. Kontrol positif digunakan untuk membandingkan seberapa besar aktivitas antiinflamasi yang dimiliki oleh infusa kulit alpukat terhadap kalium diklofenak yang telah terbukti memiliki aktivitas antiinflamasi. Selain itu, kontrol positif juga digunakan untuk mengetahui bahwa metode yang digunakan sudah benar atau belum. Pada penelitian ini digunakan kalium diklofenak serbuk karena akan lebih mudah larut dalam air ,memberikan pelepasan dan penyerapan yang lebih cepat daripada natrium diklofenak sehingga akan lebih aman dilambung dan obat ini juga memiliki daya antiradang yang paling kuat dengan efek samping yang lebih kecil dibandingkan dengan obat lainnya seperti indometasin dan piroxicam (Tjay dan Raharja, 2007). Kalium diklofenak serbuk lebih cepat mencapai sirkulasi sistemik dan konsentrasi plasma puncak akan dicapai dalam waktu sekitar 25 menit setelah pemberian (Tandon dan Uppoor, 2007).
Tebal udema kaki mencit diukur menggunakan jangka sorong digital selama 6 jam pada menit ke-0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, dan 360. Tebal udema kaki mencit diperoleh dari selisih tebal udema kaki kiri mencit yang disuntikkan karagenin dan kaki kanan mencit yang hanya disuntikkan spuit kosong tanpa karagenin. Hasil selisih tersebut kemudian digunakan untuk mengukur AUC. Semakin besar nilai AUC, maka semakin kecil pula penurunan selisih tebal udema kaki mencit.
Hasil Pengujian Aktivitas Antiinflamasi Infusa Kulit Alpukat
Aktivitas antiinflamasi dilihat dari penurunan tebal udema kaki pada kaki hewan uji tiap satuan waktu setelah pemberian karagenin 1% yang digambarkan dari penurunan nilai AUC total (mm.menit) dan dilihat dari besarnya persen penghambatan inflamasi dari masing-masing kelompok perlakuan terhadap kontrol negatif. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas antiinflamasi diharapkan
11
memiliki nilai rata-rata nilai AUC total yang kecil dan berbeda signifikan dengan kontrol negatif.
Hasil perhitungan AUC dari masing-masing kelompok kemudian digunakan untuk menentukan persen penghambatan inflamasi (PI) untuk masing-masing kelompok. Persen PI dihitung dengan membandingkan selisih rata-rata AUC total kelompok perlakuan dan kontrol positif dengan kelompok kontrol negatif. Persen PI digunakan untuk mengetahui seberapa besar kemampuan senyawa uji dalam menurunkan udema kaki hewan uji akibat injeksi karagenin 1% dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Hasil nilai rata-rata AUC total dan rata-rata persen PI dapat dilihat pada tabel III dan hasil uji LSD dapat dilihat pada tabel IV.
Tabel III. Rata-rata AUC total (mm.menit) dan PI pada kelompok uji
antiinflamasi (n=5) Kelompok Rata-rata AUC
total (mm.menit) (x̄ ± SE) Nilai p Rata-rata PI (x̄ ± SE) Nilai p Kontrol negatif aquades 476,59 ± 7,25 0,524 (N) 0,00 ± 1,52 0,524 (N) Kontrol positif diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB 249,11 ± 7,80 0,396 (N) 47,73 ± 1,63 0,396 (N) Infusa dosis 667,5 mg/kg BB 163,76 ± 12,21 0,367 (N) 65,63 ± 2,56 0,367 (N) Infusa dosis 1335 mg/kg BB 133,42 ± 7,56 0,632(N) 72,00 ± 1,58 0,632(N) Infusa dosis 2670 mg/kg BB 118,25 ± 8,37 0,251(N) 75,18 ± 1,75 0,251(N) Keterangan : x̄ = rata-rata SE = Standard Error (SD/√𝑛) N = distribusi data normal (p>0,05)
Tabel IV. Hasil uji LSD AUC total (mm.menit) dan persen PI pada kelompok uji
12 Kelompok Infusa dosis 667,5 mg/kg BB Infusa dosis 1335 mg/kg BB Infusa dosis 2670 mg/kg BB Kontrol positif diklofenak 4,48 mg/kg BB Kontrol negatif aquades Infusa dosis 667,5 mg/kg BB - BB BB BB BB Infusa dosis 1335 mg/kg BB BB - BTB BB BB Infusa dosis 2670 mg/kg BB BB BTB - BB BB Kontrol positif diklofenak 4,48 mg/kg BB BB BB BB - BB Kontrol negatif aquades BB BB BB BB - Keterangan : BB = Berbeda Bermakna (p<0,05) BTB = Berbeda Tidak Bermakna (p>0,05)
Berdasarkan hasil uji LSD kelompok kontrol negatif aquades memiliki rata-rata AUC total berbeda bermakna (p<0,05) terhadap kelompok kontrol positif yang diberikan kalium diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB. Penelitian yang dilakukan oleh Manurung et al. (2013) dan Kristanti (2016) menunjukkan bahwa aquades sebagai kontrol negatif menghasilkan udema yang paling besar diantara kelompok perlakuan lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa aquades sebagai pelarut tidak memiliki aktivitas antiinflamasi.
Kemampuan infusa kulit alpukat dalam memberikan aktivitas antiinflamasi dapat dilihat dari adanya penurunan tebal udema telapak kaki mencit yang ditunjukkan dengan adanya penurunan rata-rata nilai AUC total. Kelompok perlakuan infusa kulit alpukat dosis 667,5; 1335; dan 2670 mg/kg BB memiliki nilai rata-rata AUC total yang berbeda signifikan (p<0,05) jika dibandingkan dengan kontrol negatif aquades. Hal ini membuktikan bahwa pemberian infusa kulit alpukat pada tiga peringkat dosis memberikan aktivitas antiinflamasi.
13
Jika dibandingkan dengan kontrol positif kalium diklofenak dosis 4,48 mg/kg BB yang memiliki nilai AUC total sebesar 249,11 ± 7,80 dan persen PI sebesar 47,43 ± 1,63, kelompok perlakuan infusa kulit alpukat dosis 667,5, 1335, dan 2670 mg/kg BB memiliki nilai AUC total yang lebih rendah dan memiliki persen PI yang tinggi (berbeda bermakna). Hal ini membuktikan bahwa kelompok perlakuan infusa kulit alpukat dosis 667,5, 1335, dan 2670 mg/kg BB memiliki aktivitas antiinflamasi dan kemampuan PI yang lebih tinggi dibandingkan kelompok yang diberikan diklofenak. Namun, dapat dilihat dari data statistik pada perlakuan infusa kulit alpukat dosis 1335 mg/kg BB terhadap dosis 2670 mg/kg BB memiliki AUC total dan persen PI yang relatif sama secara statistik (berbeda tidak bermakna). Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan aktivitas antiinflamasi infusa kulit alpukat dosis 2 dan 3 relatif sama besar.
Berdasarkan hasil tersebut semua kelompok infusa kulit alpukat memiliki aktivitas antiinflamasi, namun kemampuan yang dihasilkan berbeda-beda. Persen penghambatan inflamasi oleh infusa kulit alpukat pada dosis 667,5; 1335; serta 2670 mg/kg BB berturut-turut adalah 65,63; 72,00; dan 75,18%. Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa seiring dengan meningkatnya dosis justru aktivitas antiinflamasinya semakin tinggi. Hal ini sesuai dengan teori Clark (1933) yakni intensitas efek berbanding lurus dengan fraksi reseptor yang diduduki atau diikat dimana intensitas efek mencapai maksimum bila seluruh reseptor diduduki. Oleh karena itu, semakin besar dosis aktif/obat maka efek farmakologi yang ditimbulkan akan semakin besar pula karena semakin banyaknya reseptor yang diduduki oleh senyawa uji.
Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa kelompok perlakuan infusa kulit alpukat dosis 2670 mg/kg BB memiliki aktivitas penghambatan inflamasi yang paling besar dibandingkan dosis 667,5 dan 1335 mg/kg BB. Namun, karena dosis 1335 dan 2670 mg/kg BB memiliki aktivitas penghambatan inflamasi yang secara statistik berbeda tidak bermakna maka dengan dosis kecil yakni 1335 mg/kg BB sudah dapat menimbulkan efek antiinflamasi yang sebanding dengan dosis 2670 mg/kg BB. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh kejenuhan reseptor karena banyaknya reseptor yang tersedia untuk berinteraksi dengan molekul obat
14
juga mempengaruhi aksi obat. Abrams et al. (2009) menjelaskan bahwa terdapat jumlah minimal reseptor yang harus ditempati oleh molekul obat untuk menghasilkan sebuah efek farmakologi. Jika banyak reseptor tersedia namun hanya beberapa yang ditempati oleh molekul obat maka hanya sedikit efek obat yang terjadi (peningkatan dosis obat dapat meningkatkan efek farmakologi). Sebaliknya, jika reseptor yang tersedia sedikit namun molekul obat banyak maka reseptor akan mengalami kejenuhan (peningkatan dosis obat tidak akan menambah efek farmakologi). Vinha et al. (2013) juga menyebutkan bahwa konsentrasi ekstrak alpukat berbanding lurus dengan peningkatan aktivitas antioksidan yang biasanya terjadi pada serat buah alpukat dan tidak terjadi pada bagian kulit maupun biji alpukat.
Tabel V. Persen potensi relatif daya antiinflamasi pada kelompok uji
antiinflamasi (n=5)
Kelompok perlakuan Persen potensi relatif daya antiinflamasi/PRDA (%)
Kontrol negatif aquades 0,00
Kontrol positif kalium diklofenak 100 Infusa kulit alpukat dosis 667,5 mg/kg BB 137,5 Infusa kulit alpukat dosis 1335 mg/kg BB 150,84 Infusa kulit alpukat dosis 2670 mg/kg BB 157,51
Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa pada kelompok infusa kulit dosis 667,5; 1335; dan 2670 mg/kg BB memiliki persen potensi relatif daya antiinflamasi yang lebih besar dibanding diklofenak. Dapat dilihat pada Tabel V bahwa kelompok infusa kulit alpukat dosis 2670 mg/kg BB memiliki persen potensi relatif daya antiinflamasi yang paling besar terhadap kontrol positif kalium diklofenak yakni 157,51%. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga dosis infusa kulit alpukat yakni 667,5; 1335; dan 2670 mg/kg BB memiliki kemampuan aktivitas antiinflamasi yang lebih kuat dibandingkan kontrol positif diklofenak yang dikenal merupakan agen penghambat inflamasi yang bersifat poten pada
15
sintesis prostaglandin dan memiliki aktivitas antiinflamasi yang sudah terbukti kemampuan antiinflamasinya.
Adanya kemampuan infusa kulit alpukat dalam menurunkan efek inflamasi pada mencit yang terinduksi karagenin dapat dikaitkan dengan adanya senyawa yang terkandung didalamnya. Arukwe et al (2012) menyebutkan bahwa flavonoid mampu berperan sebagai antiinflamasi yang mampu menangkap radikal bebas yang menyebabkan timbulnya respon-respon inflamasi. Semakin banyak senyawa flavonoid sebagai antioksidan yang mampu menangkap radikal penginduksi inflamasi maka kemampuannya untuk menghambat inflamasi juga besar. Senyawa yang mampu menangkap radikal bebas di dalam tubuh biasa disebut sebagai antioksidan.
Aktivitas antiinflamasi infusa kulit alpukat yang lebih tinggi dari kontrol positif kalium diklofenak mungkin disebabkan karena terdapatnya senyawa-senyawa antioksidan lain dalam kulit alpukat yang berperan dalam proses penyembuhan jaringan dari radang dan inflamasi seperti senyawa fenolik, karotenoid, vitamin C, dan vitamin E. Dari penelitian Vinha et al. (2013) diketahui kandungan bioaktif kulit alpukat secara kuantitatif yakni kandungan fenolik total (679,0±117,0 mg/100g), flavonoid (44,3±3,1 mg/100g), karotenoid (2,585±0,117 mg/100g), vitamin C (4,1±2,7 mg/100g), dan vitamin E (2,13±1,03 mg/100g) Banyaknya senyawa antioksidan dapat menyebabkan terjadinya efek sinergi namun butuh penelitian lebih lanjut untuk membuktikan efek sinergi tersebut. Efek sinergi merupakan aksi antara dua buah senyawa atau lebih dimana salah satu senyawa dapat meningkatkan efek senyawa lainnya untuk menghasilkan efek yang lebih besar dibandingkan efek yang dapat dicapai dari pemberian senyawa tunggal (Gertsch, 2011). Senyawa fenol memiliki kemampuan sebagai antiinflamasi, antikoagulan, antioksidan, serta peningkatan sistem imun (Arukwe et al., 2012). Aktivitas farmakologi dari senyawa flavonoid adalah sebagai antialergi, antiviral, antiinflamasi, hepatoprotektif, antioksidan, antitrombotik, vasodilator, dan antikarsinogenik (Seyoum et al., 2006). Adanya kandungan flavonoid, karotenoid, dan fenolik dapat mencegah kerusakan oksidatif sel (Vinha et al., 2013). Flavonoid, karotenoid, fenolik, serta vitamin C dan
16
vitamin E juga berfungsi sebagai antioksidan yang memiliki kemampuan yang efektif sebagai penangkap radikal bebas sehingga proses pembentukan asam arakidonat melalui enzim fosfolipase-A2 akan terhambat sehingga mediator nyeri dan peradangan tidak terbentuk. Namun perlu dilakukan uji lanjutan untuk mengetahui senyawa yang bertanggung jawab atas aktivitas antiinflamasi dan dari senyawa tersebut dilihat senyawa manakah yang paling aktif terhadap enzim siklooksigenase dalam kaitannya dengan aktivitas antiinflamasi.
Berdasarkan hasil tersebut dosis efektif infusa kulit alpukat sebagai antiinflamasi adalah 667,5 mg/kg BB, bila dikonversikan ke manusia sebesar 5,548 g/ 50 kg BB. Dosis efektif merupakan dosis terkecil dari infusa kulit alpukat yang dapat menimbulkan aktivitas antiinflamasi. Dosis 667,5 mg/kg BB dipilih sebagai dosis efektif karena dosis tersebut merupakan dosis terkecil yang memiliki aktivitas antiinflamasi. Kulit alpukat memiliki aktivitas antioksidan yang relatif tinggi sehingga dapat dipertimbangkan sebagai salah satu bahan alam yang memiliki antioksidan alami.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan terlihat bahwa infusa kulit alpukat dengan dosis yang sama memberikan persen penghambatan inflamasi yang lebih besar daripada biji alpukat (Kristanti, 2016). Hal ini selaras dengan penelitian Konsinska et al. (2012) yang menyatakan bahwa ekstrak kulit alpukat memiliki kandungan senyawa fenolik total dan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak biji alpukat.
KESIMPULAN
Infusa kulit alpukat memiliki aktivitas antiinflamasi. Persen penghambatan inflamasi oleh infusa kulit alpukat pada dosis 667,5; 1335; serta 2670 mg/kg BB berturut-turut adalah 65,64; 72,00; dan 75,18%. Persen potensi relatif daya antiinflamasi infusa kulit alpukat pada dosis 667,5; 1335; dan 2670 mg/kg BB jika dibandingkan terhadap kontrol positif kalium diklofenak berturut-turut adalah 137,5; 150,84; dan 157,51%. Dosis efektif infusa kulit alpukat sebagai antiinflamasi adalah 667,5 mg/kg BB.
17
SARAN
1. Perlu dilakukan analisis untuk mendeteksi adanya senyawa yang bertanggung jawab akan aktivitas antiinflamasi
2. Dapat dilakukan uji secara in silico senyawa-senyawa flavonoid yang telah diskrinning terhadap enzim siklooksigenase yang didownload dari protein database untuk melihat senyawa flavonoid mana yang paling aktif terhadap enzim siklooksigenase yang kemudian dapat dilakukan sintesis senyawa flavonoid yang paling aktif terhadap enzim siklooksigenase.
18