Hasil
Morfologi Sel-Sel yang Berkembang dalam Kultur Sel Sumsum Tulang
Sel-sel yang berkembang dalam kultur sel sumsum tulang tikus berdasarkan morfologinya antara lain mesenchymal cell-like, fibroblast cell-like, hematositoblas, osteoblas dan khondroblas serta progenitor sel saraf. Mesencymal cell-fusifom memiliki inti sel besar dan pucat dengan anak inti satu atau lebih serta sitoplasma memiliki berbagai penjuluran (Gambar 3). Fibroblast cell-like memiliki morfologi inti sel kecil, lonjong dan gelap dengan sitoplasma berbentuk lonjong dan panjang atau memiliki berbagai penjuluran. Hematositoblas memiliki morfologi berbagai bentuk sel darah (Gambar 4). Khondroblas dapat diidentifikasi dari morfologinya yang memiliki inti sel terletak di tepi sel dengan sitoplasma yang agak membulat dan osteoblast dapat teridentifikasi apabila sel-sel ini telah membentuk suatu koloni. Progenitor sel saraf memiliki morfologi yang khas dengan penjuluran akson yang panjang. Bone marrow mesenchymal stem cell memiliki morfologi sebagai mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like.
Gambar 3 Morfologi BM-MSC dalam kultur in vitro. (A) Mesenchymal cell-fusiform. (B) Fibroblast cell-like. Pewarnanaan HE. Bar: 1 μm.
Gambar 4 Morfologi sel lain yang berkembang di dalam kultur sel sumsum tulang. (A) Progenitor sel saraf. (B) Hematositoblas. (C) Koloni osteoblas. Pewarnaan HE. Bar: 1 μm.
Identifikasi Pluripotensi Berdasarkan Reaksi terhadap Alkalin Fosfatase
Kultur sel sumsum tulang pada tiap perlakuan dilakukan pewarnaan alkalin fosfatase pada hari ke-1, ke-4 dan ke-7 setelah kultur. Sel-sel di dalam kultur yang bereaksi positif akan berwarna merah sedangkan sel yang bereaksi negatif akan berwarna kuning saat pengamatan. Hasil pengamatan diperoleh bahwa mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like serta hematositoblas bereaksi positif terhadap pewarnaan alkalin fosfatase (Gambar 5).
Persentase sel yang bereaksi positif terhadap ALP pada kultur sel sumsum tulang tikus dalam mDMEM menunjukkan adanya penurunan dari hari ke-1 sampai ke-7, sedangkan kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dengan dan tanpa LIF mengalami peningkatan (Gambar 6). Penambahan LIF ke dalam mDMEM yang telah ditambah CM-REF menunjukkan peningkatan yang berbeda nyata (P<0,05) terhadap persentase sel yang bereaksi positif terhadap ALP pada hari ke-7 dibandingkan dengan tanpa LIF.
A
B
A
B
Gambar 5 Sel-sel kultur sumsum tulang yang bereaksi positif terhadap ALP. (A) hematositoblas. (B) mesenchymal cell-fusiform. Bar: 1 μm.
Gambar 6 Persentase sel sumsum tulang tikus yang menunjukkan positif terhadap ALP selama 7 hari kultur in vitro dalam medium yang berbeda.
Tingkat Proliferasi BM-MSC dalam Kultur Sel Sumsum Tulang
Kultur sel sumsum tulang dalam mDMEM terjadi peningkatan persentase pada tiap jenis sel kecuali hematositoblas, khondroblas dan osteoblas (Gambar 7).
Gambar 7 Persentase jenis sel yang berkembang selama kultur sel sumsum tulang dalam medium mDMEM.
Kultur sel sumsum tulang dalam mDMEM yang ditambah dengan CM-REF dengan dan tanpa LIF menunjukkan peningkatan persentase mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like (Gambar 8 dan 9). Fibroblast cell-like pada kultur dalam medium mDMEM yang ditambah CM-REF dengan dan tanpa LIF menunjukkan peningkatan persentase sel yang berbeda nyata (P<0,05 ) dibandingkan kultur dalam medium mDMEM tanpa penambahan keduanya (Gambar 11, 12, dan 13). Persentase mesenchymal cell-like dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dibandingkan dengan tanpa penambahan CM-REF dan LIF secara umum relatif sama, namun pada kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dan LIF menunjukkan peningkatan persentase yang berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan kultur dalam medium tanpa penambahan CM-REF dan LIF. Persentase mesenchymal cell-like pada kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dan LIF relatif sama dengan dalam mDMEM yang ditambah CM-REF tanpa LIF. Namun demikian, pada hari ke-7 kultur terdapat peningkatan
yang berbeda nyata (P<0,05) pada kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dan LIF dibandingkan dengan kultur dalam medium tanpa penambahan LIF. Persentase progenitor sel saraf secara umum pada kedua medium mengalami peningkatan dan akan menurun kembali. Khondroblast dan osteoblas secara umum pada kedua medium juga mengalami penurunan persentase sel selama kultur. Hematositoblas mengalami penurunan persentase sel selama kultur pada ketiga medium yang digunakan.
Gambar 8 Persentase jenis sel yang berkembang selama kultur sel sumsum tulang dalam mDMEM yang ditambah dengan CM-REF.
Gambar 9 Persentase jenis sel yang berkembang selama kultur sel sumsum tulang dalam medium mDMEM yang ditambah dengan CM-REF dan LIF.
Tingkat proliferasi BM-MSC dievaluasi berdasarkan persentase mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like . Kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dengan dan tanpa LIF pada hari ke-10 kultur menunjukkan peningkatan persentase BM-MSC yang berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan dengan kultur dalam mDMEM (Gambar 10). Namun demikian, persentase BM-MSC pada kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF dan LIF tidak menunjukkan perbedaan yang nyata dibandingkan dengan kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF tanpa LIF.
Gambar 10 Persentase BM-MSC pada hari ke-10 kultur dalam ketiga macam medium yang digunakan.
Pembahasan
Morfologi Sel-Sel yang Berkembang dalam Kultur Sel Sumsum Tulang
Pengamatan morfologi sel-sel yang berkembang dalam kultur sumsum tulang pada penelitian ini dikelompokkan menjadi 4 kelompok yaitu (1) bone marrow mesenchmal stem cell (BM-MSC) memiliki morfologi mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like, (2) hematositoblas, (3) progenitor sel saraf dan (4) khondroblas dan osteoblas. Bentuk BM-MSC dalam pengamatan sejalan dengan pernyataan Aini et al. (2008) bahwa MSC memiliki morfologi fusiform dan fibroblast like. Mesenchymal cell-fusiform memiliki inti sel besar dan pucat dengan anak inti satu atau lebih serta sitoplasma memiliki berbagai. Inti
mesenchymal cell-fusiform berwarna pucat dikarenakan inti sel tersebut bersifat basa lemah (Kuehnel 2003) sehingga dalam pewarnaan HE inti sel menyerap sedikit pewarna hematoksilin. Fibroblast-cell like secara morfologi memiliki inti sel kecil dan gelap daripada inti dengan sitoplasma yang berbentuk lonjong dan panjang atau memiliki berbagai penjuluran. Hematositoblas memiliki morfologi berbagai bentuk sel darah. Khondroblas dapat diidentifikasi dari morfologinya yang memiliki inti di tepi dengan sitoplasma yang agak membulat dan osteoblas dapat diidentifikasi jika sel-sel ini telah membentuk suatu koloni. Progenitor sel saraf memiliki morfologi yang khas dengan penjuluran akson yang panjang. Adanya bermacam-macam sel yang berkembang membuktikan bahwa kultur sumsum tulang mampu menghasilkan berbagai jenis sel. Hal tersebut didukung oleh Sussman (2001) yang menyatakan bahwa MSC di dalam kultur mudah berdiferensiasi secara spontan menjadi berbagai jenis sel.
Mesenchymal stem cell yang ada di dalam sumsum tulang secara in vitro akan berkembang menjadi osteoblas, khondroblas dan sel adiposa (Aini et al. 2008). Tidak ditemukannya sel adiposa yang berkembang pada kultur sel sumsum tulang pada penelitian ini dikarenakan sitoplasma sel adiposa yang terdiri dari vakuola lemak dapat larut dalam alkohol saat proses pewarnaan sehingga sel tidak teramati saat pengamatan. Sel adiposa dalam kultur sel sumsum tulang dapat teridentifikasi apabila menggunakan pewarnaan Oil Red O (Wobus dan Boheler 2006).
Pluripotensi Kultur Sel Sumsum Tulang
Sel-sel di dalam kultur yang bereaksi positif akan berwarna merah sedangkan sel yang bereaksi negatif akan nampak berwarna kuning. Hasil pengamatan diperoleh bahwa mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like serta hematositoblas bereaksi positif terhadap pewarnaan alkalin fosfatase (Gambar 8), hal tersebut sesuai dengan pernyataan Akhmadieva et al. (2007) dan Iida et al. 2007 bahwa alkalin fosfatase juga terdapat pada sel darah.
Kultur sumsum tulang tikus dalam mDMEM mengalami penurunan persentase sel yang positif terhadap pewarnaan alkalin fosfatase (Gambar 9). Penurunan tersebut menunjukkan adanya penurunan jumlah sel yang pluripoten
dalam kultur sumsum tulang. Ekspresi alkalin fosfatase telah diketahui akan menurun sejalan dengan diferensiasi stem cell (Draper et al. 2002). Hal tersebut membuktikan bahwa dalam kultur sumsum tulang terdapat BM-MSC yang bersifat pluripotensi dan akan menurun kemampuan pluripotensinya dalam kultur in vitro.
Kultur dalam medium mDMEM ditambah CM-REF dengan dan tanpa LIF menunjukkan peningkatan persentase sel-sel yang positif terhadap pewarnaan alkalin fosfatase (Gambar 9). Hal tersebut menunjukkan adanya peningkatan jumlah sel yang bersifat pluripoten. Walaupun persentase tersebut lebih rendah dibandingkan dengan kultur dalam mDMEM, namun peningkatan jumlah sel yang pluripoten menunjukkan bahwa penambahan CM-REF dapat meningkatkan jumlah sel yang pluripoten dalam kultur sumsum tulang tikus.
Peningkatan jumlah sel-sel yang pluripoten dalam kultur sel sumsum tulang dikarenakan CM-REF menghasilkan beberapa bahan yang dapat menghambat diferensiasi dan meningkatkan proliferasi stem cell. Conditioned medium mouse embryonic fibroblast yang diperoleh dengan metode yang sama telah diketahui menghasilkan sitokin dan faktor pertumbuhan yang mampu menghambat diferensiasi sel (Mallon 2006; Tabar et al. 2006), serta matriks yang diperlukan untuk proliferasi dan menjaga pluripotensi stem cell manusia (Prowse et al. 2007). Fibroblas mensekresikan bermacam faktor pertumbuhan termasuk fibroblast growth factors (FGF) (Levenstein et al. 2006). Bendall at al. (2008) telah mendemonstrasikan bahwa di dalam CM-MEF terdapat bFGF. Hal tersebut sejalan dengan Gonzales et al. (1990) yang melaporkan bahwa dalam otot fetus tikus umur kebuntingan 18 hari mengandung sejumlah bFGF. Xu et al (2005) mendemostrasikan bahwa ESC manusia dapat dijaga pluripotensinya dengan bFGF ataupun bFGF dalam kombinasi dengan faktor pertumbuhan.
Prowse et al. (2007) telah mendemonstrasikan bahwa fibroblast conditioned media baik dari fetus manusia, manusia yang baru lahir dan fetus mencit mengandung berbagai protein yang berperan dalam pertumbuhan, pluripotensi serta diferensiasi dari ESC manusia diantaranya yaitu Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) dan transforming growth β1 (TGF- β1). Insulin-like growth factor-1 yang ditemukan pada mencit secara umum dibutuhkan untuk perkembangan dan
pertumbuhan mamalia, mempengaruhi proliferasi sel dan memiliki fungsi anti-apoptosis sehingga faktor pertumbuhan tersebut potensial digunakan dalam kultur stem cell. Pluripotensi stem cell mungkin tidak dapat dipertahankan oleh IGF-1 namun IGF-1 berpengaruh dalam pertumbuhan koloni stem cell. Insulin-like growth faktor-1 dapat menginduksi aktivasi signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) dan bekerja secara sinergis bersama bFGF untuk meningkatkan intensitas dari STAT3 yang telah diteliti mempengaruhi ploriferasi ESC. Seperti halnya IFG-1, TGF-β1 diyakini bekerja secara sinergis bersama bFGF dalam menjaga pluripotensi dari ESC pada manusia.
Peningkatan jumlah sel yang bereaksi positif pada kultur sel sumsum tulang pada medium kultur mDMEM yang ditambah dengan CM-REF dan LIF (Gambar 9) menunjukkan jumlah yang lebih tinggi daripada dalam mDMEM dengan penambahan CM-REF tanpa LIF pada hari ke-7. Sehingga dapat diperoleh suatu hasil bahwa penambahan LIF dalam CM-REF dapat meningkatkan jumlah sel yang pluripoten dalam kultur sel sumsum tulang tikus.
Leukemia inhibitory factor sering digunakan pada kultur stem cell karena kemampuannya dalam mempengaruhi berbagai aktifitas fisiologis termasuk menghambat diferensiasi dari ESC (Gendall et al. 1997; Matsuda et al. 1999). Leukemia inhibitory factor adalah golongan sitokin IL-6 dapat menstimuli sel melalui reseptornya gp130 bersama ligand spesifik LIFR. Aktivasi gp 130 akan mengaktivasi Janus associated tyrosine kinase (JAK) dan mengaktivasi protein STAT3 yang dapat mencegah diferensiasi (Wobus dan Boheler 2006). Leukemia inhibitory factor sebanyak 10-20 ng/mL dinyatakan dapat mempertahankan pluripotensi ESC mencit (Conover et al. 1993) dan pada penelitian ini digunakan LIF sebanyak 10 ng/mL yang ditambahkan dalam CM-REF mampu untuk menginduksi peningkatan jumlah sel yang pluripoten di dalam kultur sel sumsum tulang tikus.
Tingkat Proliferasi BM-MSC dalam Kultur Sel Sumsum Tulang
Kultur sel sumsum tulang dalam medium mDMEM menunjukkan adanya peningkatan jumlah mesenchymal cell-like, fibroblast cell-like, dan progenitor sel saraf. Sedangkan hematositoblas yang berkembang pada ketiga macam medium
kultur mengalami penurunan persentase (Gambar 10, 11 dan 12). Penurunan tersebut dikarenakan hematositoblas akan terbuang saat pergantian medium (Gregory et al. 2005). Leskela dan Ville (2006) menyatakan bahwa kebanyakan hematositoblas yang teridentifikasi akan hilang selama 2-3 minggu kultur MSC.
Morfologi BM-MSC pada kultur in vitro berbentuk mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like. Persentase BM-MSC pada kultur sel sumsum tulang tikus dalam medium CM-REF dengan atau tanpa LIF pada hari ke-10 setelah kultur menunjukkan peningkatan jumlah yang nyata dibandingkan dengan dalam medium tanpa penambahan CM-REF (Gambar 12). Peningkatan persentase tersebut menunjukkan bahwa CM-REF yang ditambahkan ke dalam mDMEM mampu menginduksi peningkatan poliferasi BM-MSC sehingga jumlah sel tersebut di dalam kultur semakin meningkat. Conditioned medium rat embryonic fibroblast mengandung berbagai macam faktor pertumbuhan yang dapat menginduksi proliferasi dari BM-MSC seperti yang telah diuraikan sebelumnya. Bone marrow mesenchymal stem cell berdasarkan morfologinya berbentuk mesenchymal-cell fusiform dan fibroblast-cell like. Berdasarkan reaksi terhadap alkalin fosfatase, BM-MSC bereaksi positif terhadap alkalin fosfatse sehingga dapat disimpulkan bahwa BM-MSC tersebut memiliki sifat pluripotensi.
Jumlah BM-MSC dalam mDMEM yang ditambah dengan CM-REF dan LIF pada hari ke-10 tidak menunjukkan perbedaan jumlah yang nyata dengan kultur dalam mDMEM yang ditambah CM-REF tanpa LIF. Namun demikian, pada hari ke-7 terjadi peningkatan jumlah BM-MSC yang signifikan dalam medium mDMEM yang ditambah CM-REF dan LIF daripada tanpa LIF. Peningkatan jumlah BM-MSC berdasarkan morfologi tersebut juga didukung dengan peningkatan jumlah sel pluripoten berdasarkan reaksi terhadap akalin fosfatase pada hari ke-7. Hal tersebut bahwa penambahan LIF dalam CM-REF ke dalam medium mDMEM dapat meningkatkan jumlah BM-MSC.