(Stilbena Sintase)
Purifikasi ini menggunakan high pure plasmid isolation kit dari Invitrogen. Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur yang terdapat dalam metode. Purifikasi bertujuan memurnikan produk PCR yang diperoleh dari pengotor yang mungkin ada pada produk PCR. Hasil purifikasi kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarosa.
Hasil elektroforesis menunjukkan adanya satu fragmen hasil purifikasi. Fragmen tersebut berukuran sekitar 1500 bp dan fragmen ini diperkirakan merupakan gen stilbena sintase yang diinginkan (Gambar 4). Pengujian dengan elektroforesis gel agarosa dilakukan untuk mengetahui kualitas dan kuantitas gen stilbena sintase yang akan diligasi dengan vektor pGEM-TEasy.Hasil purifikasi ini selanjutnya dimasukkan ke dalam vektor pengklonan pGEM-TEasy
M
Gambar 4 Hasil purifikasi gen stilbena sintase,M= marker, fragmen berukuran 1500 bp = Gen stilbena sintase.
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam Vektor pGEM-TEasy
Tahapan kloning terdiri atas ligasi, transformasi dan seleksi. Ligasi dilakukan dengan menggabungkan fregmen gen stilbena sintase, plasmid pGEM-T Easy sebagai vektor, buffer dan T4 DNA ligase. Produk ligasi kemudian ditransformasikan ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue kompeten. Produk ligasi pada tahap ini adalah stilbena sintase yang sudah disisipkan pada vektor pGEM-TEasy.
Transformasi ke Escherichia coli dilakukan untuk memperbanyak DNA
plasmid rekombinan. Transformasi dilakukan menggunakan metodeheat shock yaitu dengan pemberian kejut panas pada suhu 42 oC selama 50 detik. Prinsip dari proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari 0oC ke 42 oC terhadap sel yang telah diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2ini dilakukan dalam pembuatan sel kompeten. Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel kemudian dikultur dalam media tumbuh LB dengan penambahan glukosa selama 1.5 jam untuk memperbanyak jumlah sel dan memberi kesempatan kepada sel untuk mengekspresikan marka seleksi dari plasmid yang dibawanya. Setelah itu sel disebar pada media seleksi LA, IPTG, dan X-Gal kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 oC. Penambahan IPTG dalam media seleksi berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen sedangkan X-Gal berfungsi sebagai substrat.
Hasil transformasi ke Escherichia colimenunjukkan terbentuknya koloni putih dan biru (Gambar 5). Koloni putih merupakan koloni yang diperkirakan mengandung fragmen gen sisipan (gen stilbena sintase) sedangkan koloni biru diperkirakan merupakan koloni yang tidak mengandung fragmen gen sisipan. Terbentuknya koloni putih biru ini disebabkan adanya marka seleksi pada vektor pGEM-T Easy. Marka seleksi biasanya berupa gen yang membawa sifat resistensi terhadap antibiotik tertentu. Vektor pGEM-T Easy memiliki marka seleksi berupa gen resistensi ampisilin dan marka seleksi tambahan berupa gen Lac Z. Gen pembawa sifat resistensi terhadap ampisilin ini menyandi enzim -Laktamase. Enzim -Laktamase akan mendegradasi ampisilin sehingga ketika sel pembawa plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampisilin, maka sel tersebut akan tumbuh sementara sel yang tidak membawa plasmid rekombinan akan mati. Gen Lac Z menyandi enzim -Galaktosidase. Enzim ini akan menghidrolisis X-Gal yang ditambahkan pada media seleksi menjadi galaktosida dan senyawa turunannya yaitu 5-bromo-4-kloro indoksil yang berwarna biru. Ketika terdapat fragmen gen sisipan pada plasmid maka sintesis -peptida yang berperan sebagai aktivator terhadap kerja enzim -Galaktosidase akan terhambat sehingga warna biru tidak terbentuk.
1500 bp
1000 bp 5000 bp
1 2
Gambar 5 Koloni biru putih hasiltransformasi pGEM-TEasy ke Escherichia coli. Nomor 1 adalah koloni putih dan nomor 2 adalah koloni biru.
.
Seleksi transforman melalui pengamatan warna koloni yang terbentuk tidak selalu sesuai dengan teori. Artinya bahwa tidak semua koloni berwarna putih pasti membawa fragmen gen sisipan dan sebaliknya belum tentu semua koloni berwarna biru merupakan koloni yang tidak membawa fragmen gen sisipan. Hal tersebut dapat disebabkan oleh karakteristik dari fragmen gen hasil PCR yang diklon ke dalam pGEM-T Easy. Sebagai contoh, koloni biru dapat dihasilkan dari produk PCR yang diklon pada frame yang sama dengan gen LacZ. Produk PCR tersebut biasanya memiliki tiga basa sama yang berulang pada beberapa bagian fragmen, termasuk memiliki basa adenin yang berulang pada bagian ujungnya (Promega 1999). Produk PCR yang demikian tidak memiliki kodon stop pada bagian fragmennya sehingga akan ditranslasi bersamaan dengan gen LacZ dan menghasilkan koloni berwarna biru
Koloni sel yang terbentuk pada media seleksi selanjutnya diambil 6 koloni untuk diamplifikasi dengan teknik PCR koloni dan dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan voltase 100 volt. Tujuan utama dari PCR koloni adalah untuk mengkonfirmasi koloni transforman yang membawa fragmen gen sisipan dan menghindari kesalahan dari pengamatan warna koloni.
PCR koloni diawali dengan pemilihan koloni terpisah yang tumbuh pada media seleksi. Koloni-koloni tersebut diberi nomor
terlebih dahulu kemudian dengan tusuk gigi steril, koloni tersebut diduplikat pada media seleksi yang telah dibagi menjadi beberapa wilayah dan digunakan sebagai cetakan pada proses PCR.
Elektroforegram (Gambar 6) menunjukkan terdapat dua klon transforman yang berhasil diinsersi yaitu koloni nomor 5 dan nomor 6. Keberhasilan dalam proses PCR koloni dapat diamati dari ukuran klon transforman. Gambar 6 Menunjukkan bahwa fragmen mengalami penambahan ukuran sekitar 200 bp sehingga ukurannya menjadi 1700 bp. Penambahan ukuran ini mungkin terjadi karena terdapat sekuen promotor dari vektor yang menempel pada gen target.
Koloni positif selanjutnya dikultur pada media LB yang ditambah ampisilin. Selanjutnya, dilakukan isolasi plasmid dari setiap kultur menggunakan high pure plasmid isolation kit dariRoche.
1 2 3 4 5 6 M
Gambar 6 Hasil PCR koloni gen STS. Nomor 1-6 nomor koloni yang digunakan sebagai cetakan, M= Marker.
Urutan Nukleotida Gen Stilbena Sintase Fragmen DNA plasmid hasil klon tersebut kemudian dimurnikan dan dikirim ke lembaga Eijkman Jakarta untuk ditentukan urutan nukleotidanya. Data hasil sekuensing yang berupa urutan basa selanjutnya diproses menggunakan program bioedit. Melalui program bioedit, urutan basa yang diperoleh disejajarkan baik forward maupun revers dan selanjutnya
1700 bp
5000 bp
dianalisis dengan program BLASTX pada
web. www.ncbi.nlm.nih.gov untuk
membandingkan sekuen nukleotida yang ditranslasikan pada seluruh open reding frame (ORF) dengan sekuen protein dalam database ( Claverie dan Notredam 2003).
Hasil analisis dengan program BLASTX dinyatakan dengan besarnya nilai scorebits dan E value. Nilai E value dan scorebits menunjukkan tingkat homologi gen yang dianalisis dengan protein yang bersesuaian padadatabase. Homologi yang tinggi ditunjukkan dengan nilai score bits yang semakin besar (>150) danE value yang kecil (<10-4). Nilai score bits ditunjukkan oleh warna hasil analisis BLASTX yaitu warna hitam, biru, hijau, merah muda dan merah. Warna hitam menunjukkan nilai score bits kurang dari 40, warna biru menunjukkan nilai score bits antara 40 sampai dengan 50, warna hijau menunjukkan nilai score bits 50 sampai dengan 80, warna merah muda menunjukkan nilaiscore bits 80 sampai dengan 200, dan warna merah menunjukkan nilai score bits lebih besar sama dengan 200. Semakin besar nilaiscore bits maka semakin tinggi tingkat homologi gen yang diperoleh dengan protein lain yang bersesuaian pada database. Hasil analisis fragmen gen stilbena sintase dengan program BLASTX menunjukkan terbentuknya warna merah (Lampiran 6) dengan nilai score bits lebih besar dari 150 dan E value lebih kecil dari 10-4(Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa fragmen gen stilbena sintase yang dianalisis memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan protein lain yang bersesuaian pada database. Hasil ini memberikan keyakinan bahwa fragmen yang terbentuk dari hasil PCR adalah gen stilbena sintase.
Tabel 1 Hasil analisis BLASTX fragmen gen stilbena sintase
Protein yang bersesuaian Score (Bits) E Value hypothetical protein 286 3e-76 [Vitis vinifera]
Stilbene synthase 286 3e-76 [Vitis riparia]
resveratrol synthase 286 3e-76 [Vitis vinifera]
Stilbene synthase 286 3e-76 [Vitis vinifera]
*hanya ditampilkan sebagian,secara lebih lengkap dapat dilihat pada lampiran 6.
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
Sebelum gen stilbena sintase (STS) diligasi dengan vektor ekspresi pCAMBIA 1303, gen stilbena sintase yang terdapat didalam pGEM-T Easy dipotong terlebih dahulu dengan enzim restriksi Spe1 dan Nco1. Pemotongan ini dilakukan pada suhu 37oC selama 4 jam. Tujuan pemotongan ini adalah memisahkan fragmen gen stilbena sintase (STS) dengan vektor pengklonan pGEM-T Easy sehingga STS bisa diligasi dengan vektor ekspresi pCAMBIA 1303. Hasil pemotongan pGEM-T Easydan STS ditunjukkan pada gambar 7.
Gambar 7 menunjukkan bahwa hasil pemotongani pGEM-T Easy dan stilbena sintase dengan enzim restriksiSpe1 dan Nco1 menghasilkan 2 fragmen dengan ukuran sekitar 3000 bp dan 1500 bp. Fragmen berukuran 3000 bp diperkirakan merupakan fragmen pGEM-T Easy sementara fragmen berukuran 1500 bp merupakan fragmen gen stilbena sintase (STS). Hasil ini menunjukkan bahwa fragmen gen stilbena sintase telah berhasil dipisahkan dengan vektor pengklonan pGEM-TEasy. Fragmen berukuran 1500 bp selanjutnya dipotong dari gel menggunakan pisau skalpel dan dipurifikasi. Selanjutnya, fragmen gen stilbena sintase diligasi dengan vektor ekspressi pCAMBIA 1303.
M
Gambar 7 Hasil pemotongan pGEM-TEasy dan gen stilbena sintase (STS) dengan enzim restriksiSpe 1 dan Nco1, M= Marker, fragmen berukuran 3000 bp = Plasmid pGEM-TEasy, fragmen berukuran 1500 bp= Gen stilbena sintase.
3000 bp
1500 bp 1000 bp
Genstilbena sintase disisipkan pada vektor ekspresi pCAMBIA 1303 pada tempat pemotongan enzim restriksiNcoIdan Spe1 sehingga untuk mencapai tujuan tersebut vektor pCAMBIA 1303 dipotong terlebih dahulu dengan enzim restriksi NcoI dan Spe1. Hasil pemotongan vektor pCAMBIA 1303 menunjukkan terbentuknya fragmen berukuran sekitar 12000 bp (Gambar 8). Fragmen tersebut kemudian diisolasi dari gel dan dipurifikasi, sehingga didapatkan plasmid pCAMBIA 1303 yang siap diligasi dengan gen STS. Pemotongan dengan enzim restriksi ini dilakukan pada suhu 37 °C selama 1 jam. Seluruh volume reaksi kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1%.
Setelah itu, dilakukan Ligasi antara pCAMBIA 1303 dan stilbena sintase. Ligasi dilakukan dengan mencampur plasmid pCAMBIA 1303, DNA sisipan (stilbena sintase), buffer dan T4 DNA ligase. Ligasi dilakukan menggunakan T4 ligase dan buffer ligase dari Promega. Penggunaan enzim T4 DNA ligase pada proses ini untuk mengatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’ fosfat dan 3’ hidroksil dari nukleotida yang berdekatan. Penambahan enzim T4 DNA ligase ini mampu membentuk kompleks enzim AMP yang selanjutnya terikat pada nick (daerah putus).
M
Gambar 8 Hasil pemotongan pCAMBIA 1303, M=Marker, fragmen berukuran 12000= Plasmid pCAMBIA 1303.
Hasil ligasi stilbena sintase dan pCAMBIA 1303 selanjutnya ditransformasikan ke bakteri Escherichia coli XL1-Blue untuk memperbanyak DNA plasmid rekombinan. Transformasi dilakukan menggunakan metodeHeat shock yaitu dengan pemberian kejut panas pada suhu 42 oC selama 50 detik. Prinsip dari metode ini adalah adanya lonjakan suhu dari 0oC ke 42oC terhadap sel yang telah diberi perlakuan CaCl2. Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas dari membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel.
Hasil transformasi selanjutnya diseleksi dalam media Luria bertani agar yang mengandung kanamisin 25 mg/L. Hasil seleksi menunjukkan Terbentuknya beberapa koloni putih (Gambar 9). Koloni tersebut diperkirakan merupakan koloni Escherichia coliyang mengandung plasmid rekombinan. Escherichia coli yang tidak mengandung plasmid rekombinan tidak akan tumbuh dalam media seleksi karena tidak membawa gen yang mampu mendegradasi kanamisin.
Koloni tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media LB yang mengandung kanamisin dengan konsentrasi 25 mg/L. Plasmid rekombinan dalamE. coli yang telah dikultur selanjutnya diisolasi. Isolasi DNA plasmid ini menggunakan kit dari Qiagen.
K
Gambar 9 Hasil transformasi pCAMBIA 1303-stilbena sintase ke Escherichia coli XL-1 Blue, K= Koloni yang mengandung plasid rekombinan.
12000 bp
Hasil isolasi plasmid dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Hasil elektroforesis menunjukkan terbentuknya plasmid berukuran sekitar 13500 (Gambar 10). Plasmid ini diperkirakan merupakan plasmid pCAMBIA 1303 yang telah mengandung fragmen gen stilbena sintase.
Plasmid yang telah diisolasi selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi spe1 dan Nco1. Pemotongan ini dilakukan untuk memastikan bahwa sel yang tumbuh pada media seleksi adalah sel E. coli XL1-Blue yang membawa plasmid yang telah tersisipi gen stilbena sintase. Hasil pemotongan plasmid rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase dengan enzim restriksi Spe1 dan Nco1 menunjukkan terbentuknya dua fragmen masing-masing berukuran sekitar 12000 bp dan 1500 bp (Gambar 11). Fragmen berukuran 12000 bp diperkirakan merupakan plasmid pCAMBIA 1303 sedangkan fragmen berukuran 1500 bp diperkirakan merupakan fragmen gen stilbena sintase . Adanya dua pita dengan ukuran 12000 bp dan 1500 bp ini menunjukkan bahwa gen stilbena sintase telah berhasil dikonstruksi dengan vektor ekspresi pCAMBIA 1303.
M
Gambar 10 Gen stilbena sintase yang sudah terklon dalam pCAMBIA 1303, M=Marker, fragmen ukuran 13500= Gen stilbena sintase yang terklon dalam pCAMBIA 1303.
M
Gambar 11 Hasil pemotongan pCAMBIA 1303- stilbena sintase dengan enzim restriksi Spe1 dan Nco1, M=Marker, fragmen berukuran 12000 bp= Plasmid pCAMBIA 1303, fragmen berukuran 1500 bp = Gen stilbena sintase.
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase ke dalamAgrobacterium
tumefaciens.
Transformasi pCAMBIA 1303-stilbena sintase ke dalam Agrobacterium tumefaciens menggunakan metode heat shock. Prinsip metode ini adalah terjadi lonjakan suhu dari 0 oC ke suhu -20 oC terhadap sel yang telah diberi perlakuan CaCl2. Garam CaCl2 akan mempengaruhi struktur dan muatan dari membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel .
Setelah sel kompeten AGL-0 dicampur dengan plasmid pCAMBIA 1303-STS, campuran selanjutnya disebar ke media seleksi LA yang dicampur kanamisin dan rifamfisin kemudian diinkubasi dalam keadaan gelap. Inkubasi dalam keadaan gelap dilakukan karena Agrobacterium tumefaciens sensitif terhadap cahaya. Selain itu, inkubasi dalam keadaan gelap dilakukan untuk mengkondisikan Agrobacterium seperti pada habitat aslinya yaitu tanah yang gelap.
Hasil seleksi DNA rekombinan pada media sleksi menunjukkan terbentuknya koloni berwarna putih (Gambar 12). Koloni yang terbentuk merupakan koloni yang mengandung plasmid rekombinan yaitu koloni yang mengandung DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase. Jumlah koloni yang tumbuh di media seleksi saat transformasi ke 13500 bp
12000 bp
12000 bp
Agrobacterium tumefaciens lebih sedikit dibandingkan dengan jumlah koloni saat transformasi ke Escherichia coli. Hal ini terjadi karena Agrobacterium tumefaciens memiliki jumlah salinanyang lebih sedikit dibandingkan dengan Escherichia coli. Agrobacterium tumefaciens yang digunakan pada penelitian ini adalah Agrobacterium galur AGL-0. Agrobacterium galur AGL-0 digunakan karena memiliki virulensi yang lebih tinggi dibandingkan galur Agrobacterium lainnya.
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah yang secara genetik dapat mentransfer gen ke tanaman. Bakteri ini secara alami mampu menginfeksi tanaman dan menyebabkan timbulnya tumor akibat dari transfer fragmen DNA (T-DNA) dari plasmid Ti (tumor-inducing) bakteri ke sel tanaman. Sifat unik ini memungkinkan plasmid Ti menjadi alat pemindah gen-gen antar spesies yang berbeda, yaitu dengan menyisipkan gen asing pada T-DNA ( Shepherd 1997).