Sampel kentang berasal dari penangkar benih kentang di tiga sentra produksi kentang di Pulau Jawa yaitu pertama Desa Margamukti, Kecamatan Pangalengan, Kabupaten Bandung (Jawa Barat) yang terletak pada ketinggian 1470 mdpl, dengan posisi S: 070 11.876’ dan E: 1070 36.497’ dengan suhu 200C. Lokasi yang kedua berasal Desa Wanayasa, Kecamatan Batur, Kabupaten Banjarnegara (Jawa Tengah) yang terletak pada ketinggian 1400 mdpl, dengan posisi S: 070 12. 087’ dan E: 1090 46.057’ dengan suhu 200C . Lokasi yang ketiga berada di Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu (Jawa Timur) yang berada pada ketinggian 1635 mdpl dan berada pada posisi S: 070 76. 359’ dan E: 1120 52. 545’ (Gambar 3).
Gambar 3 Lokasi pertanaman kentang (a) Pangalengan (Jawa Barat); (b) Banjarnegara (Jawa Tengah); (c) Kota Batu (Jawa Timur)
Gejala Penyakit Meloidogyne spp.
Gejala pada umbi kentang yang terinfeksi Meloidogyne spp. yaitu permukaan kulit umbi tidak rata, bergelombang dan berbintil dan terkadang disertai dengan adanya infeksi dari patogen lain sehingga umumnya umbi cepat busuk (Gambar 4). Bentuk dan ukuran puru tergantung kepada spesies nematoda, jenis tanaman dan faktor lingkungan (Decker 1988). Bagian umbi yang sakit bila bagian kulit luarnya dibuka akan tampak bercak-bercak berwarna krem kekuningan dan bila dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran rendah akan tampak nematoda betina (Gambar 5).
Gambar 4 Variasi gejala yang disebabkan oleh Meloidogyne spp. pada umbi (a) permukaan kulit umbi tidak rata; (b) bergelombang; (c) berbintil
a a b b c c
15
Gambar 5 Gejala nekrosis pada umbi kentang yang terinfeksi Meloidogyne spp.. Secara umum, bobot umbi yang terserang Meloidogyne spp. lebih rendah dibandingkan dengan umbi yang sehat. Infeksi M. incognita pada kentang, secara statistik dapat mengurangi bobot umbi pada kentang (Gondal et al. 2012). Nematoda betina Meloidogyne spp. yang terdapat dalam umbi terdiri atas berbagai stadia, mulai stadia muda hingga dewasa dengan massa telur (Gambar 6).
Dalam satu umbi, terdapat beberapa spesies Meloidogyne yang dapat menginfeksi bersama. Umbi yang terserang akan berwarna kecoklatan dan neksrosis pada bagian dalam umbi. Nekrosis pada umbi ini terjadi karena adanya reaksi enzimatis yang dikeluarkan oleh nematoda Meloidogyne spp.. Reaksi ini menyebabkan hancurnya jaringan pektin pada umbi. Nematoda parasit umunya menyebabkan terjadinya pektinolitik pada jaringan inang. Pada akar, sekresi enzim selulase dan pektinase juga mampu mendegradasi sel hingga ujung akar luka dan pecah, hal ini menyebabkan auksin tidak aktif. Tidak aktifnya auksin maka pertumbuhan tanaman terhambat (Supramana et al. 2008).
Setiap massa telur berisi 300-400 butir telur Meloidogyne spp. Batas toleransi untuk M. incognita pada kentang diperkirakan 1.2 telur dan juvenil/cm3 tanah (Russo et al. 2007) lebih besar dibandingkan untuk M. hapla yaitu 50 telur/250 cm3 tanah (Brodie et al. 1993) dan 0.50-0.64 telur dan juvenil instar 2/cm3 tanah untuk M. javanica dalam pot percobaan di rumah kaca(Vovlas et al. 2005).
Gambar 6 Nematoda betina Meloidogyne spp. dengan massa telur (a) nematoda betina; (b) massa telur
a
16
Spesies Meloidogyne berdasarkan Morfologi Pola Perineal
Tiga spesies Meloidogyne, yaitu M. incognita, M. javanica, dan M. arenaria
berhasil diidentifikasi secara morfologi melalui sidik pantat (pola perineal) nematoda betina pada ketiga sampel asal Jawa Barat, Jawa Tengah dan JawaTimur. M. incognita dan M. javanica ditemukan pada ketiga lokasi, sedangkan M. arenaria ditemukan pada sampel asal Pangalengan.
Gambar 7 memperlihatkan adanya ciri khusus dari M. incognita. Lengkungan striae bagian dorsal berbentuk persegi (sudut ± 90◦) dan merupakan karakter khusus dari M. incognita (Eissenback et al. 1981). M. javanica terlihat menunjukkan adanya garis lateral yang jelas pada daerah yang memisahkan bagian dorsal dan juga ventral (Gambar 8). M. javanica memiliki ciri khusus yaitu adanya dua garis lateral yang memisahkan antara bagian dorsal dan ventral (Eissenback et al. 1991). Secara khusus pola perineal dari M. arenaria sangat bervariasi (Gambar 10). Ciri tersebut ditandai dengan lengkungan tepi yang rendah dan bulat, dengan striae yang halus hingga bergelombang (Eissenback & Triantaphyllou 1991).
Gambar 7 Pola perineal M. incognita (Perbesaran 400x). (a) M. incognita menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. incognita asal Pangalengan; (c) M. incognita asal Banjarnegara; (d) M. incognita
17
Gambar 8 Pola perineal M. javanica (Perbesaran 400x). (a) M. javanica menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. javanica asal Pangalengan; (c) M. javanica asal Banjarnegara; (d) M. javanica asal Kota Batu
Gambar 9 Pola perineal M.arenaria (Perbesaran 400x). (a) M. arenaria menurut Eissenback et al. (1981); (b) M. arenaria asal Pangalengan
Namun demikian, pengidentifikasian secara morfologi sangat sulit karena membutuhkan keahlian dan keterampilan karena spesies nematoda puru akar (NPA) secara morfologi sama atau serupa satu dengan yang lain. Selain itu, lebih dari satu jenis NPA menginfeksi bersama dalam satu tanaman sehingga identifikasi NPA secara cepat dan akurat dibutuhkan untuk pengendalian dan pemuliaan tanaman (Devran & Sogut 2009).
Spesies Meloidogyne berdasarkan ITS r-DNA
PCR menggunakan primer spesifik spesies M. javanica terhadap sampel NPA dari Pangalengan (Jawa Barat), Banjarnegara (Jawa Tengah), dan Kota Batu (Jawa Timur) berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 720 pb (Gambar 10).
18
720 pb
1 2 3
M
Gambar 10 Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. javanica (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu
Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat M. javanica. Hasil sampel yang positif terdeteksi M. javanica, kemudian dilakukan Sikuensing untuk mengetahui urutan nukleotida M. javanica yang berasal dari Indonesia, dalam hal ini hanya satu sampel saja yang disekeunsing yaitu sampel yang berasal dari Pangalengan, Jawa Barat.
Hasil amplifikasi PCR diperkuat oleh hasil analisis homologi Sikuen nukleotida. Sikuen nukleotida NPA asal Pangalengan, Jawa Barat memiliki
tingkat kemiripan yang sangat tinggi (homologi 95.7%) dengan spesies
M. javanica asal Cina, sedangkan dengan spesies lain (M. incognnita, M. arenaria
dan M. hapla) tingkat kemiripan hanya sebesar 37.0%, 37.4%, dan 31.9% (Tabel 2). Hal ini memperkuat hasil identifikasi, bahwa spesies Meloidogyne asal Pangalengan, Jawa Barat adalah M. javanica.
Tabel 2 Homologi sikuen nukleotida M. javanica asal Pangalengan dengan
M. javanica yang ada di Gen Banka)
No Asal isolate Homologi (%)
1 2 3 4 5 6 7 8 1 M. javanica Pangalengan ID 2 M .javanica China (JN005834) 95.7 ID 3 M .javanica Malaysia (KF041327) 95.0 98.8 ID 4 M. javanica China (JN005835) 95.4 99.6 98.5 ID 5 M . javanica Malaysia (KF041310) 95.4 99.2 99.2 98.8 ID 6 M .incognita Pangalengan 37.0 37.6 37.9 37.2 37.7 ID 7 M.arenaria USA (AF387098.1) 37.4 38.3 37.9 37.9 38.1 39.8 ID 8 M. hapla China (JX024147.1) 31.9 33.5 33.3 33.3 33.7 34.4 38.5 ID
19 M.javanica_Malaysia_KF041327 M.javanica_Malaysia_KF041305 M.javanica_Malaysia_KF041310 M.javanica_China_JN005835 M.javanica_China_JN005834 M.javanica_China_JN005837 M.javanica_Pangalengan M. javanica_India_KP411881 M. javanica_India_KP411880 M. hapla_China_JX024147.1 99 99 95 85 81 50 28 0.2
Gambar 11 Pohon filogeni M. javanica yang menginfeksi kentang di Pangalengan, Jawa Barat
Berdasarkan analisis filogenetik, M. javanica asal Pangalengan, Jawa Barat menjadi satu kelompok dengan M. javanica asal Cina dan Malaysia dan terpisah dari M. javanica asal India. Hal ini menunjukkan tingkat kekerabatan yang dekat antara M. javanica asal Pangalengan dengan M. javanica asal Cina dan Malaysia (Gambar 11).
PCR menggunakan primer spesifik spesies M. incognita terhadap sampel NPA dari Pangalengan (Jawa Barat) dan Kota Batu (Jawa Timur) berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 999 pb (Gambar 12). Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat
M. incognita. Hasil sampel yang positif terdeteksi M. incognita, kemudian dilakukan sikuensing untuk mengetahui urutan nukleotida M. incognita yang berasal dari Indonesia, dalam hal ini hanya satu sampel saja yang disikeunsing yaitu sampel yang berasal dari Pangalengan, Jawa Barat
Keberadaan M. incognita juga diperkuat dengan analisis homologi nukleotida. Sikuen nukleotida NPA asal Pangalengan, Jawa Barat memiliki tingkat kemiripan yang sangat tinggi (homologi 99.8%) dengan spesies
M.incognita asal Cina, sedangkan dengan spesies lain (M. arenaria, M. hapla dan
M. javanica) tingkat kemiripan hanya sebesar 35.8%, 37.0%, dan 32.2% (Tabel 3). Hal ini memperkuat hasil identifikasi, bahwa spesies Meloidogyne asal Pangalengan, Jawa Barat adalah M. incognita.
Gambar 12 Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. incognita (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu)
999 pb
20 M. incognita_Pangalengan M. incognita_China_KF481971 M. incognita_China_JN005841 M. incognita_India_KP411876 M.incognita_Malaysia_KF041337 M. incognita_Malaysia_KF041328 M.incognita_India_KP411875 M. arenaria_USA_AF387098.1 75 35 24 6 7 0.2
Tabel 3 Homologi sikuen nukleotida M. incognita asal Pangalengan dengan
M. incognita yang ada di GenBanka)
No Asal isolat Homologi (%)
1 2 3 4 5 6 7 1 M. incognita Pangalengan ID 2 M. incognita China (JN005841) 99.8 ID 3 M. incognita India (KP411876) 99.6 99.8 ID 4 M. incognita Malaysia (KF041337) 99.2 99.4 99.2 ID 5 M. arenaria USA (AF387098.1) 35.8 35.9 35.9 36.1 ID 6 M. hapla China (JX024147.1) 37.0 36.8 36.8 36.6 33.8 ID 7 M. javanica Pangalengan 32.2 32 31.9 32.2 36.5 28.9 ID
a) Tingkat kemiripan basa nukleotida M. incognita dihitung menggunakan Program Bioedit versi 6.05
Gambar 13 Pohon filogeni M. incognita yang menginfeksi kentang di Pangalengan, Jawa Barat
Berdasarkan analisis filogenetik, M. incognita asal Pangalengan, Jawa Barat menjadi satu kelompok dengan M. incognita asal Cina, India, dan Malaysia. Hal ini menunjukkan tingkat kekerabatan yang dekat antara M. incognita asal Pangalengan dengan M.incognita asal Cina, India, dan Malaysia (Gambar 13).
PCR menggunakan primer spesifik spesies M. arenaria terhadap sampel NPA dari Pangalengan (Jawa Barat) dan Banjarnegara (Jawa Tengah) berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 420 pb (Gambar 14). Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat
M. arenaria. Hasil sampel yang positif terdeteksi M. arenaria, kemudian dilakukan sikuensing untuk mengetahui urutan nukleotida M. arenaria yang berasal dari Indonesia, dalam hal ini hanya satu sampel saja yang disekeunsing yaitu sampel yang berasal dari Banjarnegara, Jawa Tengah. Namun, hasil sikuensing tidak dapat dianalisis homologinya dikarenakan belum tersedianya data di Gen Bank tentang M. arenaria dengan primer SCAR.
21
Gambar 14 Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne spp. dengan menggunakan primer spesifik M. arenaria (M: Marker 100 pb; 1: Pangalengan; 2: Banjarnegara; 3: Kota Batu)
Pembahasan Umum
Analisis perbandingan antara bagian yang mengkode dan tidak mengkode pada DNA ribosom (rDNA) menjadi alat yang populer untuk mengidentifikasi spesies dan subspesies pada banyak organisme. DNA ribosom (rDNA) eukariot adalah susunan berulang yang terdiri atas tiga gen (18S, 28S, dan 5.8S), internal dan eksternal transcribed spacer, dan eksternal non transcribed spacer (Zijlstra et al. 1995). Internal transcribed spacer (ITS) adalah wilayah yang terletak antara gen 18S dan 28S daerah DNA ribosom (rDNA). ITS ini dapat digunakan untuk membuat pohon filogeni, memperkirakan struktur genetik populasi, mengevaluasi proses evolusi pada tingkat populasi, dan menentukan identitas taksonomi (Powers et al. 1997). Ukuran wilayah ITS sangat bervariasi diantara genus nematoda dan bahkan diantara beberapa spesies dalam satu genus (Powers et al. 1997). Hal ini menyebabkan penggunaan ITS sebagai target amplifikasi DNA untuk identifikasi pada tingkat spesies sangat berkembang.
Secara umum, deteksi dan identifikasi spesies Meloidogyne penyebab umbi berbintil pada kentang di Pulau Jawa dengan ITS rDNA sebagai target amplifikasi mendapatkan tiga spesies Meloidogyne yaitu M. javanica, M. incognita, dan
M. arenaria. M. javanica terdeteksi pada tiga lokasi yaitu di Pangalengan, Banjarnegara, dan juga Kota Batu, M. incognita terdeteksi di Pangalengan dan Kota Batu dan M. arenaria hanya terdeteksi di Pangalengan dan Banjarnegara saja. Hal ini sangat berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Hikmia (2012) pada tanaman wortel di Kota Batu terdapat empat spesies Meloidogyne
yaitu M. arenaria, M. hapla, M. javanica, dan M. incognita. Faktor iklim terutama
suhu di Kota Batu sangat cocok untuk perkembangan M. hapla dan juga
M. arenaria, dimana suhu tanah rata-rata Kota Batu adalah 15 -19◦C (Hikmia 2012).
M. arenaria merupakan nematoda puru akar yang disebut juga peanut root knot nematode. Spesies ini terdiri atas dua ras, ras pertama dapat diperbanyak pada kacang tanah sedangkan ras kedua tidak (Eissenback et al.1981). Kentang merupakan salah satu inang yang dominan bagi spesies ini. Nematoda ini memiliki kisaran inang yang luas yaitu tanaman dikotil, monokotil, rumput dan juga tanaman berkayu. M. arenaria juga pernah ditemukan pada wortel di Dataran Tinggi Malino (Sulawesi Selatan) (Mirsam et al. 2015).
Tidak terdeteksinya M. arenaria pada tanaman kentang di Kota Batu kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal. Pertama, sampel yang digunakan
420 pb
22
tidak mewakili populasi yang sebenarnya dimana kemungkinan M. arenaria
sudah ada di wilayah tersebut namun tidak terdapat pada sampel yang digunakan untuk pengujian. Kedua, daerah Kota Batu tidak terdapat M. arenaria pada umbi kentang berbintil dan kemungkinan bintil yang terdapat pada umbi disebabkan oleh dua spesies Meloidogyne yang lain yaitu M. javanica dan M. incognita.
Deteksi dan identifikasi M. chitwoodi, M. fallax, dan M. hapla dengan menggunakan primer multipleks tidak berhasil mengamplifikasi pita DNA pada ukuran masing-masing 670 pb, 540 pb, dan 440 pb. Ini menunjukkan bahwa pada sampel umbi kentang berbintil tersebut tidak terdapatnya ketiga spesies
Meloidogyne yang umumnya terdapat pada daerah beriklim dingin.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hikmia (2012), M. hapla
terdeteksi dan teridentifikasi pada tanaman wortel yang menunjukkan gejala umbi bercabang di Kota Batu, Jawa Timur. Sementara itu, Kurniawan (2010) mendeteksi keberadaan M. fallax di daerah Cianjur, Jawa Barat pada komoditas wortel. Tidak terdeteksinya ketiga spesies ini (M. chitwoodi, M. fallax, dan
M. hapla) pada umbi berbintil kentang tidak menutup kemungkinan bahwa ketiga spesies tersebut sudah ada hanya saja diperlukan teknik pengambilan sampel yang tepat yang dapat mewakili populasi Meloidogyne yang sebenarnya di lapang.
Dari ketiga spesies tersebut, M. chitwoodi dan M. hapla termasuk dalam daftar OPTK, dimana M. chitwoodi termasuk OPTK A1 sedangkan M. hapla
termasuk OPTK A2. OPTK A1 artinya OPTK tersebut belum terdapat di Indonesia dan dicegah masuk dan tersebarnya di dalam wilayah Negara Kesatuan Republik Indonesia (NKRI), sedangkan OPTK A2 sudah terdapat di Indonesia hanya masih terbatas penyebarannya. M. fallax belum masuk ke dalam daftar OPTK Indonesia, namun di Eropa M. fallax dan M. chitwoodi sudah menjadi target OPTK pada kentang.
Menurut Brodie et al. (1993), M. incognita. M. javanica, dan M. arenaria
menyebabkan kerusakan pada kentang di daerah tropis dan juga subtropis. Infeksi
Meloidogyne spp. pada umbi kentang telah dilaporkan sebelumnya di Arab Saudi
(Al-Hazmi et al. 1993) dan Turki (Cinarli & Eterkin 1996). Tercatat perkiraan distribusi penyebaran Meloidogyne spp. pada lahan pertanian di Pakistan yaitu
M. incognita sebesar 58%, M. javanica sebesar 31%, M. arenaria sebesar 8%,
M. hapla sebesar 7% dan spesies lain kira-kira 2% (Maqbool 1986). Selain itu,
M. arenaria dan M. hapla pernah dilaporkan pertama kali menginfeksi pepino (Solanum muricatum Aiton) di Turki (Akyazi et al. 2012).
M. incognita merupakan spesies yang berbahaya dari genus Meloidogyne
karena sebarannya yang luas. Indonesia merupakan salah satu wilayah persebaran nematoda puru akar ini (Decker 1988). Terdapat empat ras M. incognita di seluruh dunia dan keempatnya dapat bereproduksi pada lada, semangka dan tomat (Eissenback et al. 1981). Spesies ini banyak terdapat pada daerah dengan suhu tahunan rata-rata 18◦C hingga 30◦C, dengan populasi terbanyak terdapat pada suhu 24◦C hingga 27◦C (Taylor et al. 1982).
M. javanica pernah dilaporkan sebagai penyebab umbi bercabang pada wortel di daerah Agropolitan Cianjur, Jawa Barat ( Kurniawan 2010), Dieng, Jawa Tengah (Taher et al. 2012), dan Kota Batu, Jawa Timur (Hikmia et al. 2012). Penelitian yang dilakukan oleh Halimah et al. (2014) menunjukkan bahwa
M. javanica yang menginfeksi wortel di Cianjur, Jawa Barat berkerabat sangat dekat dengan M. javanica asal Cina dengan tingkat homologi mencapai 91.9%.
23
Infeksi yang parah pada kentang yang disebabkan oleh M. javanica terjadi di Zabbar (Malta) dan kerusakan yang parah pada pertanaman kentang yang disebabkan nematoda ini berpotensi tersebar dari tanaman kentang sebelumnya di wilayah Eropa (Vovlas et al. 2005). Rotasi tanaman kentang dengan tanaman wortel juga kemungkinan dapat menjadi penyebab tersebarnya M. javanica.
Analisis sekuen nukleotida terhadap M. javanica dan M. incognita
menunjukkan hubungan kekerabatan yang dekat antara M. javanica dan
M. incognita asal Pangalengan dengan M. javanica dan M. incognita asal Cina. Diduga masuknya M. incognita dan M. javanica pada kentang ke Indonesia khususnya di Pangalengan melalui perdagangan bibit kentang dari Cina. Pusdatin (2013) mencatat bahwa Cina termasuk salah satu negara pengekspor benih kentang ke Indonesia.
Terdapatnya ketiga spesies Meloidogyne tersebut (M. arenaria, M. javanica, dan M. incognita) pada tanaman kentang di ketiga sentra kentang di Pulau Jawa memberikan gambaran bahwa nematoda tersebut merupakan ancaman terhadap pertanian Indonesia, mungkin dampaknya bisa seperti Globodera spp. jika tidak dikendalikan terutama saat awal tanam dengan penggunaan benih yang sehat. Menurut BPSPBTH (1997), batas toleransi keberadaan Meloidogyne spp. pada benih pokok (G3) dan benih sebar (G4) sebesar 5.0% sedangkan pada benih dasar (G2) sebesar 3.0%.
Pencegahan masuknya OPTK dari spesies Meloidogyne ini pada kentang mutlak dilakukan mengingat pemasukan bibit kentang dari daerah yang endemik terhadap M. chitwoodi dan M. fallax. Deteksi yang dilakukan di Badan Karantina terutama di pintu-pintu pemasukan kentang hendaknya dilakukan dengan metode yang tepat, cepat dan akurat. Metode identifikasi secara molekuler dengan PCR dengan menggunakan ITS rDNA sebagai target amplifikasi dapat dijadikan metode andalan.