METODE PENELITIAN
2.1 Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Juni sampai Agustus 2011.
2.2 Alat-alat
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap (agilent LC 1220) dengan pompa, degasser (DGU 20 AS), injector Autosampler, kolom Luna Phenomenex C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis, wadah fase gerak, vial khusus Autosampler, Sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA – P604 – BN), neraca analitik (Mettler Toledo), membrane filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose nitrate membran filter 0,45 µm.
2.3 Bahan-bahan
Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu methanol grade for HPLC (E.Merck®), aquabidestilata (PT. Ikapharmindo Putramas), metil paraben BPFI (Badan POM RI), metil paraben (PT.Brataco), kecap Mi instan Supermi kemasan plastik, kecap ABC kemasan plastik, kecap Bango kemasan plastik, kecap botol Langkat, kecap botol Angsa, kecap Pop Mie Cup Goreng kemasan plastik, saus sachet Del monte, saus sachet Sasa, saus sachet Indofood, dan saus Pop Mie Cup Goreng kemasan plastik.
2.4 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, artinya tidak semua anggota dalam populasi mempunyai peluang yang sama untuk terpilih menjadi
sampel. Pengambilan sampel pada penelitian ini didasarkan pada informasi dugaan akan terkandungnya pengawet metil paraben sebagai pengawet di dalam kecap dan saus menurut jurnal varia laboratorium (2004).
2.5 Prosedur penelitian 2.5.1 Penyiapan Bahan
2.5.1.1 Pembuatan Fase Gerak Metanol – air
Metanol 500 ml di saring dengan menggunakan mebran filter PTFE 0,5 µm dan diawaudarakan selama 30 menit. Aquabidestilata 500 ml di saring dengan menggunakan cellulose nitrate membran filter 0,45 µm dan diawaudarakan selama 30 menit.
2.5.1.2 Pembuatan pelarut
Larutan metanol dan air di campur dengan perbandingan 40:60 (fase gerak hasil optimasi). Pelarut kemudian di saring dengan penyaring PTFE 0,2 µm dan diawaudarakan selama 30 menit.
2.5.2 Prosedur Analisis
2.5.2.1 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Masing – masing unit diatur, kolom yang digunakan C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai di peroleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.
2.5.2.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak dan Laju Alir yang Optimum Kondisi kromatografi divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis optimum adalah komposisi fae gerak dan laju alir. Perbandingan fase gerak metanol – air yang divariasikan 20:80, 40:60, 60:40, 80:20 sedangkan laju alir
divariasikan 0,8 ml/menit dan 1 ml/menit. Kondisi kromatografi yang memberikan waktu tambat singkat, tailing factor kecil dan efisiensi penggunaan pelarut selanjutnya di pilih sebagai kondisi yang akan digunakan dalam penelitian ini.
2.5.3 Analisis Kualitatif menggunakan KCKT
2.5.3.1 Uji Identifikasi Metil Paraben menggunakan KCKT
Metil paraben BPFI dengan konsentrasi 50 µg/ml dan larutan sampel masing- masing diinjeksikan menggunakan vial autosampler sebanyak 5 µl, dianalisis pada kondisi KCKT yang sama dari perbandingan fase gerak metanol-air dan laju alir yang terbalik hasil orientasi, kemudian dicatat masing-masing waktu tambatnya. Waktu tambat kromatogram hasil penyuntikan metil paraben BPFI dibandingkan dengan sampel pada kondisi KCKT yang sama. Apabila waktu tambat sampel hampir sama dengan waktu tambat BPFI, maka sampel mengandung metil paraben. Untuk mempertegas identifikasi ini, sedikit larutan metil paraben BPFI ditambah (spiking) ke dalam larutan sampel kemudian dianalisis kembali pada kondisi KCKT yang sama. Luas area dan waktu tambat yang sama diamati kembali dan dibandingkan antara kromatogram hasil spiking dengan kromatogram larutan sampel sebelum spiking. Sampel dinyatakan mengandung metil paraben, jika terjadi peningkatan tinggi puncak dan luas area pada kromatogram hasil spiking dengan waktu tambat sama seperti pada kromatogram penyuntikan larutan metil paraben BPFI.
2.5.4 Analisis Kuantitatif
2.5.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Metil Paraben
larut. Setelah larut, diencerkan lagi dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 µg/ml (LIB I).
Dari LIB I dipipet 5 ml, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 50 µg/ml (LIB II).
2.5.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Metil Paraben BPFI
Dipipet Larutan Induk Baku II (LIB II) sebanyak 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, dan 4,0 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda. Kocok sehingga diperoleh konsentrasi 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 3,0 µg/ml dan 4,0 µg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 5 µl dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi kemudian dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya. 2.5.4.3 Penetapan Kadar Sampel
Ditimbang seksama 5 gram kecap, dipindahkan secara sistematik kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, lalu dilarutkan dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda. Dikocok-kocok ± 5 menit lalu disaring dengan kertas saring, ± 5 ml filtrat pertama dibuang. Dipipet 5 ml filtrat, dimasukkan ke dalama labu tentukur 50 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda. Dikocok-kocok ± 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm kemudian diawaudarakan selama 15 menit. Sampel diinjeksikan sebanyak 5 µl ke sisitem KCKT vial autosampler dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm dengan perbandingan fase gerak metanol-air (40:60) dan laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan untuk setiap sampel.
Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = ax + b.
Y= menyatakan absorbansi x= konsentrasi
a= koefisien regresi (juga menyatakan slope = kemiringan) b= tetapan regresi dan juga disebut dengan intersep
2.5.5 Validasi Metode 2.5.5.1 Kecermatan
Uji akurasi (accuracy) ditentukan dengan menggunakan metode penambahan baku (standart addition method), yakni ke dalam sampel ditambahkan larutan baku metil paraben 100% dari rata-rata kadar metil paraben yang terdapat pada sampel, kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel (Epshtein, 2004). Hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery). Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus (Harmita, 2004):
% Perolehan kembali = A A F C C C * x 100% Keterangan :
CF = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran (µg/g)
CA = konsentrasi sampel sebenarnya (µg/g) C*A = konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/g) 2.5.5.2 Keseksamaan
Menurut Rohman (2009), presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada
Presisi seringkali diekspresikan dengan SD atau Koefisien Variasi (KV) dari serangkaian data. Nilai KV dirumuskan dengan :
% 100 x X SD KV Keterangan: KV = Koefisien Variasi (%) SD = Standar deviasi
X = Kadar rata-rata sampel Sementara itu, nilai SD dihitung dengan :
1 ) ( 2
n X X SD Dimana :X = nilai dari masing-masing pengukuran X = rata-rata (mean) dari pengukuran n = banyaknya data
2.5.5.3 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Batas Deteksi (Limit Of Detection /LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of Quantitation/LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
2 ) ( 2
n Yi Y SB Sl x Sy x LOD 3 Sl x Sy x LOQ 10 Keterangan:
Sy/x = Simpangan baku
Sl = Slope atau derajat kemiringan
2.5.6 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Menurut Harmita (2004), Rumus yang digunakan untuk menghitung Standar Deviasi (SD) adalah : 1 ) ( 2
n X X SDKadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
t hitung n SD X X /
Dengan dasar penolakan apabila t hitung ≥ t tabel, pada taraf kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1.
Keterangan :
SD = Standard deviation/simpangan baku X = Kadar dalam satu perlakuan
X = Kadar rata-rata dalam satu sampel n = Jumlah perlakuan
Untuk mencari kadar sebenarnya dapat digunakan rumus (Wibisono, 2005):
n SD x t X (1 1/2)dk Keterangan: μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan
t = Harga ttabel sesuai dengan derajat kepercayaan dk= Derajat kebebasan.
