untuk produksi oospora
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan terhadap pertumbuhan koloni dengan perhitungan jumlah berat kering koloni, diperoleh hasil rataanya sebagai berikut (Tabel 4)
Tabel 4. Rataan berat kering koloni kapang L. giganteum pada 3 macam media dalam ukuran gram
Media Biakan Rata-rata ± SEM
Media A 0,00582 ± 0,00139a
Media B 0,01474 ± 0,00241a
Media C 0,01898 ± 0,0173a
Ket : Media A : Media PYG (Domnas, 1982)
Media B : Media telur air (EWM) (Misman dkk, 1990) Media C : Media Kuning telur Plus
Berdasarkan hasil penghitungan rataan dari lima kali ulangan dengan menggunakan 3 macam media biakan tertera pada Tabel 4. Pada media PYG rataan berat kering koloni 0,00582 gram, pada media kuning telur 0,01474 gram dan pada media kuning telur plus 0,01890 gram. Dari hasil penghitungan rataan diperoleh bahwa pada media kuning telur plus cenderung menunjukkan hasil angka yang lebih besar dibanding kedua media yang lain. Setelah dilakukan penghitungan statistik dari ketiga media biakan tersebut menunjukkan hasil yang perbedaannya tidak signifikan (P<0,05). Karena dari ketiga media biakan tersebut tidak berbeda nyata antara satu dengan lainnya, maka dari ketiga media biakan tersebut dapat digunakan untuk menumbuhkan koloni kapang entomopatogen L. giganteum.
Sterol merupakan zat utama yang dibutuhkan pada siklus pertumbuhan kapang entomopatogen L. giganteum (Elliot et al. 1964). Untuk pertumbuhannya L .giganteum tidak dapat mensintesa sterol sendiri, untuk itu dibutuhkan sumber dari luar. Dalam pertumbuhannya sel vegetatif sterol tidak dibutuhkan akan tetapi sterol dapat mengubah siklus pertumbuhan yakni bentuk vegetatif menjadi pertumbuhan reproduktif meliputi siklus aseksual dan seksual yaitu proses zoosporogenesis dan oosporogenesis (Elliot et al. 1964; Domnas et al. 1976; Kerwin dan Washino 1983; Kerwin et al. 1996). Menurut Kerwin dan Washino (1983) sterol yang paling baik untuk pertumbuhan zoospora adalah sitosterol, kompestergosterol dan kolesterol.
Dalam penelitian ini ketiga media tidak berpengaruh didalam pembentukan sel vegetatif baik media biakan yang mengandung PYG, kuning telur ataupun kuning telur plus. Hal ini kemungkinan disebabkan sterol tidak terlalu dibutuhkan dalam pertumbuhan sel vegetatif. Seperti kapang – kapang lain, kapang ent omopatogen juga menggunakan trehalosa, gliserol, glukosa ataupun protein dan lemak sebagai sumber karbonnya. Dalam penelitian ini unsur- unsur tersebut terkandung di dalam ketiga macam media tersebut dan pertumbuhan vegetatifnya berlangsung. Unsur sterol baru akan dibutuhkan dalam merangsang proses zoosporogenesis dan oosporogenesis.
Menurut Misman dkk (1990) media kuning telur (EWM) merupakan media yang kandungan nutrisinya lebih banyak dan dapat mencukupi untuk menumbuhkan koloni kapang L. giganteum dibandingkan apabila dibiakkan pada media yang berisi ekstrak biji bunga matahari atau ekstrak kacang kedelai.
Domnas et al. (1982) menggunakan ekstrak biji ganja untuk memacu proses zoosporogenesis.
Media EWM merupakan media cair yang hanya mengandung kuning telur. Dalam media ini kuning telur yang digunakan berasal dari kuning telur ayam ras yang menurut Stadelman dan Cotteril (1977) mengandung 230,0 mg kolesterol. Kandungan sterol dalam kuning telur ini cukup untuk terjadinya proses zoosporogenesis. Menurut WHO (1985) kapang L. giganteum dalam proses zoosporogenesis membutuhkan komponen sterol dari luar (exogenous sterol). Media EWM pertama kali ditemukan oleh Misman (1989) untuk menumbuhkan kapang L. giganteum Couch. Menurut Misman dkk (1990), media EWM merupakan media terbaik dalam menumbuhkan kapang L. giganteum Couch dibanding media yang mengandung biji kedelai dan media yang mengandung minyak biji matahari.
Dalam penelitian ini selain digunakan media EWM ( Misman, 1989) dan media PYG ( Kerwin, 1989) digunakan juga media kuning telur plus yaitu kuning telur yang ditambah minyak jagung 1%. Seperti kapang – kapang lain, L. giganteum untuk hidupnya membutuhkan sumber energi seperti unsur protein, karbohidrat ataupun unsur lemak. Khusus untuk kapang Lagenidium dibutuhkan unsur sterol untuk pembentukkan siklus reproduksinya dengan merubah pertumbuhan vegetatif menjadi pertumbuhan reproduktif baik bentuk aseksual ataupun seksual. Untuk mendapatkan hasil yang optimal dibutuhkan sterol exogenous. Ketiga media biakan yang digunakan, semua sumber nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan kapang dijumpai didalamnya.Antara lain sumber sterol ataupun nutrisi yang lain (unsur karbon, nitrogen , vitamin -vitamin ataupun
mineral). Pada media kuning telur plus pertumbuhan vegetatif tidak berbeda nyata dengan media EWM ataupun media PYG dalam proses pembentukkan sel vegetatif . Walaupun dari hasil penelitian ini diperoleh gambaran penggunaan ketiga media biakan cair tidak berpengaruh nyata dalam menghasilkan sel vegetatif L. giganteum, akan tetapi perlu dipertimbangkan kemudahan mendapatkan bahan penyusun media serta nilai ekonomisnya.
Menurut Kerwin et al. (1986) bahwa asam lemak yang digabung dengan media yang biasa digunakan untuk pertumbuhan dan morfogenesis L. giganteum akan memacu hasil dan viabilitas terjadinya oosporogenesis, salah satunya dengan menambahkan vegetables oil. Dalam penelitian ini vegetables oil yang digunakan adalah minyak jagung 1%. Menurut Misman dkk (1990) kuning telur merupakan salah satu media yang lengkap kandungan nutrisinya untuk pertumbuhan L. giganteum. Kandungan nutrisi pada kuning telur selain lemak, karbohidrat, dan protein, kuning telur juga banyak mengandung komponen organik yang dibutuhkan untuk pertumbuhan kapang .
Hasil yang diperoleh pada percobaan kedua yang membandingkan tiga media biakan cair dalam menghasilkan oospora diperoleh hasil rataan dari empat percobaan terlihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Rataan jumlah oospora dari 3 macam media biakan cair No Media Biakan Jumla h rata -rata oospora
1 Media A 4,20 x 103 ± 182,5a
2 Media B 2,03x 103 ± 250a
3 Media C 16,6 x 104 ± 229,67b
Ket : Media A : Media PYG,cotton seed powder, cotton seed oil ( Brey, 1985) Media B : Media telur air ( EWM) (Misman dkk, 1990)
Dalam penelitian ini digunakan 3 macam media biakan cair yaitu media biakan yang mengandung media PYG plus cotton seed powder dan cotton seed oil (media A), Media kuning telur (EWM) (Media B) dan media kuning telur plus (media C). Hasil penghitungan rataan jumlah oospora dari 5 ml zoospora pada media A setelah 10 hari dihasilkan 4,20 x 103 oospora per ml, sedangkan dari media B dihasilkan 2,03 x 103 dan pada media C dihasilkan 16,6 x 104 oospora per ml. Hasil analisis statistik diperoleh bahwa media berpengaruh nyata dalam memproduksi oospora. Dari hasil penelitian ini, ketiga macam media yang digunakan dalam memproduksi oospora, dibuktikan bahwa media kuning telur plus (media C) memberikan hasil yang terbaik di dalam menghasilkan oospora dibandingkan dengan media biakan A dan media B (Gambar 13). Antara Media biakan A dan media biakan B menurut hasil penghitungan statistik menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata diantara kedua media biakan dalam memproduksi oospora.
Gambar 13. Oospora pada media kuning telur plus (10x)
Dalam menginduksi proses oosporogenesis selain dibutuhkan unsur -unsur yang mempunyai kemampuan dalam menghasilkan sumber karbon dan nitrogen dibutuhkan juga unsur sterol, asam lemak tak jenuh dan garam – garam mineral non toksik seperti unsur kalsium dan magnesium . Unsur sterol selain digunakan
untuk memicu terjadinya proses zoosporogenesis, unsur sterol digunakan juga dalam maturasi dari oospora. Sterol yang digunakan dapat berasal dari kolesterol, 7 dihidrokolesterol, sitosterol, desmosterol, fukosterol, stigmasterol, kolesterol asetat dan kolesterol palmitat. Menurut Brey (1985) bahwa kolesterol merupakan sumber sterol yang paling efektif untuk oospora disamping kolesterol lainnya. Dalam memacu oosporogenesis selain unsur sterol, media pertumbuhan harus mengandung asam lemak tak jenuh dan zoospora harus berkontak langsung dengan medium tersebut. . Media biakan yang digunakan dapat berupa media padat atau media cair. Menurut Nakane et al. (2001) media kuning telur merupakan media yang sangat kaya akan nutrisi baik sterol (kolesterol dan allyl sterol) ataupun kandungan lemak yang lebih baik dalam indikator proses oosporogenesis. Lemak yang terkandungan dalam kuning telur terdiri dari unsur trigliserid ataupun fosfolipid berupa unsur lesitin dan kolesterol. Dalam penelitian ini media kuning telur (EWM) dimodifikasi dengan me nambahkan minyak jagung 1% untuk memacu oosporogenesis. Brey (1985) menggunakan media PYG yang ditambah dengan cotton seed powder dan cotton seed oil untuk menginduksi oosporogenesis kapang Lagendium giganteum dan oospora yang dihasilkan 5,0 x 103 oospora/ml setelah 10 hari.
Minyak jagung yang ditambahkan dalam media biakan kuning telur mempunyai kandungan sterol yang lebih mencukupi dibanding media yang ditambah dengan coton seed, sehingga dalam memicu terjadinya proses oosporogenesis lebih mudah dan cepat. Minyak jagung mengandung bermacam – macam komponen nutrisi yang sangat dibutuhkan dalam perkembangan siklus reproduksi seksual. Di dalam minyak jagung terkandung campuran sterol
termasuk stigmasterol, beta sitosterol, gamma sitosterol (kompesterol) asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh C16 dan C1 8. Kandungan sterol dari minyak jagung (200 - 400 mg/100gr) lebih tinggi dibandingkan dengan cotton seed (100 mg/100g). Kandungan ester sterol dari minyak jagung berkisar 50-70% sedangkan cotton seed mengandung 30 – 50% dan biji bunga matahari mengandung 50 % ( Phillip et al. 2002). Menurut Hyong et al. (2002) bahwa dalam memproduksi oospora Phythopthora membutuhkan medium basal yang mengandung minyak jagung ataupun lesitin dari biji kedelai. Unsur Phytol dari kedua bahan tersebut digunakan sebagai pemicu terjadinya oosporogenesis.
Menurut Brey (1985) media PYG yang ditambah dengan cotton seed, cotton oil, ekstrak gandum serta unsur Mg dan Ca mampu menginduksi terjadinya oosporogenesis. Selain itu sterol dan triacylgliserol yang ditambahkan pada media biakan juga akan berpengaruh terhadap viabilitas oospora. Kerwin dan Washino(1983) mendapatkan oospora dalam jumlah maksimum dengan membiakkan zoospora pada media agar PYG yang ditambah dengan kolesterol, lesitin dan triolein. Sterol , asam lemak tak jenuh, calsium yang berikatan dengan protein calmodium sangat berperan dalam proses regulasi siklus metabolisme nukleotida selama terjadinya oosporogenesis dalam media cair ataupun padat (Kerwin dan Washino 1984).
Dalam proses induksi dan maturasi stadium seksual dari kapang L. giganteum dipengaruhi juga oleh proses regulasi komplek dari kalsium. Pengaruhnya meliputi gangguan: metabolisme, induksi anteridia, fusi gametangia, meiosis, pembentukan dinding oospora dan maturasi oospora. Untuk
itu unsur kalsium ekstrasel dibutuhkan selama proses oosporogenesis yang secara sinergis bekerja sama dengan unsur magnesium dalam memproduksi oospora.
Pada kondisi yang menguntungkan oospora secara invitro akan terus terbentuk jika sterol tergabung dengan media dasar pertumbuhan. Oospora yang dihasilkan mempengaruhi rantai sisi sterol, khususnya pada C24. Oospora tetap dihasilkan dan bertahan hidup bila dalam media pertumbuhan diperkaya adanya unsur asam lemak berupa trigliserida ( asam lemak netral) dan fosfolipid.
Media kuning telur plus merupakan modifikasi media kuning telur yang ditambah dengan minyak jagung. Dalam penelitian ini minyak jagung yang digunakan adalah 1%. Selain kandungan nutrisi yang ada pada kuning telur diharapkan sumber sterol diperoleh juga dari vegetables oil lain seperti minyak jagung, sehingga proses oosporogenesis terinduksi dengan baik.
Pada kondisi lingkungan yang tepat, oospora akan berkecambah dan menghasilkan zoospora biflagella yang infektif yang nantinya akan menginfeksi nyamuk. Sedang dalam kondisi kurang air/ kekeringan tahap seksual ini tetap dapat berlangsung dan dapat bertahan lama dalam bentuk oospora.
KESIMPULAN
1. Berdasarkan hasil penghitungan secara statistik menunjukkan bahwa dari ketiga media biakan yang digunakan yaitu media PYG, media kuning telur (EWM) dan media kuning telur plus tidak berbeda nyata dalam menghasilkan koloni kapang Lagenidium giganteum
2. Media Kuning telur plus dapat digunakan sebagai media alternatif dalam memproduksi oospora
3. Nilai LD50 oospora terhadap larva instar 2 nyamuk Ae. Aegypti sebesar 6,7 x 102 oospora/ml sedangkan untuk membunuh 95% (LD95) sebesar 1,94 x 103 oospora/ml.