HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Hasil Ekstraksi Serbuk Daun Afrika
dalam daun Afrika seperti besi, zink, mangan, dsb. Hasil penetapan kadar dapat
dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil Karakterisasi Simplisia
No Parameter Hasil
1. Penetapan kadar air 7,99%
2. Penetapan kadar sari larut air 25,88%
3. Penetapan kadar sari larut etanol 14,89%
4. Penetapan kadar abu total 9,74%
5. Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam 0,70%
4.3 Hasil Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan terhadap simplisia untuk mengetahui
senyawa kimia yang terkandung dalam daun Afrika. Hasil skrining fitokimia
dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Tabel 4.2 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia Daun Afrika
No Skrining Hasil 1. Alkaloid - 2. Flavanoid + 3. Glikosida + 4. Saponin + 5. Tanin + 6. Triterpenoid/ Steroid +
Keterangan: + = memberikan hasil; - = tidak memberikan hasil
4.4 Hasil Ekstraksi Serbuk Daun Afrika
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi menggunakan
pelarut etanol 96%. Hasil maserasi dari 400 g serbuk simplisia diperoleh ekstrak
kental 37,81 g (rendemen 9,45%).
4.5 Hasil Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Afrika (EEDA) Terhadap Sel HeLa dan Vero Menggunakan Metode MTT
42
Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan
pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil
metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini
digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase.
MTT akan direduksi menjadi kristal formazan oleh sistem reduktase suksinat
tetrazolium, yang terdapat di mitokondria pada sel hidup (Cree, 2011).
Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop inverted dengan
perbesaran 10x10 menunjukkan adanya perbedaan morfologi antara sel HeLa
dan Vero kontrol dan sel HeLa dan Vero yang diberi perlakuan ekstrak. Sel
HeLa dan Vero kontrol yang hidup tampak lonjong, saling berdempet dengan sel
lain yang berada disekitarnya dan menempel di dasar sumuran dapat dilihat pada
Gambar 4.1 (a, b).
Gambar 4.1 Kontrol Sel HeLa (a) Kontrol Sel Vero (b)
Hasil pengamatan sel HeLa dan Vero yang mati karena perlakuan
pemberian ekstrak tampak berubah dari bentuk semula dan bagian tengah
berwarna hitam, cenderung tersebar dan mengapung dapat dilihat pada Gambar
43
Gambar 4.2 Sel HeLa setelah Sel Vero setelah
pemberian ekstrak (a) pemberian ekstrak (b)
Warna gelap dan berserabut yang nampak pada pengamatan Gambar 4.3
merupakan kristal formazan setelah pemberian MTT. Kristal-kristal formazan
tersebut dapat menembus membran sel dan terakumulasi di dalam sel sehat.
Jumlah produk formazan secara langsung proposional dengan jumlah sel hidup.
Semakin banyak sel hidup maka semakin banyak sel yang aktif melakukan
metabolisme sehingga jumlah produk formazan yang terbentuk juga semakin
banyak. Semakin banyak produk formazan yang terakumulasi ini menyebabkan
intensitas warna ungu meningkat dalam plate. Sel yang mati tidak dapat
terwarnai oleh garam MTT sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada
sel hidup. Akibatnya pada sel mati tidak terbentuk formazan yang berwarna
44
Gambar 4.3 Kristal Formazan
Perbedaan warna pada media kultur sel HeLa dan sel Vero setelah pemberi
an ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendah dapat dilihat pada
Gambar 4.4 (a, b)
Sel HeLa (a) Sel Vero (b)
Gambar 4.4 Perbedaan warna media berisi sel HeLa, Vero dan larutan uji setelah pemberian MTT (3 x pengulangan).
Keterangan : A (1, 2, 3) = konsentrasi larutan uji 500 µg/ml B (1, 2, 3) = konsentrasi larutan uji 250 µg/ml C (1, 2, 3) = konsentrasi larutan uji 125 µg/ml D (1, 2, 3) = konsentrasi larutan uji 62,5 µg/ml E (1, 2, 3) = konsentrasi larutan uji 31,25 µg/ml F (1, 2, 3) = konsentrasi larutan uji 15,625 µg/ml A B C D E F 1 2 3 A B C D E F 1 2 3
45
Hasil pengukuran dengan menggunakan ELISA reader menunjukkan
bahwa persentase sel Hela dan Vero yang hidup terus menurun berbanding
terbalik dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Dimana artinya
semakin besar konsentrasi ekstrak yang diberikan maka persentase kematian sel
HeLa dan Vero semakin meningkat. Persentase sel HeLa hidup terbesar terdapat
pada pemberian konsentrasi 62,5 µg/ml yaitu sebesar 77% dan sel Vero hidup
terbesar terdapat pada pemberian konsentrasi 31,25 µg/ml yaitu sebesar 73% ,
sedangkan sel HeLa pada pada pemberian konsentrasi 500 µ g/ml persentase sel
hidup hanya sebesar 11% dan sel Vero pada pemberian konsentrasi 500 µg/ml
persentase sel hidup hanya sebesar 8% (Tabel 4.3).
Tabel 4.3 Persentase sel HeLa dan Vero hidup dengan perlakuan EEDA
Bahan Uji Konsentrasi EEDA (µg/ml) % sel HeLa hidup % sel Vero hidup Ekstrak Etanol Daun Afrika (EEDA) 500 11 8 250 11 8 125 32 58 62,5 77 71 31,25 58 73 15,625 71 70 Kontrol SelHela - - - Kontrol Media - - -
46
Data lengkap absorbansi sel HeLa kontrol media, dan sel setelah pemberian
ekstrak dapat dilihat pada lampiran 12 halaman 69. Grafik hubungan konsentrasi
larutan uji terhadap jumlah persentase sel HeLa hidup dapat lihat pada Gambar
4.5.
Gambar 4.5 Grafik Hubungan Konsentrasi Larutan Uji Terhadap Persentasi Sel HeLa Hidup
Berdasarkan hasil uji sitotoksik dengan metode MTT assay, ekstrak etanol
daun Afrika terhadap sel HeLa memiliki persen sel hidup yang cenderung
mengalami penurunan seiring dengan bertambahnya konsentrasi sedangkan
pada konsentrasi 62,5 µg/ml persen sel hidup mengalami kenaikan. Dengan
rentang konsentrasi 15,625 µg/ml sampai 500 µg/ml. Sehingga dapat dilihat
hasil uji statistik ANOVA pada Tabel 4.4 persentasi sel hidup ekstrak etanol
daun Afrika terhadap sel HeLa.
71 58 77 32 11 11 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 15,625 31,25 62,5 125 250 500 15,625 31,25 62,5 125 250 500
Hubungan konsentrasi larutan uji terhadap jumlah persentase sel HeLa hidup
Konsentrasi (µg/ml)
%
se
l hi
47
Tabel 4.4 Persentase Sel Hidup Ekstrak Etanol Daun Afrika terhadap Sel HeLa Konsentrasi (µg/ml) Sel HeLa (%) MEAN±SEM 500 0,15±0,009 250 0,15±0,032 125 0,28±0,021 62,5 0,54±0,033 31,25 0,43±0,064 15,625 0,51±0,001
Keterangan: terdapat perbedaan statistik yang signifikan pada p< 0,05
Berdasarkan hasil uji ANOVA (Lampiran 17.) pada sel HeLa
menunjukkan pada konsentrasi 500 µg/ml terhadap konsentrasi 250 µg/ml dan
125 µg/ml tidak terdapat perbedaan yang signifikan, sedangkan konsentrasi 62,5
µg/ml, 31,25 µg/ml dan 15,625 µ g/ml terdapat perbedaan yang signifikan.
Konsentrasi 250 µg/ml terhadap konsentrasi 500 µg/ml dan 125 µg/ml tidak
terdapat perbedaan yang signifikan, sedangkan pada konsentrasi 62,5 µg/ml,
31,25 µg/ml dan 15,625 µg/ml terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi
125 µg/ml terhadapkonsentrasi 500 µg/ml dan 250 µg/ml tidak terdapat
perbedaan yang signifikan, sedangkan pada konsentrasi 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml
dan 15,625 µ g/ml terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 62,5 µ g/ml
terhadap konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml dan 125 µg/ml terdapat perbedaan
yang signifikan, sedangkan terhadap konsentrasi 31,25 µg/ml dan 15,626 µg/ml
tidak terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 31,25 µ g/ml terhadap
konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml dan 125 µg/ml terdapat perbedaan yang
signifikan, sedangkan terhadap konsentrasi 62,5 µg/ml dan 15,625 µg/ml tidak
48
konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml dan 125 µg/ml terdapat perbedaan yang
signifikan, sedangkan pada konsentrasi 62,5 µg/ml dan 31,25 µg/ml tidak
terdapat perbedaan yang signifikan.
Data lengkap absorbansi sel Vero kontrol media, dan sel setelah pemberian
ekstrak dapat dilihat pada lampiran 13 halaman 70. Grafik hubungan konsentrasi
larutan uji terhadap jumlah persentase sel Vero hidup dapat lihat pada Gambar
4.6.
Gambar 4.6 Grafik Hubungan Konsentrasi Larutan Uji Terhadap Persentasi Sel Vero Hidup
Dengan metode uji yang sama, ekstrak etanol daun Afrika terhadap sel
Vero (Gambar 3.6) memiliki nilai persen hidup yang hampir sama dengan
ekstrak etanol daun Afrika terhadap sel HeLa. Pada ekstrak etanol daun Afrika
terhadap sel Vero memiliki persen hidup yang cenderung mengalami penurunan
seiring dengan bertambahnya konsentrasi, dengan rentang 15,625 µg/ml sampai
70 73 71 58 8 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 15,625 31,23 62,5 125 250 500 15,625 31,23 62,5 125 250 500 Konsentrasi µg/ml % se l hi dup
Hubungan konsentrasi larutan uji terhadap jumlah persentase sel Vero hidup
49
500 µg/ml. Tetapi pada konsentrasi 31,25 µg/ml persen hidup mengalami
kenaikan. Sehingga dapat dilihat hasil uji statistik ANOVA pada Tabel 4.5
persentasi sel hidup ekstrak etanol daun Afrika terhadap sel Vero.
Tabel 4.5 Persentase Sel Hidup Ekstrak Etanol Daun Afrika terhadap Sel Vero Konsentrasi (µg/ml) Sel Vero (%) MEAN±SEM 500 0,12325±0,26653 250 0,12175±0,25539 125 0,54550±0,110969 62,5 0,65275±0,148447 31,25 0,66850±0,150838 15,625 0,64250±0,155439
Keterangan: terdapat perbedaan statistik yang signifikan pada p< 0,05
Hasil uji ANOVA (Lampiran 18.) pada sel Vero menunjukkan pada
konsentrasi 500 µg/ml terhadap konsentrasi 250 µg/ml dan 125 µg/ml tidak
terdapat perbedaan yang signifikan, sedangkan konsentrasi 62,5 µg/ml, 31,25
µg/ml dan 15,625 µ g/ml terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 250
µg/ml terhadap konsentrasi 500 µg/ml dan 125 µg/ml tidak terdapat perbedaan
yang signifikan, sedangkan pada konsentrasi 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml dan
15,625 µg/ml terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 125 µg/ml
terhadap konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml dan 15,625
µg/ml tidak terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 62,5 µg/ml
terhadap konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml dan 125 µg/ml terdapat perbedaan
yang signifikan, sedangkan terhadap konsentrasi 31,25 µg/ml dan 15,626 µg/ml
tidak terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 31,25 µ g/ml terhadap
50
signifikan, sedangkan terhadap konsentrasi 62,5 µg/ml dan 15,625 µg/ml tidak
terdapat perbedaan yang signifikan. Konsentrasi 15,625 µg/ml terhadap
konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml dan 125 µg/ml terdapat perbedaan yang
signifikan, sedangkan pada konsentrasi 62,5 µg/ml dan 31,25 µg/ml tidak
terdapat perbedaan yang signifikan.
Perhitungan nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan analisis probit
pada program SPSS Windows 22. Nilai IC50 digunakan sebagai parameter untuk
mengevaluasi potensi sitotoksisitas EEDA terhadap sel HeLa dan Vero. Suatu
ekstrak dikatakan berpotensi menghambat pertumbuhan sel kanker jika memiliki
nilai IC50 ≤ 100 µg/ml (Kamuhabwa, et al., 2000). Semakin kecil nilai IC50
berarti semakin tinggi nilai aktivitas sitotoksiknya (Winarno, dkk., 2010).
Karena harga IC50 dari EEDA adalah 61,357 µg/ml, maka dapat dikatakan
bahwa EEDA mempunyai aktivitas sitotoksik yang poten terhadap sel kanker
serviks HeLa. Nilai IC50 yang sangat kecil bukan memberikan arti bahwa ekstrak
tersebut semakin berpotensi. Hal tersebut dikarenakan kekhawatiran dari sifat
toksisitas yang berlebih akan menyebabkan kematian pada jaringan yang lain,
sehingga ekstrak tersebut bukan hanya menghambat pertumbuhan sel kanker
tetapi juga sel normal (Andriyani, et al., 2010).
Banyak penelitian dilakukan untuk mencari senyawa antikanker baru
dengan harapan sifat yang lebih baik. Selektivitas suatu obat dapat digunakan
sebagai tolak ukur baik dan buruknya suatu obat serta keamanannya. Oleh
karena permasalahan tersebut di atas, maka perlu dilakukan penentuan indeks
selektivitas. Selektivitas obat antikanker dapat diukur dengan cara menghitung
51
kanker (Dewi, dkk., 2015). Nilai IC50 EEDA terhadap sel Vero adalah 79,561
µg/mL sedangkan nilai IC50 EEDA terhadap sel HeLa adalah 61,357 µg/mL
sehingga diperoleh nilai IS 1,29 untul sel HeLa. Ekstrak dikatakan memiliki
selektivitas tinggi apabila nilai IS lebih besar dari 3 sehingga dalam hal ini dapat
dikatakan bahwa EEDA tidak selektif terhadap sel kanker HeLa (Prayong, et al.,
2008).
Hasil penelitian (Ijeh, 2010) menunjukkan bahwa tanaman daun Afrika
banyak mengandung saponin, seskuiterpen lakton, flavonoid. Hasil penelitian
(Setiawan, 2012) menunjukkan bahwa daun Afrika mengandung flavonoid,
glikosida, saponin, tannin, dan triterpenoid/steroid.
Kandungan steroid/triterpenoid daun afrika diduga berperan dalam
menyebabkan ketoksikan pada sel kanker serviks (HeLa) dan sel Vero.
Triterpenoid memiliki aktivitas untuk mengatasi inflamasi, proliferasi,
apoptosis, invasi, metastasis, dan angiogenesis. Senyawa ini menunjukkan
potensi yang baik dalam menangani kanker dengan berbagai mekanisme seperti
mengatur regulasi dari faktor transkripsi (contoh: nuclear factor-kappaB
[NF-κB), protein anti-apoptotik (contoh: Bcl-2, Bcl-xL), pencetus dari proliferasi sel metalloproteinases [MMPs], intraseluler adhesi molekul-1 (ICAM-1), dan
protein angiogenik VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (Yadav, et al.,
52
BAB V