RETENSI PADA HPLC
Skripsi
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Jurusan Fisika
Oleh:
Maria Fransiska Putriyani NIM : 073214002
PROGRAM STUDI FISIKA JURUSAN FISIKA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
ii
TIMEIN HPLC
A THESIS
Presented as Partial Fulfillment of the Requirement to Obtain the Sarjana Science
in Physics Department
by:
Maria Fransiska Putriyani NIM : 073214002
PHYSICS STUDY PROGRAM PHYSICS DEPARTMENT
FACULTY OF SCIENCE DAN TECHNOLOGY SANATA DHARMA UNIVERSITY
v
P esi m i st i s t a k l ebi h d a r i si k a p t a k a bu r m en d a h u l u i
n a si b.P a d a h a l k i t a t a k k a n p er n a h m en d a h u l u i n a si b.
(A n d r ea H i r a t a – Sa n g P em i m p i )
Ev er y t h i n g i s si m p l er t h a n ca n be i m a gi n ed ,
y et m or e i n t r i ca t e t h a n ca n be com p r eh en d ed .
vi
Sa y a p er sem ba h k a n k a r y a i n i k ep a d a :
P a p a & M a m a k u t er ci n t a
d a n
ix ABSTRAK
PENGARUH LAJU ALIR DAN TEKANAN TERHADAP WAKTU RETENSI PADA HPLC
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan suatu teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan komponen tertentu dalam suatu
campuran. Proses Pemisahan pada HPLC merupakan hasil dari interaksi molekul
– molekul sampel dengan fase diam. Molekul – molekul yang terpisah dapat
diidentifikasi berdasarkan waktu retensinya.
Dalam penelitian ini, telah dilakukan pengukuran waktu retensi
Parasetamol dan Kafein dengan memvariasi laju alir dan tekanan. Nilai laju alir
dan tekanan yang bervariasi mempengaruhi nilai waktu retensi yang
dihasilkan.Semakin tinggi laju alir dan tekanannya, waktu retensinya semakin
singkat. Pada kondisi laju alir, tekanan dan kolom yang sama, waktu retensi yang
dihasilkan berbeda untuk tiap molekul. Waktu retensi yang berbeda menunjukkan
x
ABSTRACT
THE INFLUENCE OF FLOW RATE ANDPRESSURE FOR RETENTION TIME IN HPLC
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) is a chromatographic
technique that can separate a mixture of compounds. Chromatographic separation
in HPLC is the result of specific interactions between sample molecules with the
stationary phase. Molecules that have been separated can be identified by their
retention time.
In this research, the retention time measurement of Paracetamol and
Caffeine was conducted by varying the flow rate and pressure. The flow rate and
pressure that have variation, influenced the retention time. When the flow rate and
pressure get higher, the retention time will get shorter. At the same condition of
flow rate, pressure, and column, the retention time is different for each molecule.
The different retention time show that Paracetamol and Caffeine have been
xiii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ……… i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………iii
HALAMAN PENGESAHAN ………...iv
HALAMAN MOTTO ……… v
HALAMAN PERSEMBAHAN ………... vi
HALAMAN PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………. vii
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ……… viii
ABSTRAK ……… ix
ABSTRACT ……….. x
KATA PENGANTAR ……….. xi
DAFTAR ISI ………...xiii
DAFTAR TABEL ………....xvi
xiv
BAB I PENDAHULUAN ………...1
A. Latar Belakang ………....1
B. Rumusan Masalah ……….. 4
C. Batasan Masalah ……….4
D. Tujuan Penelitian ………4
E. Manfaat Penelitian ………. 4
F. Sistematika Penulisan ……….5
BAB II DASAR TEORI ……….6
A. Pengukuran ……….6
B. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) ………8
BAB III EKSPERIMEN ………...15
A. Tempat Penelitian ……….15
B. Alat dan Bahan ………. 15
1. Alat – alat ………15
2. Bahan ………..17
C. Metode Eksperimen ………..18
1. Penyiapan fase gerak ………...18
2. Penyiapan sampel ………18
xv
4. Pengukuran waktu retensimolekulParasetamol dan Kafein dalam
kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan
yang bervariasi pada laju alir tertentu………..20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………..21
A. Hasil ………. 21
1. Penyiapan fase gerak ……….. 23
2. Penyiapan sampel ………23
3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul……….24
4. Pengukuran waktu retensimolekulParasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu………...27
B. Pembahasan ……….. 34
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN……… 46
A. Kesimpulan ………...46
B. Saran ………. 46
DAFTAR PUSTAKA ………...47
xvi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 4.1 :Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang
bervariasi pada tekanan sebesar 100 bar………..30
Tabel 4.2 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang
bervariasi pada laju alir sebesar 1,45 ml/min………...31
Tabel 4.3 : Tabel hubungan nilai waktu retensi (menit) Parasetamol terhadap laju
alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar)………...41
Tabel 4.4 : Tabel hubungan nilai waktu retensi (menit) Kafein terhadap laju alir
xvii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Skema HPLC………...……….9
Gambar 2.2. Proses pemisahan pada kolom………...10
Gambar 2.3. Grafik pemisahan ………..11
Gambar 3.1. Skema rangkaian alat yang digunakan dalam eksperimen……….17
Gambar 4.1. Grafik waktu retensi Parasetamol………..26
Gambar 4.2. Grafik waktu retensi Kafein………...26
Gambar 4.3. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada laju alir
1 ml/min dan tekanan 100 bar………28
Gambar 4.4. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada laju alir
1,9 ml/min dan tekanan100 bar………..29
Gambar 4.5. Grafik hubungan antara tRdan 1 / v pada tekanan 100 bar………32
Gambar 4.6. Grafik hubungan antara tRdan P pada laju alir 1,45 ml/min…….33
Gambar 4.7. Grafik hubungan waktu retensi (menit) terhadap laju alir fase gerak
(ml/min) dan tekanan (bar) untuk pengukuran Parasetamol pada
panjang gelombang 263 nm dengan menggunakan kolom C-18
yang berukuran panjang 100mm diameter 4,6mm………43
Gambar 4.8. Grafik hubungan waktu retensi (menit) terhadap laju alir fase gerak
(ml/min) dan tekanan (bar) untuk pengukuran Parasetamol pada
panjang gelombang 263 nm dengan menggunakan kolom C-18
1 BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Dewasa ini teknologi semakin berkembang pesat. Seiring dengan
perkembangannya, teknik – teknik yang digunakan dalam suatu penelitian juga
mengalami perubahan pesat. Dalam suatu penelitian, seseorang harus memiliki
pemahaman yang mendalam tentang prinsip – prinsip dan variabel - variabel
fisika pada instrumen yang digunakan. Karena prinsip – prinsip dan variabel –
variabel tersebut akan mempengaruhi hasil eksperimen. Sehingga untuk dapat
melaksanakan suatu eksperimen dengan berhasil diperlukan pengetahuan tentang
berbagai prinsip pengukuran dan instrumentasi [Holman dan Jasjfi, 1984].
Dalam suatu pengukuran ada dua buah hal yang penting yaitu input dan
output. Input dibedakan menjadi tiga bagian yang meliputi input yang diinginkan,
input pengubah dan input pengganggu, sedangkan output dibedakan menjadi
output pengganggu dan output yang diinginkan [Doebelin, 2004]. Nilai input akan
berpengaruh terhadap hasil keluaran outputnya.
Suatu pengukuran dikatakan baik jika tidak merubah medium yang
diukur. Suatu medium yang berubah akan menyebabkan perubahan nilai besaran
yang diukur dari nilai sebenarnya [Doebelin, 2004]. Selain perubahan medium
yang diukur, munculnya gangguan pada instrumen pada saat pengukuran dapat
Dalam suatu pengukuran dibutuhkan suatu instrumen atau alat ukur.
Masing - masing instrumen memiliki karakteristik tersendiri. Oleh karena itu
dalam suatu pengukuran, instrumen akan diperlakukan sedemikan rupa sehingga
dapat menghasilkan pengukuran yang akurat.
Instrumen yang digunakan dalam suatu pengukuran harus memenuhi
persyaratan tertentu. Persyaratan tersebut adalah: sensitif, selektif, tidak
mengganggu sampel yang diukur dan memiliki waktu tanggap cepat. Sensitif
menunjukkan bahwa instrumen tersebut mampu mengukur input yang ada.
Selektif menunjukkan bahwa instrumen tersebut mampu membedakan antara
input yang satu dengan yang lain. Sedangkan tidak mengganggu sampel yang
diukur berarti bahwa pengukuran yang dilakukan tidak merubah sampel dan
waktu tanggap yang cepat berarti bahwa pengukuran langsung terjadi saat
instrumen bersentuhan dengan sampel.
Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran dua buah molekul tertentu.
Dua buah molekul tersebut terkandung di dalam sebuah sampel. Sehingga untuk
mengukur kedua buah molekul tersebut dibutuhkan suatu alat ukur yang mampu
mengidentifikasi molekul – molekul yang terdapat dalam sebuah sampel. Mampu
mengidentifikasi berarti mampu membedakan antara molekul yang satu dengan
yang lain. Dengan kata lain, alat yang digunakan haruslah memiliki selektivitas
tinggi. Ada beberapa alat yang memenuhi kriteria di atas, contohnya GC
unsur logam sedangkan HPLC digunakan untuk mengidentifikasi zat – zat secara
luas serta zat – zat yang tidak mudah menguap. Jangkauan pengidentifikasian
HPLC lebih luas dibandingkan dengan GC, karena GC hanya untuk zat – zat yang
mudah menguap. Sehingga dalam penelitian ini dipilih HPLC sebagai alat ukur
yang digunakan.
HPLC merupakan kepanjangan dari High Pressure Liquid Chromatography.HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan dengan cepat menggunakan bantuan tekanan dan hasilnya
dideteksi oleh detektor [Willard, et. al., 1988]. Kromatografi merupakan teknik
pemisahan, jadi HPLC berfungsi untuk memisahkan komponen – komponen
tertentu yang terdapat dalam suatu campuran. Hasil dari pemisahan yang terjadi
ditunjukkan berupa grafik puncak – puncak. Puncak – puncak tersebut
menunjukkan molekul – molekul yang telah berhasil terpisah.
Suatu proses pemisahan dikatakan baik jika waktu analisis yang
dibutuhkan singkat serta daya pisahnya tinggi [Gritter, et. al., 1991]. Agar
mendapatkan kondisi yang sensitif dan selektif dalam pemisahan maka faktor
-faktor yang mempengaruhi pemisahan diteliti satu per satu. Contoh beberapa
faktor yang mempengaruhi pemisahan yaitu laju alir fase gerak, tekanan, jenis
fase gerak, parameter kolom, dll.
Tulisan ini berisi tentang teori pengukuran, teori yang terkait dengan
prinsip kerja HPLC, metode eksperimen, hasil eksperimen, analisa data dan
kesimpulan. Juga disertakan lampiran untuk melengkapi semua uraian yang telah
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, pokok
permasalahan yang diangkat dalam skripsi ini dapat dirumuskan sebagai berikut :
1. Bagaimana cara kerja HPLC dalam memisahkan molekul – molekul
tertentu.
2. Bagaimana hubungan antara laju alir fase gerak dan tekanan terhadap
waktu retensi pada pemisahan molekul – molekul tertentu dalam suatu
campuran.
C. Batasan Masalah
1. Pemisahan molekul Parasetamol dan Kafeindengan fase gerak Methanol
menggunakan HPLC yang terdapat di Laboratorium Analisa Kimia Fisika
Pusat, Universitas Sanata Dharma.
D. Tujuan Penelitian
1. Dapat memahami cara kerja HPLC dalam memisahkan molekul – molekul.
2. Mendapatkan hubungan antara laju alir, tekanan dan waktu retensi dalam
proses pemisahan menggunakan HPLC untuk mendapatkan hasil
pemisahan yang baik.
E. Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi mengenai penggunaan sistem HPLC dalam
2. Memberikan informasi tentang hubungan laju alir,tekanan dan waktu
retensi dalam proses pemisahan menggunakan HPLC.
F. Sistematika Penulisan
Penelitian ini akan dituliskan dengan sistematika sebagai berikut :
BAB I Pendahuluan
Bab ini berisi uraian tentang latar belakang masalah,
rumusan masalah, batasan masalah, tujuan penelitian,
manfaat penelitian, dan sistematika penulisan.
BAB II Dasar Teori
Bab ini berisi uraian tentang teori kromatografi, serta teori
yang terkait dengan prinsip kerja HPLC secara keseluruhan
yang berguna dalam penelitian yang dilakukan.
BAB III Eksperimen
Bab ini berisi uraian tentang tempat pelaksanaan penelitian,
alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian, dan
prosedur penelitian.
BAB IV Hasil dan Pembahasan
Bab ini berisi uraian tentang hasil dan pembahasan dari
penelitian yang telah dilakukan.
Bab V Penutup
6 BAB II DASAR TEORI
A. Pengukuran
Pengukuran merupakan suatu kegiatan yang sering dilakukan sehari –
hari.Pengukuran dilakukan untuk memberikan informasi dari suatu hal yang
diukur dengan menggunakan sejumlah angka [Rangan, et. al., 1985].Angka
tersebut menunjukkan nilai dari sesuatu yang diukur. Proses suatu pengukuran
dapat dibedakan menjadi tiga bagian, yaitu memonitoring, mengkontrol, dan
menganalisis [Doebelin, 2004]. Memonitoring meliputi mencatat atau merekam
data, mengkontrol meliputi mengatur beberapa variabel yang berhubungan dengan
pengukuran yang dilakukan, menganalisis meliputi menganalisa data yang telah
didapatkan.
Dalam suatu pengukuran terdapat dua hal yang penting, yaitu input dan
output. Input dibedakan menjadi tiga bagian, yaitu input yang diinginkan, input
pengubah, dan input pengganggu [Doebelin, 2004]. Input yang diinginkan
merupakan masukan yang ingin diukur. Input pengubah merupakan masukan yang
bisa menyebabkan perubahan dalam hubungan antara input dan output.
Sedangkan input pengganggu merupakan masukan yang dapat mengganggu
pengukuran.
Pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat ukur atau
karena itu dalam pengukuran setiap instrumen memiliki perlakuan yang berbeda –
beda. Salah satu hal yang dapat menyebabkan pengukuran menjadi tidak akurat
adalah kurangnya sensitivitas suatu instrumen. Sehingga untuk menghindari
terjadinya pengukuran yang tidak akurat, ada beberapa persyaratan tentang
instrumen yang akan digunakan. Instrumen yang akan digunakan sebaiknya
memiliki persyaratan: sensitif, selektif, tidak mengganggu sampel yang diukur,
dan waktu tanggap cepat.
Suatu pengukuran dikatakan ideal bila tidak mengubah kondisi sampel
yang diukur. Pengubahan kondisi sampel akan menyebabkan perubahan nilai
besaran yang diukur dari nilai sebenarnya. Munculnya gangguan pada instrumen
dan masukan yang mengganggu saat pengukuran, dapat membuat hasil
pengukuran tidak akurat dan mengakibatkan timbulnya kesalahan. Untuk
menghindari hal tersebut, gangguan harus dieliminasi [Doebelin,2004].
Kesalahan yang terjadi dalam pengukuran bisa dibedakan menjadi dua,
yaitu kesalahan sistematik dan kesalahan acak [Morris, 1996]. Kesalahan
sistematik merupakan kesalahan yang terjadi secara tetap pada bagian yang sama,
misalnya selalu menghasilkan nilai kesalahan yang sama. Kesalahan ini terjadi
biasanya disebabkan oleh perubahan karakteristik instrumen. Sedangkan
kesalahan acak merupakan kesalahan yang terjadi secara acak tidak menentu.
Kesalahan ini biasanya terjadi karena adanya gangguan yang berasal dari luar.
Salah satu usaha agar mendapatkan pengukuran yang akurat adalah
merupakan suatu cara untuk mendapatkan hubungan antara input dan output
dengan cara memvariasikan input yang akan diukur sedangkan input yang lain
dibuat tetap. Instrumen juga berperan penting dalam usaha mendapatkan
pengukuran yang akurat. Syarat suatu instrumen yang baik yaitu: sensitif,
selektif, tidak mengganggu sampel yang diukur dan memiliki waktu tanggap
cepat. Selektif berarti instrumen tersebut mampu mengidentifikasikan antara
komponen yang satu dengan yang lain. Salah satu alat yang memiliki kriteria
tersebut adalah HPLC.
B. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase
geraknya dialirkan dengan cepat menggunakan bantuan tekanan dan hasilnya
dideteksi oleh detektor [Willard, et. al., 1988]. Secara umum HPLC digunakan
untuk mencari besar konsentrasisuatu zat di dalam sampel. Disebut sebagai High Pressure Liquid Chromatography karena pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk memaksimalkan pemisahan antar molekul.
Mekanisme pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam [Kuwana, 1980]. Molekul yang
terlarut dalam fase gerak akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak
lebih lambat dibandingkan molekul yang berikatan lemah. Oleh karena itu,
berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan dengan didasarkan pergerakan
HPLC bekerja sebagai sebuah sistem yang terdiri dari beberapa
komponen.Komponen – komponen dari HPLC ditunjukkan pada gambar (2.1),
yang terdiri dari wadah fase gerak, pompa, tempat memasukkan sampel (injector port), kolom, detektor, perekam dan penampil data.
Gambar 2.1. Skema HPLC
Pada awalnya fase gerak dipompa masuk oleh pompa, melewatiinjector port, lalu dibawa menuju ke kolom kemudian diteruskan menuju detektor. Sampel
disuntikkan melalui injektor, kemudian terlarutkan oleh fase gerak, yang
kemudian dibawa ke dalam kolom dimana pemisahan berlangsung [Khopkar,
1990]. Pemisahan dapat terjadi karena molekul sampel tertahan oleh fase diam
atau dibawa oleh fase gerak. Hal ini tergantung pada sifat - sifat senyawa tersebut
terhadap kedua fase ini. Setelah terpisah molekul – molekul tersebut bergerak
menuju detektor untuk dideteksi satu per satu, lalu kemudian keluar menuju
Contoh proses terjadinya pemisahan ditunjukkan pada gambar (2.2),
misalnya ada molekul A dan B yang terdapat dalam suatu sampel, sampel tersebut
dimasukkan ke dalam sistem. Kedua senyawa tersebut akan terdistribusi di antara
fase gerak dan diamnya menurut sifat masing – masing. Komponen yang tertahan
kuat akan berjalan lambat, sebaliknya yang tertahan lemah akan berjalan cepat.
Karena perbedaan mobilitas inilah komponen – komponen sampel akan terpisah –
pisah yang kemudian dapat dideteksi dan dianalisa dengan detektor.
Gambar 2.2. Proses pemisahan pada kolom
Sampel yang terdiri dari molekul A dan B diinjeksikan pada saat t0, sampel mulai
memasuki kolom lalu pada saat t1 sampel mulai terpisah. Pada saat t2 jarak antara
molekul A dan molekul B mulai terlihat, molekul B bergerak lebih cepat
dibandingkan dengan molekul A. Pada saat t3 molekul B telah sampai di detektor
sedangkan molekul A masih berada di dalam kolom. Pasa saat t4 molekul A baru
dengan dua puncak yang ditunjukkan oleh gambar (2.3). Masing – masing puncak
mewakili molekul tertentu.
Gambar 2.3. Grafik pemisahan
Dilihat dari jenis fase gerak dan fase diamnya ada dua metode
pemisahan pada HPLC, yaitu pemisahan fase normal dan pemisahan fase terbalik.
Pada metode pemisahan fase normal, fase diamnya bersifat polar dan fase
geraknya bersifat non polar. Sedangkan pada metode pemisahan fase terbalik, fase
diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar.
Terjadinya pemisahan ditandai dengan didapatkannya waktu retensi
yang berbeda antara molekul yang satu dengan yang lain. Dalam proses
pemisahannya HPLC menggunakan laju alir dan tekanan tertentu. Untuk
penelitian analitis pada HPLC, laju alirfase gerak yang digunakan berkisar antara
0.5 – 5 ml/min [Johnson dan Stevenson, 1991].Semakin rendah laju alirnya maka
kemampuan untuk memisahkan komponen – komponen akan semakin tinggi serta
menghemat penggunaan fase gerak dan waktu yang dibutuhkan untuk analisis
akan semakin lama. Besar waktu retensi suatu molekul dipengaruhi oleh laju alir
fase gerak, tekanan, parameter kolom serta sifat – sifat molekul itu sendiri.
Kolom pada HPLC tersusun atas bagian - bagian penyusun kolom.
Ketika ada suatu molekul tertentu yang melewati kolom maka terjadi interaksi
antara molekul yang lewat dengan bagian – bagian penyusun kolom. Interaksi
yang terjadi dipengaruhi oleh jenis kolom dan molekul yang lewat. Jika jenis
kolomnya tetap maka besar waktu retensi bergantung pada molekul yang lewat.
Besar waktu retensi satu jenis molekul yang melewati kolom pada suatu
tekanan tertentu ditunjukkan oleh persamaan (2.1) di bawah ini [Willard, et. al.,
1988].
Dengan v = kecepatan linear fase gerak (ml/min)
dc = diameter kolom bagian dalam (µm)
ε = faktor porositas kolom
L = panjang kolom (mm)
tR =waktu yang diperlukan oleh molekul untuk melewati kolom
(min)
Waktu retensi (tR) berbanding lurus terhadap volum kolom (Vcol) serta
faktor porositas kolom (ε) dan berbanding terbalik terhadap kecepatan fase gerak
(v). Kecepatan fase gerak (v) pada persamaan (2.1) dapat disebut juga sebagai
jumlah volume fase gerak per satuan waktu.Besar volum kolom bergantung pada
ukuran kolom.Besar faktor porositas kolom bergantung pada jenis kolom
[Willard, et. al., 1988]. Laju alir berpengaruh terhadap waktu retensi, untuk laju
alir yang tinggi akan didapatkan waktu retensi yang singkat sedangkan untuk laju
alir yang rendah akan didapatkan waktu retensi yang lama.
Dalam proses kerja sistem HPLC digunakan tekanan. Tekanan pada
sistem HPLC dihasilkan oleh pompa.Penurunan tekanan yang terjadi pada kolom
pada suatu laju alir tertentu ditunjukkan oleh persamaan (2.2) [Kuwana, 1980].
Dengan ΔP = penurunan tekanan pada kolom (bar)
Ø = faktor resistan kolom
η = viskositas fase gerak (mbar s)
L = panjang kolom (mm)
v = laju alir fase gerak (mm/min)
dp = diameter bagian - bagianpenyusun kolom (µm)
Penurunan tekanan (ΔP) berbanding lurus terhadap faktor resistan kolom
berbanding terbalik terhadap kuadrat diameter bagian – bagian penyusun kolom
15 BAB III EKSPERIMEN
A. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat,
Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan Maguwoharjo Depok Sleman
Yogyakarta.
B. Alat dan Bahan 1. Alat – alat:
a. Satu unit HPLC, yang terdiri dari:
Pompa HPLC
Pompa yang digunakan adalah pompa LKB – BROMA tipe 2150.
Pompa ini memiliki 2 buah kepala pompa. Fase gerak selalu
bergerak melalui kedua kepala pompa dalam satu arah. Pompa ini
bertugas memberikan tekanan sehingga mendorong fase gerak
masuk ke dalam kolom. Tekanan tertinggi yang bisa diberikan oleh
pompa ini adalah 400 bar.
Injektor
Injektor merupakan tempat untuk memasukkan sampel. Sampel
dimasukkan dengan cara disuntikkan. Injektor memiliki tuas
dengan 2 buah kondisi yaitu LOAD dan INJECT. Sampel
akanbergerak masuk ke dalam kolom ketika tuas berada pada
posisi INJECT. Injektor ini mampu menampung sampel sebanyak
20μl.
Kolom
Kolom yang digunakan adalah kolom CPTM sphere C-18
(Oktadesil Silica) dengan panjang 100 mm dan diameter sebesar 4,6 mm.
Detektor
Detektor yang digunakan adalah detektor Spectroflow 757.
Detektor ini berfungsi untuk mendeteksi molekul – molekul yang
telah terpisah. Prinsip kerja detektor ini berdasarkan prinsip
serapan cahaya. Detektor ini mengubah besaran cahaya menjadi
besaran listrik,memiliki sumber lampu deuterium (190 nm – 380
nm) dan tungsten (380 nm – 800 nm).
Perekam dan penampil data
Untuk merekam dan menampilkan data digunakan recorder BD
Kipp zonen.
Gambar 3.1.Skema rangkaian alat yang digunakan dalam eksperimen.
b. Perangkat penyiapan larutan
Pipet skala dan tetes
Labu ukur
Beaker glass
Refrigerator ultrasonic UR 275
Milipore
Neraca digital
2. Bahan – bahan : a. Methanol
Methanol berfungsi sebagai fase gerak dan pelarut.
b. Sampel
Sampel yang digunakan adalah campuran larutanParasetamol dan
Kafein.
C. Metode Eksperimen 1. Penyiapan fase gerak
Fase gerak yang digunakan adalah methanol. Sebelum fase gerak
dimasukkan ke dalam wadah yang akan digunakan, maka terlebih dahulu
wadah tersebut dibilas dengan methanol. Untuk menghindari adanya partikel –
partikel asing maka methanol disaring dengan menggunakan milipore yang
berukuran 0,45 µm. Setelah itu, untuk menghilangkan gelembung –
gelembung udara maka dilakukan degassing pada methanol menggunakan refrigerator ultrasonic UR 275.
2. Penyiapan sampel
Sampelakan dimasukkan dengan cara disuntikkan ke dalam injektor
menggunakan syringe. Langkah pertama adalah pembuatan larutan induk dari
Parasetamol dan Kafein. Bahan standarParasetamol dan Kafein berbentuk
serbuk sehingga harus dilarutkan terlebih dahulu dalammethanol. Setelah
didapatkan larutan induk Parasetamol dan Kafein maka bisa dilakukan
pengenceran untuk mendapatkan kadar larutan yang diinginkan dengan
Dengan C1 = kadar larutan induk (ppm)
V1 = volume larutan induk yang diambil (ml)
C2 = kadar yang diinginkan (ppm)
V2 = volume larutan yang diinginkan (ml)
Untuk menghindari adanya partikel – partikel asing maka larutan Parasetamol
dan Kafein tersebut disaring dengan menggunakan milipore yang berukuran
0,45 µm.
3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul
Suatu campuran dikatakan terpisah jika molekul - molekul penyusun
campuran tersebut memiliki waktu retensi yang berbeda. Waktu retensi dari
Parasetamol dan Kafein harus diketahui terlebih dahulu. Sebab, waktu retensi
akan menunjukkan identitas suatu molekul pada saat pemisahan.
Sampel yang digunakan dalam eksperimen tahap ini adalah larutan
standar Parasetamol dan Kafein.Kedua larutan tersebut disuntikkan ke dalam
injektor satu per satu.Besar waktu retensi dapat diketahui dengan mengukur
selang waktu yang dibutuhkan oleh molekul mulai pada saat penyuntikan
hingga akhirnya terdeteksi oleh detektor.Hasil yang didapatkan pada
eksperimen ini adalah nilai waktu retensi masing – masing dari molekul
4. Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu.
Sampel yang digunakan adalah campuran larutan Parasetamol dan
Kafein. Hasil data yang akan didapatkan adalah nilai waktu retensi
Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan
tertentu dan tekanan bervariasi pada laju alir tertentu.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi
laju alir bervariasi pada tekanan tertentu, dilakukan dengan laju alir fase gerak
0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min;
1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min pada tekanan 100 bar.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar,
200 bar, 225 bar, dan 250 bar.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi
tekanan bervariasi pada laju alir tertentu, dilakukan dengan tekanan 100 bar,
125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar pada laju alir 0,55
ml/min. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85
ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75
ml/min; dan 1,9 ml/min.
21 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan alat yang bekerja berdasarkan prinsip kromatografi yang berguna untuk memisahkan
komponen –komponen zat yang terdapat di dalam suatu campuran. Salah satu
tujuan dari penelitian ini adalah untuk memahami cara kerja HPLC dalam
memisahkan molekul – molekul.Terjadinya suatu pemisahan ditandai dengan
didapatkannya nilai waktu retensi yang berbeda. Proses pemisahan molekul –
molekul menggunakan HPLC dipengaruhi oleh banyak faktor. Sehingga dalam
penelitian ini dilakukan percobaan mencari pengaruh laju alir dantekananterhadap
waktu retensi.
Proses pemisahan menggunakan HPLC terjadi di dalam kolom. Oleh
karena itu kolom disebut sebagai jantung HPLC. HPLC sebagai sebuah sistem
terdiri dari beberapa komponen seperti yang terlihat pada gambar (2.1), yaitu:
pompa, injektor, kolom, detektor, dan penampil data. Cara kerja sistem HPLC
adalah sebagai berikutfase gerak oleh pompaakan didorong masuk, melewati
injektor, lalu ke kolom, ke detektor, dan akhirnya keluar di pembuangan. Sampel
disuntikkan ke dalam injektor dengan menggunakan syringe. Sampel dan fase
kemudian bergerak bersama menuju kolom. Pada kolom terjadi pemisahan antar
molekul, setelah terpisah molekul – molekul tersebut akan masuk ke dalam
detektor satu per satu. Detektor akan mendeteksi molekul – molekul tersebut satu
per satu. Setelah terdeteksi molekul tersebut dengan sendirinya akan keluar
menuju pembuangan. Prinsip kerja dari detektor yang digunakan adalah serapan
cahaya oleh molekul penyerap yaitu sampel. Sehingga proses pendeteksian
dilakukan pada satu nilai panjang gelombang analisis. Panjang gelombang analisis
merupakan panjang gelombang dimana kedua zat mengalami serapan yang baik.
Data yang dikeluarkan oleh detektor berupa nilai tegangan. Besarnya nilai
tegangan, menunjukkan besarnya nilai absorbansi.Mekanisme proses pemisahan
ini ditunjukkan pada gambar (2.2).
Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran waktu retensi dari
Parasetamol dan Kafein dalamkondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan
tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alirtertentu. Ada beberapa set pada
alat yang dibuat bervariasi, namun ada juga yang dibuat tetap. Set pada alat yang
dibuat tetap adalah:
a. Pompa LKB-Broma 2150
Lower limit pressure : 000 bar
b. Detektor Spectroflow 757
Panjang gelombang analisis : 263 nm
Filter rise time : 1 s
Skema rangkaian HPLC yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada
Langkah kerja yang telah dilakukan pada penelitian:
1. Penyiapan fase gerak
Fase gerak yang digunakan adalah methanol pro analis, yaitu methanol
yang sudah dibersihkan dari pengotor – pengotor. Walaupun demikian, untuk
memastikan methanol yang digunakan benar – benar bersih maka sebelum
dialirkan masuk ke dalam pompa, terlebih dahulu methanol tetap harus disaring
dengan menggunakan milipore yang berukuran 0.45 µm.Milipore merupakan
penyaring yang terbuat dari sejenis kertas khusus yang memiliki pori –pori
berukuran tertentu. Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya penyumbatan
pada saluran – saluran pompa dan kolom, karena jika terjadi penyumbatan akan
mengganggu proses pemisahan yang terjadi.
Setelah dilakukan penyaringan, makaselanjutnya dilakukan degassing
selama 15 menit menggunakan refrigerator ultrasonic UR275.
Degassingmerupakan proses penghilangan gelembung – gelembung udara. Adanya gelembung udara akan menyebabkan timbulnya ruang – ruang kosong
pada larutan. Sehingga gelembung udara harus dihilangkan karena dapat
mengganggu proses pemisahan dan pendeteksian.
2. Penyiapan sampel
Bahan standarParasetamol dan Kafein berbentuk serbuk.Kedua
standartersebutmasing – masing dilarutkan ke dalam methanol, sehingga
menjadi larutan standar Parasetamol dan Kafein sesuai dengan konsentrasi yang
diinginkan, pengenceran dihitung dengan menggunakan persamaan (3.1).
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan campuran antara
larutan Parasetamol danKafein. Sampel yang akan disuntikkan ke dalam HPLC
harus dipastikan bebas dari kotoran. Oleh karena itu sebelum diinjeksikan,
dilakukan penyaringan terlebih dahulu dengan menggunakan milipore yang
berukuran 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk menghindari penyumbatan pada
saluran – saluran dalam pompa dan kolom.
3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul
Waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan molekul mulai pada
saat injeksi sampai terdeteksi oleh detektor. Sehingga dapat dikatakan
bahwawaktu retensi merupakan waktu lamanya sampel berada di dalam kolom.
Waktu retensi merupakan hal yang penting dalam kromatografi, karena
waktu retensi menunjukkan identitas suatu molekul. Jika dua buah molekul
memiliki waktu retensi yang berbeda berarti molekul – molekul tersebut telah
mengalami pemisahan.Molekul yang akan dipisahkan dengan menggunakan
HPLCadalah molekul Parasetamoldan Kafein. Sehingga sebelum melakukan
proses pemisahan, waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein perlu diketahui
terlebih dahulu.
Dalam penentuan waktu retensi Parasetamol dan Kafein, larutan yang
Parasetamol diinjeksikan ke dalam sistem HPLC, bersamaan dengan itu recorder
dijalankan.Parasetamol kemudian bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di
kolom, Parasetamolakan berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom.
Parasetamol terus bergerak hingga akhirnya keluar dari kolom.Setelah itu,
Parasetamol terdeteksi oleh detektor.Saat Parasetamol belum terdeteksi oleh
detektor, recorder hanya memunculkan garis lurus.Ketika Parasetamol terdeteksi
oleh detektor, grafik pada recorder membentuk sebuah puncak.Puncak tersebut
menunjukkan molekul Parasetamol yang telah terdeteksi.Proses ini juga berlaku
untuk Kafein. Besar waktu retensi dihitung dengan menggunakan stopwatch.
Stopwatch dijalankan saat larutan diinjeksikan ke dalam injektor dan dihentikan
saat larutan terdeteksi oleh detektor yang ditandai dengan timbulnya puncak pada
grafik
Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan dua buah grafik yang
masing – masing menunjukkan waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein.Dua
Gambar 4.1. Grafik waktu retensiParasetamol
Dari gambar (4.1) dan (4.2)terlihat bahwaParasetamol memiliki waktu
retensi yang lebih singkat dibandingkan dengan Kafein. Waktu retensi
Parasetamol adalah 4,38 menit sedangkan Kafein adalah 7,71 menit. Berdasarkan
hal tersebut dapat diketahui bahwa dalam pemisahan antara molekul
Parasetamoldan Kafein, Parasetamolakan terdeteksi terlebih dahulu.
4. Pengukuran waktu retensi molekul Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju
alir bervariasi pada tekanan tertentu, dilakukan dengan laju alir fase gerak 0,55
ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45
ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min pada tekanan 100 bar.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar,
200 bar, 225 bar, dan 250 bar.
Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi
tekanan bervariasi pada laju alir tertentu, dilakukan dengan tekanan 100 bar, 125
bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar pada laju alir 0,55 ml/min.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1
ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9
ml/min.
Sampel yang digunakan merupakan campuran antara larutan
HPLC.Sampel bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di dalam kolom,
sampel berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom.Sampel terus
berjalan hingga akhirnya terdeteksi oleh detektor.Grafik yang dihasilkan pada
recorder menunjukkan dua buah puncak.Masing – masing puncak menunjukkan
nilai waktu retensi yang berbeda.Waktu retensi yang berbeda menunjukkan bahwa
sampel mengalami pemisahan menjadiParasetamol dan Kafein.Hasil yang
didapatkan dalam eksperimen ini adalah nilai waktu retensi dari Parasetamol dan
Kafein.Parasetamol dan Kafein dapat diidentifikasi dengan melihat nilai waktu
retensi yang didapatkan.
Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan beberapa grafik yang
menunjukkan proses pemisahan antara Parasetamol dan Kafein. Grafik – grafik
tersebut ditunjukkan oleh gambar (4.3) dan (4.4)
Gambar 4.4. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada tekanan 100 bar dan laju alir 1,9 ml/min
Suatu peristiwa pemisahan akan menghasilkan grafik hubungan antara
keluaran detektor dan waktu retensi. Grafik tersebut berupa puncak – puncak.
Puncak – puncak ini menunjukkan molekul – molekul yang telah berhasil
dipisahkan. Satu puncak mewakili satu molekul.
Pada gambar (4.3)dan (4.4) terlihat bahwa masing – masing gambar
memiliki dua puncak.Puncak yang satu menunjukkanParasetamolsedangkan yang
satunya lagi menunjukkan Kafein.Dari Grafik terlihat bahwa
Parasetamolterdeteksi terlebih dahulu dan memiliki waktu retensi yang lebih
gambar (4.3)dan (4.4) berbeda satu sama lain karena memakai laju alir yang
berbeda.
Hasil nilai waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju
alir bervariasi pada tekanan sebesar 100 bar ditunjukkan pada tabel (4.1). Untuk
data nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi
pada tekanan sebesar 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar dan 250 bar
dapat dilihat pada lampiran A.
Tabel 4.1 : Tabel nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang
bervariasipada tekanan sebesar 100 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
0,55 5,36 7,46
Tabel (4.1) menunjukkan data nilai waktu retensi dalam kondisi laju alir yang
bervariasi pada tekanan 100 bar.Semakin tinggi laju alirnya, waktu retensinya
semakin singkat.Perbedaan waktu retensi antara laju alir yang satu dengan laju alir
Hasil nilai waktu retensi dariParasetamol dan Kafein dalam kondisi
tekanan bervariasi pada laju alir sebesar 1,45ml/min ditunjukkan pada tabel (4.2).
Untuk data nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan
bervariasi pada laju alir sebesar 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min;1 ml/min;
1,15 ml/min;1,3 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min dan 1,9 ml/min terdapat pada
lampiran B.
Tabel 4.2 : Tabel nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang
bervariasi pada laju alir sebesar 1,45 ml/min.
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 3,01 4,45
Berdasarkan tabel (4.2) di atas terlihat bahwa tekanan mempengaruhi
waktu retensi. Semakin tinggitekanannya maka waktu retensinya semakin
singkat.Perbedaan waktu retensi antara tekanan yang satu dengan tekanan yang
lain pada laju alir yang sama untuk tiap molekul sangat kecil.
Dari tabel (4.1) dan (4.2) didapatkan gambar (4.5) dan (4.6).Berdasarkan
tabel data (4.1) maka didapatkan gambar grafik (4.5).Gambar (4.5) merupakan
grafik hubungan antara waktu retensi dan seper laju aliruntuk tekanan sebesar 100
Gambar 4.5. Grafik hubungan antara tRdan 1 / v pada tekanan sebesar 100 bar
Gambar (4.5) sesuai dengan persamaan (2.1).Pada gambar (4.5) Parasetamol
ditunjukkan oleh grafik yang berwarna biru. Waktu retensi Parasetamolberada
pada rentang antara 1,5 menit hingga 5,5 menituntuk rentang seper laju alir 0,5
bar-1(ml/min)-1 hingga 2 (ml/min)-1. Sedangkan Kafein ditunjukkan oleh grafik
berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara3 menit hingga
Berdasarkan tabel data (4.2) maka didapatkan gambar grafik (4.6).
Gambar (4.6) merupakan grafik hubungan waktu retensi dan tekanan untuk laju
alir sebesar 1,45 ml/min.
Gambar 4.6. Grafik hubungan antara tRdan P pada laju alir sebesar 1,45
ml/min.
Pada gambar (4.6) Parasetamol ditunjukkan oleh grafik berwarna biru.Waktu
retensi Parasetamol berada pada rentang antara 2 menit hingga 3 menit pada
rentang tekanan dari100 bar hingga 250 bar.Sedangkan Kafein ditunjukkan oleh
grafik berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara 4 menit
B. Pembahasan
Pengukuran merupakan kegiatan yang sering dilakukan sehari – hari.
Suatu pengukuran yang ideal akan menghasilkan hasil pengukuran yang akurat.
Dalam suatu pengukuran terdapat dua hal yang penting yaitu input dan
output.Input merupakan masukan yang akan diukur sedangkan output merupakan
hasil akhir keluaran yang diinginkan dalam suatu pengukuran. Nilai dari output
yang dikeluarkan bergantung pada input dan instrumen yang digunakan.
Suatu instrumen atau alat ukur berfungsi untuk mengukur suatu besaran
tertentu. Suatu pengukuran yang ideal membutuhkan instrumen yang memenuhi
beberapa persyaratan yaitu: sensitif, selektif, tidak mengganggu sampel yang
diukur dan memiliki waktu tanggap cepat. Pengukuran yang menggunakan
instrumen dengan kriteria seperti di atas diharapkan dapat menghasilkan output
yang akurat.
Dalam eksperimen ini dilakukan pengukuran dua buah molekul yang
terkandung di dalam suatu sampel.Dua buah molekul tersebut yaitu Parasetamol
dan Kafein.Sampel yang digunakan merupakan campuran dari larutan
standarParasetamol dan Kafein.Oleh karena sampel yang digunakan adalah
sampel campuran maka alat ukur yang digunakan haruslah memiliki selektivitas
tinggi, yaitu suatu alat yang mampu mengidentifikasi Parasetamol dan Kafein
yang terdapat dalam suatu sampel.Alat ukur tersebut mampu memisahkan
Parasetamol dan Kafein dalam suatu campuran.Dalam penelitian ini digunakan
HPLC atauHigh Pressure Liquid Chromatographyadalah salah satu alat yang bekerja berdasarkan prinsip kromatografi.Kromatografi merupakan suatu
teknik pemisahan.Sehingga HPLC berfungsi untuk memisahkan molekul yang
satu dengan yang lain. HPLC berbeda dibandingkan dengan kromatograf
lainnya.Pada HPLC untuk memaksimalkan pemisahan digunakan laju alir
tertentudan tekanan tinggi. Proses pemisahan pada HPLC terjadi di dalam kolom.
Oleh karena itu, kolom merupakan bagian yang paling penting dalam sistem
HPLC.Metode pemisahan yang digunakan bergantung pada jenis fase gerak dan
kolom.
Metode kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini adalah
metode kromatografi fase terbalik. Pada metode pemisahan ini, fase gerak yang
digunakan yaitu methanol bersifat polar sedangkan fase diam yaitu kolom C-18
(oktadesil silica) bersifat non polar. Parasetamol dan Kafein yang digunakan pada penelitian ini sebagai sampel merupakan zat yang bersifat polar.Metode
kromatografi fase terbalik sangat baik digunakan untuk memisahkan sampel yang
bersifat polar [Khopkar, 1990].
Mekanisme terjadinya suatu pemisahan pada HPLC didasarkan pada
kompetensi antara fase gerak dan sampel yang berinteraksidengan kolom.Pada
saat ada suatu sampel yang terdiri dari satu jenis molekul yang melewati kolom,
maka akan terjadi interaksi antara molekul yang lewat dengan kolom. Akibat
adanya interaksi tersebut molekul membutuhkan waktu tertentu untuk berjalan
dari ujung kolom hingga keluar dari kolom.Waktu tersebut didefinisikan sebagai
Kolom tersusun oleh bagian – bagian penyusun kolom.Sehingga
interaksi yang terjadi bergantung pada bagian – bagian penyusun kolom dan
molekul yang melewati kolom. Bagian – bagian penyusun kolom dan jenis kolom
mempengaruhi besar faktor porositas dan faktor resistan kolom. Bila jenis kolom
yang digunakan adalah tetap maka besar waktu retensi bergantung pada molekul
yang melewati kolom.Sehingga bila ada sampel melewati kolom terdiri dari dua
buah molekul maka didapatkan dua buah nilai waktu retensi yang berbeda untuk
tiap molekul.Besar waktu retensi yang berbeda menunjukkan bahwa kedua
molekul tersebut terpisah.
Proses pemisahan yang terjadi dalam penelitian ini adalah antara
Parasetamol dan Kafein. Molekul Parasetamol dan Kafein berinteraksi terhadap
bagian - bagianpenyusun kolom.Akibat interaksi tersebut Kafein tertahan lebih
lama pada kolom dibandingkan dengan Parasetamol.SehinggaParasetamol dan
Kafein terpisah.Contoh proses pemisahan yang terjadi di dalam kolom
ditunjukkan pada gambar (2.2).
Dalam proses pemisahan, waktu retensi memegang peranan penting.
Dua buah molekul yang saling terpisah memiliki waktu retensi yang berbeda satu
sama lain sehinggawaktu retensi menunjukkan identitas suatu molekul pada saat
pemisahan. Penelitian ini diawali dengan menentukan waktu retensi dari
Parasetamol dan Kafein.Masing – masing larutan standar kedua molekul tersebut
disuntikkan ke dalam sistem HPLC secara terpisah.Hasil keluaran detektor berupa
grafik yang ditunjukkan pada gambar (4.1) dan (4.2).Terdeteksinya Parasetamol
menampilkan terdeteksinya Parasetamol saat 4,38 menit yang ditunjukkan oleh
sebuah puncak. Sedangkan gambar (4.2) menampilkan terdeteksinya Kafein saat
7,71 menit yang juga ditunjukkan dengan sebuah puncak. Dari kedua gambar
grafik tersebut diketahui bahwa Parasetamol memiliki waktu retensi yang lebih
singkat dibandingkan dengan Kafein.
Penelitian selanjutnya dilakukan penentuan waktu retensiParasetamol
dan Kafein yang terdapat dalam suatu campuran.Hasil dari proses ini ditunjukkan
oleh gambar (4.3) dan (4.4). Keduabuah gambar tersebut masing – masing
menghasilkan dua buah puncak, yang menunjukkan Parasetamol dan
Kafein.Gambar (4.3) merupakan grafik penentuan waktu retensi Parasetamol dan
Kafein untuk laju alir 1ml/min, pada keadaan ini didapatkan waktu retensi
Parasetamol adalah 4,6 menit dan Kafein adalah7 menit. Gambar (4.4) merupakan
grafik penentuan waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir 1,9
ml/min, pada keadaan ini didapatkan waktu retensi Parasetamol adalah 2,36 menit
dan Kafein adalah3,86 menit.
Berdasarkan gambar (4.3) dan (4.4) terlihat bahwa Parasetamol dengan
Kafein terpisah.Parasetamol memiliki waktu retensi yang berbeda dari
Kafein.Parasetamolmemiliki waktu retensi yang lebih singkat dibandingkan
dengan Kafein.Semakin tinggi laju alirnya waktu retensinya akan semakin singkat
sehingga dapat disimpulkan bahwa besar laju alir mempengaruhi nilai waktu
retensi.
Selanjutnya dilakukan penelitian tentang pengukuran waktu retensi
alir 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min;
1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min untuk tekanan 100 bar.
Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar,
200 bar, 225 bar dan 250 bar, data yang dihasilkan dapat dilihat pada lampiran A.
Sedangkan pengukuran waktu retensi dalam kondisi tekanan yang bervariasi pada
laju alir tertentu, dilakukan pada tekanan 100 bar,125 bar, 150 bar, 175 bar, 200
bar, 225 bar dan 250 bar untuk laju alir 0,55 ml/min. Selanjutnya dilakukan hal
yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3
ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min, data yang
dihasilkan dapat dilihat pada lampiran B.
Contoh data waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk kondisi laju
alir yang bervariasi pada tekanan tertentu adalah tabel (4.1). Pada tabel (4.1)
terlihat bahwa semakin tinggi laju alirnya maka waktu retensi dari kedua molekul
semakin singkat. Hal ini sesuai dengan persamaan (2.1) yaitu waktu retensi
berbanding terbalik terhadap laju alir. Sedangkan contoh data waktu retensi
Parasetamol dan Kafein untuk kondisi tekanan yang bervariasi pada laju alir
tertentu adalah tabel (4.2). Pada tabel (4.2) terlihat bahwa tekanan juga
mempengaruhi waktu retensi, semakin tinggi tekanannya maka waktu retensinya
semakin singkat.
Suatu input yang divariasikan akan berdampak pada output yang
dihasilkan. Hal ini terlihat pada nilai waktu retensi yang dihasilkan.Laju alir dan
tekanan yang besarnya bervariasi akan mengubah nilai waktu retensi, sehingga
dantekanannya maka waktu retensinya semakin singkat. Berdasarkan tabel – tabel
data yang didapatkan terlihat bahwa waktu retensi lebih dipengaruhi oleh laju alir
dibandingkan dengan tekanan. Perbedaan waktu retensi antara laju alir yang satu
dengan laju alir yang lainpada kondisi tekanan tertentu untuk tiap molekul cukup
besar, sedangkan perbedaan waktu retensi antara tekanan yang satu dengan
tekanan yang lainpada kondisi laju alir tertentu untuk tiap molekul sangat kecil.
Berdasarkan tabel – tabel data yang ada dapat diperoleh grafik
hubungan antara waktu retensi dengan laju alir dan tekanan.Contoh grafik
ditunjukkan pada gambar (4.5) dan (4.6).Pada gambar (4.5) dan (4.6) terdapat
grafik biru yang menunjukkan Parasetamol dan grafik merah yang menunjukkan
Kafein.
Gambar (4.5) menunjukkan hubungan antara antara tR dan 1 / v pada
tekanan sebesar 100 bar. Waktu retensi Parasetamol berada pada rentang antara
1,5 menit hingga 5,5 menit untuk rentang seper laju alir 0,5 bar-1 (ml/min)-1
hingga 2 (ml/min)-1. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara 3 menit
hingga 7,5 menit pada rentang seper laju alir 0,5 (ml/min)-1 hingga 2 (ml/min)-1.
Waktu retensi Parasetamol dan Kafein berbeda.Semakin tinggi laju alir maka
waktu retensi semakin singkat.
Gambar (4.6) menunjukkan hubungan antara tR dan P pada laju alir 1,45
ml/min. Semakin tinggi tekanan maka waktu retensi semakin singkat.Waktu
retensi Parasetamol berada pada rentang antara 2 menit hingga 3 menit pada
grafik berwarna merah. Waktu retensi Kafein berada pada rentang antara 4 menit
hingga 5 menit pada rentang tekanan dari 100 bar hingga 250 bar.
Gambar (4.5) dan (4.6) merupakan grafik dua dimensi.Kedua buah
grafik tersebut menampilkan hubungan antara waktu retensi dengan laju alir pada
tekanan tertentu dan waktu retensi dengan tekanan pada laju alir tertentu.Grafik
tersebut tidak mampu menampilkan secara langsung hubungan antara waktu
retensi terhadap laju alir dan tekanan.Dikarenakan banyaknya tabel data nilai
waktu retensi Parasetamol dan Kafein yang telah didapatkan sehingga terdapat
kesulitan jika harus melihat semuanya serta tidak praktis.Maka untuk
mempermudah dalam pembacaan data nilai waktu retensi, semua tabel data nilai
waktu retensi Parasetamol dan Kafein digabung kemudian ditampilkan kembali
dalam bentuk tabel matriks.Sehingga didapatkan dua buah tabel data matriks,
41
Tabel 4.3: Tabel hubungan nilai waktu retensi (menit) Paracetamol terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar) Laju alir (ml/min)
Tabel (4.3) dan (4.4) menunjukkan hubungan antara waktu
retensiterhadap laju alir dan tekanan untuk masing – masing molekul Parasetamol
dan Kafein.Tabel (4.3) dan (4.4) mempermudah dalam melihat data nilaiwaktu
retensi untuk masing – masing molekul Parasetamol dan Kafein.Tabel tersebut
menunjukkan secara langsung nilai waktu retensi untuk laju alirdantekanan
tertentu.
Berdasarkan tabel (4.3) dan (4.4) dapat diperoleh grafik 3 dimensi yang
menggambarkan hubungan antara waktu retensi terhadap laju alir dan tekanan
untuk masing – masing molekul Parasetamol dan Kafein.Grafik 3 dimensi
tersebut diperoleh dengan mengolah data yang terdapat pada tabel (4.3) dan (4.4)
dengan menggunakan program origin 6.0. Hasilnya adalah dua buah grafik yang
0 .6
Gambar 4.7.Grafik hubungan waktu retensi (menit) terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar) untuk pengukuran Parasetamol pada
panjang gelombang 263 nm dengan menggunakan kolom C-18 yang berukuran panjang 100mm diameter 4,6mm
0 .6
Gambar 4.8.Grafik hubungan waktu retensi (menit) terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar) untuk pengukuran Kafein pada panjang gelombang 263 nm dengan menggunakan kolom C-18 yang berukuran
Grafik pada gambar (4.7) dan (4.8) menampilkan semua data nilai waktu
retensi pada laju alir dan tekanan tertentu.Hubungan antara waktu retensi terhadap
laju alir dan tekanan membentuk suatu bidang miring yang bergelombang tidak
beraturan. Pada bidang miring tersebut terdapat warna yang berbeda – beda.
Warna – warna yang berbeda menunjukkan rentang nilai waktu retensi yang
terjadi pada kondisi laju alir dan tekanan tertentu.
Grafik pada gambar (4.7) menampilkan hubungan nilai waktu retensi
(menit) Parasetamol terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar).
Waktu retensi Parasetamol dimulai dari rentang 2 menit hingga 5 menit pada
rentang laju alir fase gerak dari 0,6 ml/min hingga 1,8 ml/min dan tekanan dari
100 bar hingga 250 bar.
Grafik pada gambar (4.8) menampilkan hubungan nilai waktu retensi
(menit) Kafein terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar). Waktu
retensi Kafein dimulai dari rentang 4 menit hingga 7 menit pada rentang laju alir
fase gerak dari 0,6 ml/min hingga 1,8 ml/min dan tekanan dari 100 bar hingga 250
bar.
Dari gambar (4.7) dan (4.8) serta tabel (4.3) dan (4.4) terlihat bahwa
Semakin tinggi laju alir dan tekanannya maka waktu retensi Parasetamol dan
Kafein semakin singkat.Waktu retensi antara laju alir yang satu dengan yang lain
untuk satu tekanan tertentu berbeda jauh ditandai dengan kemiringan bidang
miring yang curam sedangkan waktu retensi antara tekanan yang satu dengan
ini dapat dilihat pada gambar (4.7) dan (4.8).Sehingga dapat disimpulkan bahwa
Laju alir fase gerak lebih berpengaruh pada waktu retensi Parasetamol dan Kafein
dibandingkan dengan tekanan. Perubahan laju alir yang semakin besar
mengakibatkan waktu retensi Parasetamol dan Kafein menjadi semakin singkat.
Gambar (4.7) dan (4.8) menunjukkan nilai waktu retensi masing –
masing untuk Parasetamol dan Kafein pada kondisi laju alir dan tekanan
tertentu.Dari kedua grafik terlihat bahwa waktu retensi Parasetamol dan Kafein
berbeda. Waktu retensi Parasetamol pada laju alir 0,9 ml/min dan tekanan 150 bar
berada pada rentang sekitar 4 menit – 4,5 menit. Sedangkan waktu retensi Kafein
pada laju alir 0,9 ml/min dan tekanan 150 bar berada pada rentang sekitar 6 menit
– 6,7 menit. Berdasarkan pernyataan tersebut dapat disimpulkan bahwa pada
kondisilaju alir, tekanan, dan kolom yang samadapat menghasilkan waktu retensi
yang berbeda untuk Parasetamol dan Kafein.Waktu retensi yang berbeda
46 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Telah dilakukan penelitian untuk mencari pengaruh laju alir dantekanan
terhadap waktu retensi Parasetamol dan Kafein dengan menggunakan HPLC.
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
1. HPLC atau High Pressure Liquid Chromatography merupakan alat yang memiliki selektivitas tinggi dalam pemisahan dua buah molekul.
2. Laju alir fase gerak lebih berpengaruh terhadap waktu retensi
dibandingkan dengan tekanan.
3. Pada kondisi laju alir, tekanan dan kolom yang sama dapat dihasilkan
waktu retensi yang berbeda untuk tiap molekul.
B. Saran
Jika dikemudian hari akan dilakukan penelitian serupa menggunakan
HPLC, maka penulis menyarankan supaya faktor – faktor lain yang
mempengaruhi waktu retensi juga diteliti, misalnya dengan memvariasikan jenis
47
DAFTAR PUSTAKA
Doebelin, E.O., 2004. Measurement System Application and Design, 5th Ed. New York: McGraw-Hil.
Gritter, R. J., Bobbit, J. M., Schwarting, A. M. 1991. Introduction to Chromatography. Penerjemah : Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB. Holman, J. P., Jasjfi, E. 1984. Metode Pengukuran Teknik, 4th Ed. Jakarta :
Erlangga.
Johnson, E. L., Stevenson, R. 1991.Basic Liquid Chromatography. Penerjemah : Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB.
Khopkar, M. S. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia Press.
Kuwana, T. 1980. Physical Methods in Modern Chemical Analysis,2nd Ed. New York : Academic Press.
Morris, A. S., 1996.The Essenceof Measurement. Britain: TJ Press.
Rangan, C. S., Sarma, G. R., Mani, V. S. V., 1985.Instrumentation Devices and Systems. New Delhi: Tata McGraw - Hill.
LAMPIRAN A
A. Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk kondisi laju alir bervariasi pada tekanan tertentu.
a. Tabel A.1 :Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang bervariasi
pada tekanan sebesar 125 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
0,55 5,25 7,31
b. Tabel A.2 :Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang
bervariasi pada tekanan sebesar 150 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
c. Tabel A.3 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang
bervariasi pada tekanan sebesar 175 bar
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
0,55 5,21 7,25
d. Tabel A.4 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang
bervariasi pada tekanan sebesar 200 bar
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
e. Tabel A.5 :Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang bervariasi
pada tekanan sebesar 225 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
0,55 5,27 7,28
f. Tabel A.6 :Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang
bervariasi pada tekanan sebesar 250 bar.
Laju alir (ml/min) tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
LAMPIRAN B
B. Pengukuran waktu retensi Parasetamol
dan Kafein dalam kondisi tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu.
a. Tabel B.1 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 0.55 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 5,36 7,46
b. Tabel B.2 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 0.7 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 5,00 7,17
c. Tabel B.3 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 0.85 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
d. Tabel B.4 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 4,01 6,22
e. Tabel B.5 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1.15 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 3,31 5,54
f. Tabel B.6 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1.3 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
g.Tabel B.7 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1.6 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 2,33 4,21
h.Tabel B.8 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1.75 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
100 2,17 4,03
i. Tabel B.9 : Nilai waktu retensi Parasetamol
dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir 1,9 ml/min
Tekanan (P) bar tRParasetamol (menit) tRKafein (menit)
