BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan alat yang bekerja berdasarkan prinsip kromatografi yang berguna untuk memisahkan
komponen –komponen zat yang terdapat di dalam suatu campuran. Salah satu
tujuan dari penelitian ini adalah untuk memahami cara kerja HPLC dalam
memisahkan molekul – molekul.Terjadinya suatu pemisahan ditandai dengan
didapatkannya nilai waktu retensi yang berbeda. Proses pemisahan molekul –
molekul menggunakan HPLC dipengaruhi oleh banyak faktor. Sehingga dalam
penelitian ini dilakukan percobaan mencari pengaruh laju alir dantekananterhadap
waktu retensi.
Proses pemisahan menggunakan HPLC terjadi di dalam kolom. Oleh
karena itu kolom disebut sebagai jantung HPLC. HPLC sebagai sebuah sistem
terdiri dari beberapa komponen seperti yang terlihat pada gambar (2.1), yaitu:
pompa, injektor, kolom, detektor, dan penampil data. Cara kerja sistem HPLC
adalah sebagai berikutfase gerak oleh pompaakan didorong masuk, melewati
injektor, lalu ke kolom, ke detektor, dan akhirnya keluar di pembuangan. Sampel
disuntikkan ke dalam injektor dengan menggunakan syringe. Sampel dan fase
kemudian bergerak bersama menuju kolom. Pada kolom terjadi pemisahan antar
molekul, setelah terpisah molekul – molekul tersebut akan masuk ke dalam
detektor satu per satu. Detektor akan mendeteksi molekul – molekul tersebut satu
per satu. Setelah terdeteksi molekul tersebut dengan sendirinya akan keluar
menuju pembuangan. Prinsip kerja dari detektor yang digunakan adalah serapan
cahaya oleh molekul penyerap yaitu sampel. Sehingga proses pendeteksian
dilakukan pada satu nilai panjang gelombang analisis. Panjang gelombang analisis
merupakan panjang gelombang dimana kedua zat mengalami serapan yang baik.
Data yang dikeluarkan oleh detektor berupa nilai tegangan. Besarnya nilai
tegangan, menunjukkan besarnya nilai absorbansi.Mekanisme proses pemisahan
ini ditunjukkan pada gambar (2.2).
Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran waktu retensi dari
Parasetamol dan Kafein dalamkondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan
tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alirtertentu. Ada beberapa set pada
alat yang dibuat bervariasi, namun ada juga yang dibuat tetap. Set pada alat yang
dibuat tetap adalah:
a. Pompa LKB-Broma 2150
Lower limit pressure : 000 bar b. Detektor Spectroflow 757
Panjang gelombang analisis : 263 nm
Filter rise time : 1 s
Skema rangkaian HPLC yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada
Langkah kerja yang telah dilakukan pada penelitian:
1. Penyiapan fase gerak
Fase gerak yang digunakan adalah methanol pro analis, yaitu methanol
yang sudah dibersihkan dari pengotor – pengotor. Walaupun demikian, untuk
memastikan methanol yang digunakan benar – benar bersih maka sebelum
dialirkan masuk ke dalam pompa, terlebih dahulu methanol tetap harus disaring
dengan menggunakan milipore yang berukuran 0.45 µm.Milipore merupakan
penyaring yang terbuat dari sejenis kertas khusus yang memiliki pori –pori
berukuran tertentu. Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya penyumbatan
pada saluran – saluran pompa dan kolom, karena jika terjadi penyumbatan akan
mengganggu proses pemisahan yang terjadi.
Setelah dilakukan penyaringan, makaselanjutnya dilakukan degassing
selama 15 menit menggunakan refrigerator ultrasonic UR275.
Degassingmerupakan proses penghilangan gelembung – gelembung udara. Adanya gelembung udara akan menyebabkan timbulnya ruang – ruang kosong
pada larutan. Sehingga gelembung udara harus dihilangkan karena dapat
mengganggu proses pemisahan dan pendeteksian.
2. Penyiapan sampel
Bahan standarParasetamol dan Kafein berbentuk serbuk.Kedua
standartersebutmasing – masing dilarutkan ke dalam methanol, sehingga
menjadi larutan standar Parasetamol dan Kafein sesuai dengan konsentrasi yang
diinginkan, pengenceran dihitung dengan menggunakan persamaan (3.1).
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan campuran antara
larutan Parasetamol danKafein. Sampel yang akan disuntikkan ke dalam HPLC
harus dipastikan bebas dari kotoran. Oleh karena itu sebelum diinjeksikan,
dilakukan penyaringan terlebih dahulu dengan menggunakan milipore yang
berukuran 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk menghindari penyumbatan pada
saluran – saluran dalam pompa dan kolom.
3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul
Waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan molekul mulai pada
saat injeksi sampai terdeteksi oleh detektor. Sehingga dapat dikatakan
bahwawaktu retensi merupakan waktu lamanya sampel berada di dalam kolom.
Waktu retensi merupakan hal yang penting dalam kromatografi, karena
waktu retensi menunjukkan identitas suatu molekul. Jika dua buah molekul
memiliki waktu retensi yang berbeda berarti molekul – molekul tersebut telah
mengalami pemisahan.Molekul yang akan dipisahkan dengan menggunakan
HPLCadalah molekul Parasetamoldan Kafein. Sehingga sebelum melakukan
proses pemisahan, waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein perlu diketahui
terlebih dahulu.
Dalam penentuan waktu retensi Parasetamol dan Kafein, larutan yang
Parasetamol diinjeksikan ke dalam sistem HPLC, bersamaan dengan itu recorder
dijalankan.Parasetamol kemudian bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di
kolom, Parasetamolakan berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom.
Parasetamol terus bergerak hingga akhirnya keluar dari kolom.Setelah itu,
Parasetamol terdeteksi oleh detektor.Saat Parasetamol belum terdeteksi oleh
detektor, recorder hanya memunculkan garis lurus.Ketika Parasetamol terdeteksi
oleh detektor, grafik pada recorder membentuk sebuah puncak.Puncak tersebut
menunjukkan molekul Parasetamol yang telah terdeteksi.Proses ini juga berlaku
untuk Kafein. Besar waktu retensi dihitung dengan menggunakan stopwatch.
Stopwatch dijalankan saat larutan diinjeksikan ke dalam injektor dan dihentikan
saat larutan terdeteksi oleh detektor yang ditandai dengan timbulnya puncak pada
grafik
Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan dua buah grafik yang
masing – masing menunjukkan waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein.Dua
Gambar 4.1. Grafik waktu retensiParasetamol
Dari gambar (4.1) dan (4.2)terlihat bahwaParasetamol memiliki waktu
retensi yang lebih singkat dibandingkan dengan Kafein. Waktu retensi
Parasetamol adalah 4,38 menit sedangkan Kafein adalah 7,71 menit. Berdasarkan
hal tersebut dapat diketahui bahwa dalam pemisahan antara molekul
Parasetamoldan Kafein, Parasetamolakan terdeteksi terlebih dahulu.
4. Pengukuran waktu retensi molekul Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju
alir bervariasi pada tekanan tertentu, dilakukan dengan laju alir fase gerak 0,55
ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45
ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min pada tekanan 100 bar.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar,
200 bar, 225 bar, dan 250 bar.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi
tekanan bervariasi pada laju alir tertentu, dilakukan dengan tekanan 100 bar, 125
bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar pada laju alir 0,55 ml/min.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1
ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9
ml/min.
Sampel yang digunakan merupakan campuran antara larutan
HPLC.Sampel bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di dalam kolom,
sampel berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom.Sampel terus
berjalan hingga akhirnya terdeteksi oleh detektor.Grafik yang dihasilkan pada
recorder menunjukkan dua buah puncak.Masing – masing puncak menunjukkan
nilai waktu retensi yang berbeda.Waktu retensi yang berbeda menunjukkan bahwa
sampel mengalami pemisahan menjadiParasetamol dan Kafein.Hasil yang
didapatkan dalam eksperimen ini adalah nilai waktu retensi dari Parasetamol dan
Kafein.Parasetamol dan Kafein dapat diidentifikasi dengan melihat nilai waktu
retensi yang didapatkan.
Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan beberapa grafik yang
menunjukkan proses pemisahan antara Parasetamol dan Kafein. Grafik – grafik
tersebut ditunjukkan oleh gambar (4.3) dan (4.4)
Gambar 4.3. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein padatekanan 100 bardan laju alir1 ml/min
Gambar 4.4. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada tekanan 100 bar dan laju alir 1,9 ml/min
Suatu peristiwa pemisahan akan menghasilkan grafik hubungan antara
keluaran detektor dan waktu retensi. Grafik tersebut berupa puncak – puncak.
Puncak – puncak ini menunjukkan molekul – molekul yang telah berhasil
dipisahkan. Satu puncak mewakili satu molekul.
Pada gambar (4.3)dan (4.4) terlihat bahwa masing – masing gambar
memiliki dua puncak.Puncak yang satu menunjukkanParasetamolsedangkan yang
satunya lagi menunjukkan Kafein.Dari Grafik terlihat bahwa
Parasetamolterdeteksi terlebih dahulu dan memiliki waktu retensi yang lebih
gambar (4.3)dan (4.4) berbeda satu sama lain karena memakai laju alir yang
berbeda.
Hasil nilai waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju
alir bervariasi pada tekanan sebesar 100 bar ditunjukkan pada tabel (4.1). Untuk
data nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi
pada tekanan sebesar 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar dan 250 bar
dapat dilihat pada lampiran A.
Tabel 4.1 : Tabel nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang bervariasipada tekanan sebesar 100 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
0,55 5,36 7,46 0,7 5,00 7,17 0,85 4,40 7,05 1 4,01 6,22 1,15 3,31 5,54 1,3 3,22 5,17 1,45 3,01 4,45 1,6 2,33 4,21 1,75 2,17 4,03 1,9 2,02 3,43
Tabel (4.1) menunjukkan data nilai waktu retensi dalam kondisi laju alir yang
bervariasi pada tekanan 100 bar.Semakin tinggi laju alirnya, waktu retensinya
semakin singkat.Perbedaan waktu retensi antara laju alir yang satu dengan laju alir
Hasil nilai waktu retensi dariParasetamol dan Kafein dalam kondisi
tekanan bervariasi pada laju alir sebesar 1,45ml/min ditunjukkan pada tabel (4.2).
Untuk data nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan
bervariasi pada laju alir sebesar 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min;1 ml/min;
1,15 ml/min;1,3 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min dan 1,9 ml/min terdapat pada
lampiran B.
Tabel 4.2 : Tabel nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1,45 ml/min.
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 3,01 4,45 125 2,50 4,37 150 2,44 4,35 175 2,41 4,22 200 2,43 4,25 225 2,39 4,22 250 2,40 4,20
Berdasarkan tabel (4.2) di atas terlihat bahwa tekanan mempengaruhi
waktu retensi. Semakin tinggitekanannya maka waktu retensinya semakin
singkat.Perbedaan waktu retensi antara tekanan yang satu dengan tekanan yang
lain pada laju alir yang sama untuk tiap molekul sangat kecil.
Dari tabel (4.1) dan (4.2) didapatkan gambar (4.5) dan (4.6).Berdasarkan
tabel data (4.1) maka didapatkan gambar grafik (4.5).Gambar (4.5) merupakan
grafik hubungan antara waktu retensi dan seper laju aliruntuk tekanan sebesar 100
Gambar 4.5. Grafik hubungan antara tRdan 1 / v pada tekanan sebesar 100 bar
Gambar (4.5) sesuai dengan persamaan (2.1).Pada gambar (4.5) Parasetamol
ditunjukkan oleh grafik yang berwarna biru. Waktu retensi Parasetamolberada
pada rentang antara 1,5 menit hingga 5,5 menituntuk rentang seper laju alir 0,5
bar-1(ml/min)-1 hingga 2 (ml/min)-1. Sedangkan Kafein ditunjukkan oleh grafik
berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara3 menit hingga
Berdasarkan tabel data (4.2) maka didapatkan gambar grafik (4.6).
Gambar (4.6) merupakan grafik hubungan waktu retensi dan tekanan untuk laju
alir sebesar 1,45 ml/min.
Gambar 4.6. Grafik hubungan antara tRdan P pada laju alir sebesar 1,45 ml/min.
Pada gambar (4.6) Parasetamol ditunjukkan oleh grafik berwarna biru.Waktu
retensi Parasetamol berada pada rentang antara 2 menit hingga 3 menit pada
rentang tekanan dari100 bar hingga 250 bar.Sedangkan Kafein ditunjukkan oleh
grafik berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara 4 menit