Nama BTM diambil dari tempat asal pengambilan mikroalga yaitu perairan laut Batam. Angka 11 merupakan kode lokasi pengambilan mikroalga. Mikroalga BTM 11 tumbuh pada media modifikasi yang mengandung mineral seperti NaNO3, Na2HPO4, KH2PO4, ferric ammonium citrate, Na2EDTA, asam sitrat, CaCl22H2O, dan air laut steril. Optimasi kultivasi BTM 11 telah dilakukan Mustopa et al. (2015) dengan kondisi lingkungan yang ekstrim cahaya, suhu, dan kadar garam. Ketersediaan kondisi pertumbuhan yang ekstrem meningkatkan produksi metabolit sekunder yang berpotensi memiliki aktivitas biologis. Mikroalga lebih mudah ditumbuhkan dalam skala laboratorium untuk menghasilkan senyawa bioaktif dibandingkan dengan tanaman darat, akan tetapi komposisi senyawa bioaktif tergantung pada jenis mikroalganya (Borowitzka dan Borowitzka 1988).
Kultivasi mikroalga BTM 11 membutuhkan derajat keasaman sekitar 7-8 dengan bantuan proses aerasi. Aerasi menyebabkan pertukaran gas karbondioksida sehingga dapat menjaga stabilitas pH. Suhu selama pertumbuhan adalah 25-30 oC berada dalam kondisi cahaya ruang. Keberadaan cahaya menentukan kurva pertumbuhan mikroalga yang melakukan fotosintesis. Intensitas cahaya yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikroalga berbeda-beda. Mikroalga BTM 11 membutuhkan intensitas cahaya matahari dalam suhu ruang. Li et al. (2011) menjelaskan bahwa intensitas cahaya matahari dan suhu dipengaruhi oleh keadaan iklim selama kultivasi. Reynolds (1990) menyatakan nilai maksimum kecepatan proses fotosintesis terjadi pada kisaran suhu 25-40 oC. Berbagai proses dalam sel sangat tergantung pada suhu. Kecepatan suatu proses akan terus bertambah dengan peningkatan suhu. Temperatur tinggi yang melebihi temperatur maksimum akan menyebabkan proses metabolisme sel terganggu.
Pertumbuhan mikroalga BTM 11 ditandai dengan terbentuknya sel yang berfilamen dan berwarna hijau (Gambar 2). Masa panen dilakukan pada waktu mendekati fase stasioner awal yaitu 7 hari. Kondisi fase tersebut mikroalga menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang diperkirakan mempunyai aktivitas untuk inhibisi. Proses kultivasi mikroalga yang telah dilakukan dalam media sebanyak 10 L menghasilkan biomassa basah yang kemudian dikeringkan menjadi biomassa kering sebanyak ± 7.24 gram. Biomassa kering yang dihasilkan bewarna hijau (Gambar 2).
10
(a) (b) (c)
Gambar 2 Kultur mikroalga BTM 11 (a) BTM 11 kultivasi media 10 L (b) biomassa basah (c) biomassa kering
Hasil Identifikasi Secara Molekuler Spesies Mikroalga BTM 11
Proses identifikasi molekuler mikroalga BTM 11 terlebih dahulu dilakukan dengan tahap isolasi DNA. Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer didapatkan nilai rasio OD260/OD280 1,80 dengan konsentrasi 67 ng/µL. DNA yang telah diisolasi dapat dikategorikan memiliki kemurnian yang tinggi apabila memiliki rentang rasio OD260/OD280 1,8-2,0. DNA terlihat sebagai pita tunggal yang berukuran >3000 bp apabila dielektroforesis dalam gel agarosa 0.8-1% (Gambar 3a). Sampel DNA dijadikan sebagai cetakan untuk amplifikasi gen 16S-rRNA menggunakan teknik PCR. Amplifikasi fragmen DNA gen 16S-rRNA (Mustopa et al. 2014) telah dilakukan dengan penempelan primers 8F (5’-AGA GTTTGA TCA TGGCTC AG-3’), dan 15R (5’-AAGGAG GTG ATC CAA CA-3’). Produk hasil PCR menunjukkan pita berukuran 1500 bp (Gambar 3b) kemudian dipurifikasi gel untuk dilanjutkan dengan sekuensing.
(a) (b)
Gambar 3 Hasil konfirmasi elektroforesis (a) isolasi genom, (b) produk PCR 16s-rRNA
Gen 16s-rRNA adalah gen dari genom mitokondria yang sering digunakan sebagai gen standar dalam studi identifikasi molekuler. Sekuen 16S ribosomal DNA merupakan materi genetika yang terletak pada ribosom subunit kecil (Cole et al. 2013). Mikroalga spesies sianobakteria umum dilakukan identifikasi
1500 bp 4000 bp
1500 bp 4000 bp
11
dengan gen 16S-rRNA. Amer et al. (2013) mengisolasi blue green alga yang diperoleh dari perairan sungai nil kemudian identifikasi dengan 16S-rRNA. Karakteristik fenotip mikroalganya berfilamen dan warna sesuai habitatnya. Spesies lain dari blue-green algae yang diidentifikasi dengan 16S-rRNA adalah
Microcystis, Nostoc, Anabaena, Sytonema.
Pohon Filogenetik Berdasarkan Analisis Gen 16S rRNA
Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan analisis data sekuen dari gen 16S-rRNA. Hasil BLASTn sekuensing gen 16S rRNA menunjukkan mikroalga BTM 11 memiliki hubungan kekerabatan dengan Geitlerinema sp yang dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil analisis data sekuen menggunakan software dapat dilihat pada Lampiran 8.
Tabel 2 Analisis homologi sekuen gen 16S-rRNA mikroalga BTM 11 menggunakan program BLASTn
Hasil Analisis Homologi Kode Akses Daerah Penemuan
Geitlerinema sp. 98% FJ042947.1 Brasil, Spanyol
Tabel 2 menunjukkan homologi spesies mikroalga BTM 11 sebesar 98% dengan Geitlerinema sp. Sistem klasifikasi makhluk hidup menyebutkan spesies
Geitlerinema masuk dalam phylum Cyanobacterium. Mikroalga BTM 11 dapat digolongkan dalam phylum Cyanobacterium dengan kemiripan pada Geitlerinema
sp. Carmo et al. (2009) menyebutkan memiliki koleksi Geitlerinema sp termasuk dalam kelompok ganggang yang banyak hidup di perairan daerah Brazil dan Spanyol.
Matriks jarak genetik dapat dilihat pada Tabel 3 yang digunakan untuk analisa hubungan kekerabatan berdasarkan pohon filogenetik. Jarak genetik mikroalga BTM 11 paling dekat dengan Geitlerinema sp. yaitu 0.00, sedangkan paling jauh dengan Dunaliella 1.37. Kedekatan BTM 11 juga pada Microcoleus
sp., Oscillatoria sp., Phormidium sp., Phormidiaceae, Lyngbya sp., Jaaginema sp. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan untuk mengetahui kelompok dan hubungan kekerabatan spesies. Pohon filogenetik dirancang menggunakan sekuen 16S-rRNA hasil BLASTn mikroalga BTM 11 dan spesies lain seperti
Tabel 3 Matriks jarak genetik fragmen gen 16S rRNA berdasarkan metode pairwise distance 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BTM 11 Geitlerinema sp. 0.00 Microcoleus sp. 0.05 0.04 Oscillatoria sp. 0.05 0.04 0.00 Phormidium sp. 0.05 0.05 0.00 0.01 Phormidiaceae 0.05 0.05 0.01 0.01 0.01 Lyngbya sp. 0.07 0.07 0.07 0.06 0.07 0.07 Jaaginema sp. 0.08 0.08 0.07 0.08 0.07 0.07 0.09 Scytonema sp. 0.17 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.15 0.17 Spirulina sp. 0.10 0.10 0.10 0.09 0.10 0.10 0.10 0.08 0.15 Dunaliella_ 1.37 1.38 1.30 1.31 1.30 1.32 1.31 1.34 1.46 1.28
12
Scytonema sp., Spirulina sp., dan Dunaliella. Angka di setiap titik percabangan pohon filogenetik menunjukkan nilai bootstrap yang berfungsi untuk mengetahui stabilitas hasil dan selang kepercayaan (confidence intervals). Pohon filogenetik pada Gambar 4 menunjukkan bahwa mikroalga BTM 11 memiliki kekerabatan yang sangat dekat dengan Geitlerinema sp. Hal ini ditunjukkan dengan nilai bootstrap dalam percabangan pohon filogenetik antara mikroalga BTM 11 dengan
Geitlerinema sp sebesar 100. Artinya antara BTM 11 dengan Geitlerinema sp sangat kuat dalam satu kelompok/kelas yang didukung oleh nilai konsistensi bootstrap sampai 100%. Semakin rendah nilai bootsrap menunjukkan hubungan kekerabatan/kelompok spesies semakin jauh (Dharmayanti, 2011).
Gambar 4 Hasil rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan gen 16S-rRNA menggunakan metode Maximum Likelihood bootstrap 500x
Hasil Isolasi dan Purifikasi Protein Lektin Mikroalga BTM 11 Teknik isolasi protein lektin yang digunakan mengacu kepada metode Praseptiangga et al. (2012) dengan modifikasi. Isolasi bertujuan untuk memisahkan satu atau lebih senyawa yang diinginkan dalam suatu larutan atau padatan yang mengandung campuran senyawa-senyawa tersebut. Sampel isolasi protein lektin mikroalga BTM 11 berbentuk biomassa kering. Sampel ditumbuk dengan nitrogen cair agar menjadi serbuk sehingga memudahkan kontak antara pelarut dengan sampel. Isolasi protein lektin dilakukan dengan cara maserasi pada suhu dingin untuk menghomogenkan sampel dengan pelarut TBS. Proses isolasi protein lektin dimodifikasi dengan perlakuan sonikasi untuk membantu memecah dinding sel mikroalga. Sani et al. (2014) menyatakan sonikasi membantu pemecahan sel dengan suara pada panjang gelombang tertentu. Proses isolasi protein lektin mikroalga dilakukan pada suhu 0-4 oC karena aktivitas protein sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan agar tidak terjadi kerusakan.
Pemurnian menjadi tahapan yang penting sebelum proses karakterisasi. Pemurnian protein lektin bertujuan memisahkan protein lektin dari komponen karbohidrat, isoflavon, air, dan lain-lain. Penelitian ini menggunakan proses pemurnian protein dengan pengendapan garam ammonium sulfat dan kromatografi kolom filtrasi gel. Pengendapan protein menggunakan garam
13
ammonium sulfat telah banyak digunakan oleh para peneliti (Tokuyasu et al. 1996). Selain karena kelarutan ammonium sulfat yang tinggi,
garam ini tidak toksik, dan ekonomis. Prinsip presipitasi ammonium sulfat berdasarkan kompetisi pengikatan air antara garam dan protein. Amonium sulfat terlarut akan terionisasi menjadi ion NH4+ dan SO42-. Ion garam menarik air yang berikatan dengan protein, sehingga kelarutan protein menurun. Protein selanjutnya membentuk agregat dan mengendap (Sinatari et al. 2013). Protein lektin dapat diendapkan menggunakan ammonium sulfat 75% (Lampiran 4). Diduga, protein lektin memiliki lebih banyak asam amino hidrofilik. Protein dengan asam amino hidrofilik membutuhkan garam ammonium sulfat yang lebih banyak untuk mengganggu interaksi yang kuat antara air dengan asam amino hidrofilik (Bintang, 2010). Penelitian yang dilakukan oleh Praseptiangga et al. (2012) menyebutkan pengendapan amonium sulfat protein lektin alga hijau Barbatum codium efektif pada 75% ammonium sulfat. Hasil pengendapan amonium sulfat merupakan ekstrak kasar protein lektin kemudian dielusi dengan bufer TBS. Warna ekstrak kasar hasil isolasi protein adalah hijau pekat.
Penentuan konsentrasi protein pada Tabel 4 ditentukan dengan uji asam
bicinchoninat (BCA-bicinchoninic acid assay). BCA mudah digunakan, sensitifitasnya tinggi, dan toleran terhadap senyawa pengganggu dari lingkungan. Uji ini didasarkan pada dua reaksi kimia. Reaksi pertama adalah reduksi ion Cu2+ menjadi ion Cu+ oleh ikatan peptida dalam kondisi alkali (reaksi biuret). BCA dikenal sebagai reaksi biuret karena bentuk kompleksnya serupa dengan senyawa biuret organik (NH2-CO-NHCONH2) dan ion tembaga (Smith et al. 1985). Pengujian konsentrasi protein menggunakan kurva standar pada Lampiran 9.
Gambar 5 Grafik purifikasi gel Sephadex G-50 protein lektin mikroalga BTM 11
Pemurnian selanjutnya menggunakan kromatografi filtrasi gel. Berdasarkan pada Gambar 5 jumlah fraksi yang tertampung oleh kolom sebanyak 21 buah dengan volum masing-masing 2 mL (Lampiran 10). Purifikasi kolom filtrasi gel Sephadex G-50 menunjukkan kromatogram menunjukkan adanya dua puncak protein, yaitu pada fraksi 6 dan 7. Fraksi 6 dan 7 menunjukkan pita paling tebal saat uji bobot molekul SDS-PAGE dengan nilai total konsentrasi proteinnya
14
12.16 mg/mL. Hasil proses purifikasi dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai aktivitas hambat paling tinggi terdapat pada metabolit ekstraksi yaitu 439.6 mm2/mL. Total protein paling tinggi juga terdapat pada metabolit ekstraksi yaitu 288 mg (penentuan total protein dengan metode BCA). Aktivitas spesifik tertinggi 11.32 AU/mg dengan kelipatan kemurnian 7.42 pada tahap purifikasi Sephadex G-50. Aktivitas speseifik menunjukkan jumlah aktivitas hambat dalam 1 mg. Tahapan isolasi sampai pemurnian menggambarkan kemurnian protein lektin telah mengalami peningkatan signifikan Tahap purifikasi Sephadex G-50 menunjukkan paling efektif dalam memberikan aktivitas hambat.
Prinsip pemisahan protein menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel adalah perbedaan bobot molekul protein. Kromatografi kolom filtrasi gel menggunakan gel Sephadex G-50 sebagai fasa diam. Sephadex adalah butiran gel makroskopis yang terbuat dari turunan polisakarida, yaitu dekstran. Sephadex G-50 mampu memisahkan molekul protein dengan BM 1.5-30 kDa. Penggunaan
Sephadex G50 sudah sesuai untuk pemisahan protein lektin yang memiliki bobot molekul kurang dari 30 kDa (Soczewinski dan Wawrzynowicz 2003).
Sampel protein yang dielusi dalam kolom filtrasi gel dipisahkan berdasarkan ukuran bobot molekul protein. Protein dengan bobot molekul besar akan terelusi pada fraksi awal. Protein dengan bobot molekul kecil akan tertahan dalam gel dan terelusi pada fraksi akhir. Eluen kromatografi yang terfraksinasi berdasarkan bobot molekul selanjutnya dihitung absorbansi dengan panjang gelombang 280 nm untuk menentukan konsentrasi protein. Kromatogram menunjukkan bahwa protein lektin terdapat pada fraksi awal (fraksi 6-7) diduga karena besarnya bobot molekul protein lektin mendekati ukuran 30 kDa yang selanjutnya dibuktikan dengan elektroforesis SDS-PAGE.
Karakteristik Protein Lektin Mikroalga BTM 11 Bobot Molekul Protein
Analisis bobot molekul protein lektin mikroalga BTM 11 dilakukan dengan menggunakan metode elektroforesis gel poliakrilamid (SDS-PAGE). Metode ini memisahkan protein berdasarkan bobot molekulnya (Bintang, 2010). Gel akrilamid terbentuk akibat terjadinya proses polimerisasi akrilamida dan metilenbisakrilamida. Proses polimerisasi dikatalisis oleh ammonium persulfat
Tabel 4 Pemurnian protein lektin Tahap Purifikasi Vol (mL) Protein (mg/mL) Total Protein (mg) Aktivitas Unit (AU) Aktivitas Spesifik (AU/mg) Kelipatan Kemurnian Rendemen (%) Metabolit Ekstraksi 30 9.60 288 439.60 1.52 1 100 Ekstrak pengendapan ammonium sulfat 7 7.51 52.57 317.95 6.04 3.96 72.32 Purifikasi Sephadex G-50 4 3.04 12.16 137.75 11.32 7.42 31.33
15
sebagai katalisator (Janson dan Ryden 1998). SDS berperan mengikat bagian hidrofobik pada protein, sehingga molekul terurai dari lipatannya dan muatan protein tersebut sama. Hal ini bertujuan agar protein terpisah berdasarkan perbedaan bobot molekul. Protein yang memiliki bobot molekul lebih kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada protein yang berbobot molekul lebih besar. Proses pewarnaan gel menggunakan Commasie brilliant blue R-250.
Gambar 6 SDS-PAGE protein mikroalga BTM 11 (1: metabolit. 2: ekstrak kasar protein lektin hasil pengendapan 3: protein hasil purifikasi)
Hasil penelitian Gambar 6 menunjukkan bahwa terdapat banyak pita protein pada metabolit ekstraksi, meski terlihat satu pita yang tebal. Nilai kurva standar bobot molekul uji SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 11. Begitu pula dengan hasil fraksinasi ammonium sulfat dan kolom filtrasi gel. Hal ini menunjukkan banyaknya protein lain selain protein target yang ikut terekstraksi selama isolasi protein lektin. Perbedaannya, metabolit ekstraksi memiliki pita yang smear lebih tebal. Banyaknya pengotor berupa mineral, karbohidrat, dan komponen lain menjadi salah satu penyebab. Protein lektin hasil fraksinasi ammonium sulfat dan kolom filtrasi gel memiliki tipe pita yang hampir sama. Hasil kolom filtrasi gel lebih jernih dan berkurang beberapa pita band pengotor selain protein target. Hal ini menunjukkan bahwa proses kromatografi kolom filtrasi gel masih memerlukan optimasi untuk memisahkan dengan protein lain. Lebarnya puncak kurva protein pada hasil kromatografi (fraksi 6-7), diperkirakan karena masih terdapat lebih dari satu protein. Keberadaan pita protein yang tebal dari metabolit ekstraksi, ekstrak kasar ammonium sulfat, dan protein purifikasi pada 17 kDa menguatkan dugaan bahwa pita tersebut merupakan target protein lektin. Purifikasi pada penelitian ini merupakan proses purifikasi parsial. Berdasarkan Hori et al. (2009) protein lektin pada beberapa mikroalga memiliki berat molekul rendah. Penelitian Praseptiangga et al. (2012) pada alga hijau
Codium barbatum menunjukkan berat molekul protein lektin 9 kDa dengan perlakuan penambahan merchaptoetanol dan 18 kDa tanpa penambahan 2-merchaptoetanol. Han (2012) menyebutkan hasil purifikasi lektin alga hijau
Bryopsis plumosa memiliki berat molekul 12.8 kDa. Berat molekul beberapa protein lektin alga hijau rendah tergantung dari spesies masing-masing alga.
260 kDa 140 kDa 95 kDa 72 kDa 52 kDa 42 kDa 34 kDa 26 kDa 17 kDa 10 kDa 17 kDa
16
Aktivitas Hemaglutinasi
Uji aktivitas hemaglutinasi merupakan cara untuk mendeteksi ada tidaknya lektin (Hori et al. 2007). Aktivitas hemaglutinasi dilakukan dengan menentukan titer hemaglutinasi, yaitu jumlah minimal sampel yang dapat menyebabkan aglutinasi pada darah (eritrosit) dan diamati secara makroskopis. Semakin banyak sampel yang digunakan untuk mengaglutinasi eritrosit menunjukkan aktivitas hemaglutinasinya semakin rendah. Pengamatan uji hemaglutinasi secara makrokopis yang dikatakan (+) ditandai dengan adanya karpet pada sumuran microplate, hasil (-) jika ditandai dengan eritrosit darah mengendap di bawah membentuk titik (Teixeria et al. 2012). Pengujian hemaglutinasi menggunakan sampel golongan darah O. Menurut Hung et al. (2012) eritrosit yang dapat digunakan adalah darah manusia golongan darah A, B, O, kelinci, domba, dan ayam. Setiap sampel darah memiliki sensitivitas aktivitas agglutinin yang berbeda. Hasil uji hemaglutinasi terdapat dalam Tabel 5.
Tabel 5 Titer uji hemaglutinasi
Sampel Aktivitas Hemaglutinasi Keterangan
Ekstrak kasar 64 +
Ekstrak kasar dilusi 2x 16 +
Ekstrak kasar dilusi 3x 8 +
Protein lektin BTM 11 menunjukkan aktivitas hemaglutinasi pada darah golongan O dengan nilai titer uji 64 (tanpa dilusi). Semakin tinggi pengencerannya nilai titer ujinya semakin menurun. Jumlah konsentrasi protein lektin akan mempengaruhi aktivitas hemaglutinasi. Lektin bersifat mengikat secara spesifik untuk golongan darah. Setiap darah memiliki susunan gula yang spesifik. Darah golongan O memiliki susunan gula spesifik dalam bentuk L-fukosa (Khan et al. 2002).
Lektin adalah protein yang mengikat karbohidrat secara reversibel, menggumpalkan sel atau endapan polisakarida dan glikoprotein. Semua molekul lektin memiliki dua atau lebih tempat ikatan dengan karbohidrat, oleh karenanya sangat memungkinkan lektin mengaglutinasi sel darah merah dan bereaksi dengan struktur glikoprotein atau glikolipid pada keadaan fisiologi mau pun patologi (Spicer dan Schulte 1992). Peneliti Ambrosio et al. 2003 menyatakan lektin jenis EPL yang diisolasi dari alga hijau E. prolivera menunjukkan spesifitas tinggi pada penambahan manosa dan fukosa. Ikatan senyawa tersebut diketahui dengan adanya perubahan intrinsic fluorescence dari protein selama pengikatan dengan gula. Oleh karena itu protein lektin BTM 11 memiliki spesifitas tinggi terhadap gula fukosa pada darah golongan O ditunjukkan dengan adanya nilai titer uji hemaglutinasi.
Karakteristik Suhu dan Logam
Karakterisasi protein lektin dilakukan terhadap perlakuan suhu dan logam. Tujuan karakterisasi adalah mengetahui aktivitas optimum protein lektin sehingga mudah untuk aplikasi. Karakterisasi dilakukan pada berbagai perlakuan suhu dan logam. Karakterisasi suhu pada Tabel 6 menunjukkan protein pada suhu 30 oC dan 50 oC stabil memiliki aktivitas hambat sebesar 8.37±0.75 mm dan 8.00±0.00
17
mm (Lampiran 12). Kondisi tersebut merupakan suhu stabilitas dari aktivitas protein lektin mikroalga BTM 11. Gambar aktivitas antibakteri hasil karakterisasi suhu dan logam terdapat pada Lampiran 13. Menurut Han et al. (2012) menyatakan bahwa protein lektin alga hijau Bryopsis plumosa dapat stabil pada suhu 70 oC. Protein lektin BTM 11 stabil pada suhu maksimal 50 oC. Setiap mikroalga memiliki karakteristik suhu yang berbeda. Kerusakan ikatan protein terjadi pada suhu 60 oC.
Tabel 6 Karakteristik suhu protein mikroalga
Bakteri Kontrol (+) Kontrol (-) Diameter zona hambat (mm)±SD 30 oC 50 oC 70 oC 90 oC
S. typhii 8.50±1.73 - 8.37±0.75 8.00±0.00 - -
Keterangan: Diameter paper disk 6 mm
Hasil karakterisasi penambahan logam dapat dilihat pada Tabel 7. Perlakuan logam MgCl2 dan CaCl2 menunjukkan aktivitas hambatnya 8 mm dan 8.5 mm (Lampiran 14). Berdasarkan hasil data menunjukkan aktivitas protein lektin tetap stabil dengan penambahan dua logam tersebut. Fungsi penambahan logam adalah untuk membantu proses katalisasi protein. Logam CaCl2 dan MgCl2 tidak menghambat aktivitas protein lektin. Ca2+ dan Mg2+ merupakan ion divalen yang memiliki bilangan koordinasi yang lebih besar daripada ion logam monovalen. Praseptiangga et al. (2012) menyatakan protein lektin Codium barbatum tidak dipengaruhi dengan adanya divalent kation Ca2+ dan Mg2+ yaitu ditunjukkan dengan aktivitas tetap stabil dengan penambahan logam.
Tabel 7 Karakteristik protein lektin terhadap logam
Bakteri Kontrol (+) Kontrol (-) Diameter zona hambat (mm)±SD
MgCl2 CaCl2
S. typhii 8.0 ± 0.0 - 8.0 ± 0.40 8.5 ± 0.0
Keterangan: Diameter paper disk 6 mm
Aktivitas Inhibisi Protein Lektin Terhadap Enzim RNA Helikase Hepatitis C
Ekspresi dan Purifikasi Enzim RNA Helikase
Ekspresi dan pemurnian RNA helikase Hepatitis C Virus (HCV) dilakukan untuk memperoleh RNA helikase HCV murni yang dapat digunakan dalam pengujian aktivitas protein lektin inhibitor terhadap aktivitas ATPase. Enzim RNA helikase virus hepatitis C rekombinan dari bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS berhasil dipurifikasi. Gambar 7 menunjukkan pita hasil SDS-PAGE RNA helikase HCV.
Terlihat pada Gambar 7, adalah pita band proses pemurnian enzim RNA helikase mulai dari supernatant hingga diperoleh enzim RNA helikase. SN merupakan supernatan hasil lisis sel. P merupakan pelet sel. W1 dan W2 adalah hasil pencucian binding resin TALON yang tidak menunjukkan terdapatnya pita protein. Hal ini dikarenakan yang terdapat pada tahap tersebut hanya buffer B.
18
Lajur E yang tebal pada ukuran 54 kDa adalah enzim RNA helikase. Hasil pita protein ukuran 54 kDa ini sesuai dengan hasil penelitian Utama et al. (2000). Kultur bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS dapat tumbuh dengan baik dalam media Luria Bertani (LB) yang ditandai dengan perubahan warna media LB dari kuning cerah menjadi kuning kekeruhan. Penambahan ampisilin (100 mg/mL) ke dalam kultur bertujuan sebagai seleksi terhadap bakteri yang hidup pada media.
Gambar 7 SDS-PAGE pemurnian enzim RNA helikase HCV (M : marker (260-10 kDa); SN: supernatan; P: pelet; W: washing; IV: inner volume; E: enzim)
Ekpresi enzim RNA helikase virus hepatitis C dilakukan dengan penambahan Isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) di awal fase logaritmik (OD600 = 0.3) hingga fase stasioner (OD600 = 1). Produksi enzim RNA helikase virus hepatitis C tidak selalu berjalan dengan baik. Hal ini dipengaruhi oleh berbagai faktor, diantaranya dari bakteri E.coli BL21 (DE3) pLysS dan teknik purifikasi. Enzim RNA helikase virus hepatitis C selanjutnya diproduksi terus menerus selama penelitian dan digunakan sebagai target untuk pengujian aktivitas inhibisi ATPase dengan protein lekti mikrolaga BTM 11.
Aktivitas Inhibisi Protein Lektin Terhadap RNA Helikase Hepatitis C
Pengujian aktivitas inhibisi enzim RNA helikase virus hepatitis C menggunakan uji ATPase kolorimetri (Utama et al. 2000) yaitu dengan mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP dan fosfat anorganik (Pi). Sampel uji aktivitas inhibisi menggunakan ekstrak kasar protein lektin. Hasil uji inhibisi protein lektin mikroalga BTM 11 menunjukkan pada sampel dilusi 40x mampu menghambat aktivitas RNA helikase Hepatitis C sebesar 57.90% sedangkan pada sampel dilusi 80x aktivitas inhibisinya mencapai 27.55%. Nilai absorbansi uji aktivitas inhibisi terhadap RNA helikase HCV dapat dilihat pada Lampiran 15. Semakin rendah konsentrasi protein lektin akan menyebabkan aktivitas inhibisinya menurun. Mustopa et al. (2015) menyatakan aktivitas inhibisi enzim RNA helikase HCV dari ekstrak kasar mikroalga BTM 11 mampu menghambat hingga 80% (dilusi 5x). Adapun hasil purifikasi kolom filtrasi gel senyawa polisakarida mampu menghambat 78% pada fraksi ke-13.
54 kDa M SN P W1 W2 IV E 260 140 95 72 52 42 34 26 17 10 54 kDa
19
Aktivitas inhibisi protein lektin dalam penelitian ini lebih tinggi dibandingkan pada hasil ekstrak kasar dan purifikasi polisakarida mikroalga BTM 11.
Protein lektin BTM 11 mampu bersifat sebagai antivirus. Penelitian Huskens dan Dominique (2012) menyatakan hepatitis C mampu dihambat oleh protein lektin mikroalga. Proses replikasi virus terhambat oleh protein lektin yang mengikat bagian polisakarida virus seperti keterangan pada Gambar 8. Struktur genom virus HCV terdiri struktural protein dan non struktural protein. Struktural protein terdapat bagian E1 dan E2 yang merupakan glikoprotein selubung virusnya. Daerah E2 juga terdapat sisi pengikatan terhadap cluster of differentiation 81 (CD81), reseptor virus pada hepatosit dan sel limfosit B. Proses penghambatan terjadi karena interaksi lektin dengan permukan glikoprotein virus HCV (E1 dan E2). Permukaan sel HCV dalam bentuk glikoprotein yang tinggi glikosilat. Mekanisme kerja lektin dengan mengikat N-linked glikan permukaan virus. Aktivitas dilanjutkan dengan memblok interaksi diantara protein E2 dari struktur genom HCV dan CD81 yang merupakan molekul sel dalam permukaan virus HCV untuk proses transkripsi virus ke jaringan sel. Akibatnya indikator molekul antiviral kecil sebagai target glikan HCV dapat ditentukan untuk mengganggu mekanisme kerja virus (Takebe et al. 2013)
.
Gambar 8 Struktur genom virus hepatitis C (sumber: Wong dan Cheng 2014)
Aktivitas Antibakteri Protein Lektin Mikroalga BTM 11 Aktivitas protein protein lektin hasil presipitasi amonium sulfat diuji menggunakan bakteri Gram-positif dan Gram-negatif seperti yang ditunjukkan pada Tabel 8. Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Salmonella typhii
ATCC 25241 menunjukkan terbentuknya zona hambat karena penambahan ekstrak kasar protein lektin. Hasil observasi setelah 24 jam menunjukkan zona hambat yang cenderung menurun. Hasil ini menunjukkan bahwa protein lektin mempunyai aktivitas antibakteri pada bakteri Gram-positif dan Gram-negatif. Zona hambat protein lektin dapat dilihat pada Tabel 9. Sampel protein lektin