Karakteristik Sifat Fisik Semen Segar
Evaluasi terhadap karakteristik semen segar bertujuan untuk mengetahui potensi reproduksi seekor pejantan. Selanjutnya akan diketahui apakah semen tersebut layak diproses lebih lanjut menjadi semen cair atau semen beku. Dengan demikian dapat diperkirakan jumlah betina yang dapat diinseminasi oleh seekor pejantan dalam waktu tertentu. Seluruh pejantan pada penelitian ini menghasilkan semen segar dengan kualitas cukup baik (Tabel 9). Data-data tersebut secara umum berada dalam kisaran normal, sehingga semua semen segar dari ketiga pejantan layak diproses menjadi semen cair.
Tabel 9. Karakteristik sifat fisik semen segar kuda
Karakteritik Rataan Kisaran
Volume (mL) 29.25±9.33 15-55
Warna putih keruh -
Konsistensi Encer - pH 7.00±0.12 6.70-7.20 Motilitas (%) 67.08±9.08 35-75 Hidup (%) 77.89±6.46 52.20-82.70 Konsentrasi (106 /mL) 211.88±21.15 180-265 Total spermatozoa / ejakulat (109 ) 6.28±2.45 2.93-12.93 Abnormalitas (%) : 27.26±4.64 19.23-37.49 • Primer (%) 6.21±1.18 2.02-14.57 • Sekunder (%) 21.02±2.58 13.43-33.97 Karakteristik Makroskopik
Secara keseluruhan semen segar kuda mempunyai rataan volume (tanpa fraksi gel) sebesar 29.25±9.33 mL (berkisar 15-55 mL), berwarna putih-keruh, konsistensi encer dan pH relatif netral dengan rataan 7.00±0.12 (berkisar 6.70-7.20). Volume semen segar pada penelitian ini tidak berbeda dengan data Morel (1999) yang menyebutkan bahwa volume semen dari kuda Thoroughbred adalah 28.3 mL (31.0 mL termasuk fraksi gel), Standarbred adalah 30.2 mL (33.3 mL termasuk fraksi gel), dan Quarterhorse adalah 23.8 mL (27.8 mL termasuk fraksi gel). Tetapi lebih rendah
dari data Toelihere (1979) yaitu sebesar 70 mL (berkisar 30-250 mL), serta Garner dan Hafez (2000) yaitu sebesar 60-100 mL. Namun demikian, tidak disebutkan apakah volume total atau volume tanpa fraksi gel.
Dibanding dengan hewan ternak lain kecuali babi, rataan volume semen kuda lebih besar. Volume semen kuda, babi, sapi dan domba masing-masing adalah 60- 100, 150-200, 5-8 dan 0.8-1.2 mL per ejakulat (Garner & Hafez 2000). Beberapa faktor yang mempengaruhi volume semen adalah umur hewan, musim, bangsa, frekuensi ejakulasi, lama pengenalan dengan betina sebelum ejakulasi (teasing) dan kondisi kesehatan (Morel 1999).
Derajat keasaman (pH) semen segar tidak berbeda dengan data Morel (1999) yang menyatakan bahwa pH semen kuda adalah 6.20-7.80. Tetapi relatif lebih rendah dari Toelihere (1979) serta Garner dan Hafez (2000) yaitu berkisar 7.00-7.80. Semen ejakulat kedua atau ketiga dan seterusnya karena sedikitnya plasma semen, ejakulat dengan konsentrasi spermatozoa yang rendah, dan adanya infeksi pada saluran reproduksi dapat meningkatkan pH (Morel 1999, Malmgren 2000).
Menurut Toelihere (1979a) semen kuda secara umum berwarna terang sampai kelabu, dengan konsistensi encer. Hal ini terkait dengan konsentrasi spermatozoa yang relatif lebih rendah dibandingkan dengan hewan ternak lain seperti sapi dan domba. Sedangkan menurut Garner dan Hafez (2000) konsistensi semen bergantung dari bagian semen (fraksi) yang ditampung. Fraksi pra-spermatozoa mempunyai konsistensi encer seperti air (watery), fraksi kaya-spermatozoa konsistensi seperti susu tetapi tidak kental (milky, nonviscous), sedangkan fraksi pasca-spermatozoa konsistensinya sangat kental (highly viscous). Hal ini terkait dengan cairan yang berasal dari sekresi kelenjar urethal (fraksi pra-spermatozoa), kelenjar epididymis dan ampula vas deferens (fraksi kaya-spermatozoa), dan kelenjar vesicularis (fraksi pasca- spermatozoa). Warna dan konsistensi semen dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain adalah adanya urin (urospermia), darah (hemospermia), nanah (pyospermia), dan konsentrasi spermatozoa (Morel 1999, Garner & Hafez 2000).
Karakteristik Mikroskopik
Persentase Spermatozoa Motil Progresif (M%). Pada penelitian ini, rataan persentase spermatozoa motil progresif adalah 67.08±9.08% (berkisar 35-75%). Hasil ini relatif sama dengan data Toelihere (1979a), Lock (1986) serta Garner dan Hafez
(2000) yang mendapatkan motilitas sebesar 40-75%, dan Malmgren (2000) yang mendapatkan presentase motilitas di atas 50%. Rauge (2003) menyarankan persentase motilitas spermatozoa yang dapat diproses lebih lanjut untuk dipakai pada perkawinan dengan cara IB minimal adalah 60%. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi presentase motilitas spermatozoa antara lain adalah suhu lingkungan atau media, residu perlengkapan koleksi (misalnya jelly), pH dan tekanan osmotik media, serta jarak antar-penampungan (Rauge 2003).
Persentase Spermatozoa Hidup (H%). Persentase spermatozoa hidup yang didapat secara rataan adalah 77.89±6.46% (berkisar 52.20-82.70%). Hasil ini tidak berbeda dengan data Morel (1999) yang menyarankan bahwa untuk keperluan IB sebaiknya perbandingan antara spermatozoa hidup dan mati adalah lebih dari 60%:40%. Sedangkan Rossdale dan Ricketts (1980) dalam Morel (1999) serta Anonim (2005b) menyarankan perbandingan antara spermatozoa hidup dan mati yang dapat dijadikan indikasi viabilitas seekor pejantan adalah lebih besar dari 50%.
Dengan metode pewarnaan diferensial menggunakan eosin-negrosin 2% dapat dibedakan antara spermatozoa hidup dan mati. Spermatozoa mati akan terwarnai karena plasma membran permeabel terhadap eosin (Morel 1999). Dengan demikian bagian dalam spermatozoa akan terwarnai oleh eosin sehingga berwarna merah-ungu (eosinofilik), sedangkan spermatozoa yang hidup akan berwarna terang. Hal ini terjadi karena pada spermatozoa yang mati, permeabilitas membran plasma meningkat sehingga senyawa/ion kimia dapat bebas masuk ke dalam sel melewati membran plasma. Sedangkan spermatozoa yang hidup memiliki membran plasma utuh sehingga pompa natrium dapat berfungsi dengan baik. Dengan demikian enzim Na+K+ ATP-ase
yang terdapat pada membran plasma akan memompa kembali ion Na yang berikatan dengan pewarna eosin ke luar sel. Ini terjadi karena secara alami konsentrasi Na di dalam sel jauh lebih rendah daripada di luar sel. Pada spermatozoa yang mati, biasanya diikuti kerusakan membran plasma, yang berarti pompa natrium juga tidak berfungsi sebagaimana mestinya sehingga ion Na yang berikatan dengan pewarna eosin akan masuk dan tetap tinggal di dalam sel. Dengan demikian, akan memberi aspek warna merah-ungu pada bagian dalam sel terutama bagian kepala (Gambar 8).
Gambar 8. Spermatozoa hidup dan mati dengan pewarna eosin-nigrosin 2%: (a) hidup, kepala berwarna transparan, dan (b) mati, kepala berwarna merah.
Konsentrasi dan Spermatozoa Total. Konsentrasi spermatozoa dari semen segar yang didapat secara rataan adalah (211.88±21.15) x 106
/mL (berkisar 180-265 x 106/mL). Hasil ini relatif sama dengan data Toelihere (1979b) dan Rauge (2003) yaitu
sebesar 120 (berkisar 30-600 x 106/mL), serta Garner dan Hafez (2000) yaitu sebesar
(150-300) x 106/mL. Tetapi relatif lebih tinggi daripada yang pernah dilaporkan oleh
Morel (1999) yaitu sebesar 114.29 x 106/mL, 97.24 x 106/mL, dan 171.66 x 106/mL
masing-masing pada kuda Thoroughbred, Standardbred dan Quarterhorse. Sedangkan rataan spermatozoa total per ejakulat yang dihasilkan adalah sebesar (6.28 ±2.45) x 109
(berkisar 2.93-12.93 x 109
). Hasil ini relatif sama dengan data Toelihere (1979), Garner dan Hafez (2000), dan Rauge (2003) yaitu sebesar (5-15) x 109
. Tetapi lebih tinggi dari data Morel (1999) yaitu sebesar 5.03 x 109
, 4.74 x 109
, dan 5.37 x 109
masing-masing pada kuda Thoroughbred, Standardbred dan Quarterhorse. Konsentrasi dan total spermatozoa berkaitan dengan spermatogenesis. Sedangkan spermatogenesis dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain adalah musim, massa testis (ukuran testis), umur, frekuensi penampungan, bangsa hewan, kelainan pada jaringan testis, lingkungan (suhu, nutrisi, obat, racun), latihan proses koleksi, hormonal dan kelainan fisik (hernia, tumor, hipoplasia) (Morel 1999). Kapasitas produksi spermatozoa dari jaringan testis adalah sekitar 2 x 106
sel/g testis/hari (Anonim 2005b). Kapasitas produksi sangat terkait dengan fungsi tubuli
a
seminiferi sebagai tempat spermatogenesis, yang menyusun sekitar 80% dari total jaringan testis (Garner & Hafez 2000).
Volume, konsentrasi, persentase motilitas dan persentase abnormalitas menjadi indikator untuk menduga kapasitas reproduksi seekor pejantan. Semakin banyak volume, semakin tinggi konsentrasi dan semakin tinggi motilitas, serta semakin rendah abnormalitas maka kapasitas reproduksi seekor pejantan menjadi semakin tinggi.
Persentase Morfologi Abnormal. Pada penelitian ini, rataan persentase abnormalitas spermatozoa adalah (27.26±4.64)% (berkisar 19.23-37.49%). Dengan demikian rataan presentase morfologi spermatozoa normal adalah sekitar 73%. Hasil penelitian ini masih berada pada kisaran normal yaitu sebesar 60-90% (Garner & Hafez 2000, Anonim 2005b). Secara umum, persentase morfologi normal spermatozoa kuda lebih rendah apabila dibandingkan dengan hewan ternak lain seperti sapi dan domba. Dengan rincian abnormalitas primer sebesar (6.21±1.18)% (berkisar 2.02-14.57%) dan abnormalitas sekunder sebesar (21.02±2.58)% (berkisar 13.43- 26.97%), hasil penelitian ini menandakan bahwa proses spermatogenesis pada semua pejantan berlangsung baik.
Berdasarkan jenisnya, abnormalitas primer yang banyak ditemukan adalah bentuk kepala piriform/pearshape, microcephalus dan kepala tanpa ekor, masing- masing sebesar 1.85%, 1.72% dan 1.24% (Gambar 9, 10 dan 11). Sedangkan jenis abnormalitas sekunder yang banyak ditemukan adalah ekor melipat (bent tail) dan ekor melengkung (coiled tail), masing-masing sebesar 9.84% dan 4.43%. Hasil ini masih tergolong normal, bila melihat batasan yang diberikan oleh Morel (1999), yaitu 10.1-60% abnormal pada bagian ekor, 9.74-20.9% adanya proksimal droplet, 7.3- 7.55% adanya distal droplet, 6.7-7.47% abnormal pada bagian kepala, 4.1% abnormal pada bagian leher, dan 1.07% abnormal pada bagian midpiece.
Abnormalitas primer merupakan ketidaknormalan morfologi spermatozoa yang terjadi ketika spermatozoa masih di dalam tubuli seminiferi (spermatogenesis) (Rauge 2003). Dengan demikian kelompok abnormalitas ini lebih berbahaya karena sebagian adalah bersifat genetik. Semen dengan persentase abnormalitas primer cukup tinggi cenderung mempunyai fertilitas rendah, berkaitan dengan kemampuan mengawali fertilisasi atau memelihara perkembangan embrio (Barth & Oko 1989).
Gambar 9. Beberapa bentuk abnormalitas pada spermatozoa kuda: (a) ekor melipat, (b) kepala tanpa ekor, dan (c) microcephalus
1.852 0.619 1.722 0.618 0.089 1.244 0.065 0 0.5 1 1.5 2 Jenis abnormalitas P e rs e n ta s e ( % piriform / pears hape m akros efalus m ikros efalus ekor m elingkar ekor ganda tanpa ekor kepala rus ak
Gambar 10. Jenis dan presentase abnormalitas primer pada spermatozoa kuda
1.161 9.837 4.491 1.9591.789 1.326 0 2 4 6 8 10 12 Jenis abnormalitas P e rs e n ta s e ( % ) ekor rus ak ekor m elipat ekor m elengkung butir s itoplas m a tanpa ekor tanpa kepala
Gambar 11. Jenis dan persentase abnormalitas sekunder pada spermatozoa kuda a
b
a
c c
Sedangkan abnormalitas sekunder merupakan ketidaknormalan morfologi spermatozoa yang terjadi selama spermatozoa melewati saluran reproduksi atau kesalahan perlakuan setelah ejakulasi. Ketidaknormalan pada bagian ekor menyebabkan spermatozoa tidak dapat bergerak, sehingga tidak dapat bertemu sel telur untuk fertilisasi. Namun demikian, abnormalitas sekunder sering ditemukan dalam persentase cukup tinggi (sampai 25%) pada semen seekor sapi pejantan tanpa menunjukkan penurunan fertilitas (Barth & Oko 1989). Ekor melipat atau melengkung sebagai jenis abnormalitas sekunder yang sering ditemukan dapat disebabkan oleh kelebihan Zn selama proses pematangan di epididymis (Barth & Oko 1989). Selama proses pematangan serabut-fibril spermatozoa yang banyak mengandung sistein atau gugus sulfidril (--SH) menjadi stabil dengan membentuk ikatan silang S-S melalui oksidasi grup --SH. Apabila Zn berlebihan, serabut-fibril menjadi lembek karena ikatan silang S-S yang terbentuk akan teroksidasi kembali oleh Zn sehingga ekor mudah melengkung atau melipat.
Daya Tahan Spermatozoa dalam Semen Segar
Pada perlakuan ini, semua sampel disimpan pada kondisi aerob dengan menyisakan ruang berisi udara pada tabung penyimpan tetutup. Berdasarkan persentase motil progresif (M%) dan presentase spermatozoa hidup (H%) semen segar memperlihatkan perbedaan nyata (P<0.05) antara penyimpanan pada suhu ruang dengan penyimpanan pada suhu 4-6 oC setelah selama 3 jam atau lebih (Tabel 10).
Mulai pada jam ke-3 hingga jam ke-15, semen yang disimpan pada suhu ruang selalu menunjukkan nilai M% dan H% nyata lebih tinggi dibanding dengan penyimpanan pada suhu 4-6 o
C.
Penyimpanan pada suhu ruang menyebabkan spermatozoa cepat kehilangan sumber energi (substrat terbatas), penurunan pH lingkungan karena penimbunan asam laktat sebagai sisa metabolisme, perubahan akibat penuaan dan pertumbuhan kuman (Toelihere 1979b). Sedangkan penyimpanan pada suhu dingin dapat menekan metabolisme sehingga akan memperpanjang daya tahan motilitas, tetapi rentan terhadap efek cold shock (Brinsko et al. 2000). Efek cold shock berkaitan dengan perubahan bentuk fosfolipid pada membran spermatozoa, yaitu perubahan bentuk dari
cair ke bentuk gel yang terjadi pada suhu di bawah 20 oC (Kayser et al. 1992). Akibat
terjadi perubahan tatanan rantai asam lemak dan protein secara acak sehingga pada tempat tertentu terjadi kebocoran atau selektivitas membran menjadi rusak yang menyebabkan ion-ion tertentu bebas masuk (Graham 1996, Morel 1999). Untuk itu penyimpanan spermatozoa pada suhu mendekati 0 o
C memerlukan tambahan zat pelindung, misalnya fosfolipid kuning telur atau krioprotektan dalam media simpan.
Tabel 10. Persentase spermatozoa motil progresif dan persentase hidup semen segar pada suhu ruang dan suhu 4-6 oC
Lama Penyimpanan (jam)
0 3 6 9 12 15 ..….. Motilitas (%) (rataan ± standar deviasi) …....
Ruang 71.67±3.89 48.33±10.52a 32.92±10.33a 20.00±7.98a 10.42±5.82a 3.75±3.11a
3-5o
C 71.67±3.89 41.67±8.88b 22.50±9.42b 12.92±7.22b 5.00±4.47b 1.25±2.26b
….... Hidup (%) (rataan ± standar deviasi) …....
Ruang 79.70±3.65 71.49±6.32a 62.34±7.85a 50.40±7.37a 36.12±7.57a 26.51±4.31a
3-5o
C 79.70±3.65 65.82±6.68b 55.52±5.55b 41.07±8.34b 28.61±5.12b 20.95±2.99b Keterangan : superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05)
Tabel 11. Penurunan persentase spermatozoa motil progresif semen segar pada suhu ruang dan suhu 4-6 oC
Lama Penyimpanan (jam)
3 6 9 12 15 ………. (%) ………..
Ruang 23.34 15.41 12.92 9.58 6.67
4-6 o
C 30.00 19.75 9.58 7.92 3.75
Daya tahan simpan (longevity) semen berdasarkan persentase motilitas dapat menjadi salah satu indikasi fertilitas pada program IB. Sebagai uji daya tahan motilitas dapat dilakukan terhadap semen segar pada suhu 37-38 oC atau 22 oC, maupun semen
cair pada suhu 4-6 oC. Berdasarkan pengalaman, Morel (1999) memberikan batasan
bahwa pada semen segar, M% setelah 3 jam penyimpanan harus lebih dari 45%, dan setelah 8 jam penyimpanan harus lebih dari 10%. Pada penelitian ini presentase motil progresif semen segar setelah 3 jam penyimpanan pada suhu ruang (26-28 o
C) adalah Suhu
sekitar 48.33%, sedangkan persentase motilitas sebesar 10.42% tercapai setelah semen disimpan selama 12 jam (Tabel 10). Dengan demikian berdasarkan daya tahan motilitas, semen yang digunakan pada penelitian ini mempunyai kualitas cukup baik.
Salah satu faktor yang mempengaruhi daya tahan (persentase motilitas) semen adalah jumlah plasma semen (Jasko et al. 1992, Love et al. 2002). Pembuangan seluruh plasma semen terhadap semen yang disimpan pada suhu dingin dapat mempertahankan presentase motilitas dan melindungi kromatin spermatozoa. Pendinginan dan penyimpanan spermatozoa dengan jumlah plasma semen yang tinggi menyebabkan spermatozoa mudah rusak. Hal ini karena plasma semen mempunyai kandungan Na tinggi yang dapat menyebabkan perubahan tekanan osmotik pada saat pendinginan dan pembekuan (Morel 1999). Pemisahan plasma semen juga akan membuang sebagian mikroba patogen yang ada (Pickett et al. 2005). Di lain pihak, Aurich et al. (1996) berhasil meningkatkan M% dan persentase integritas membran ketika menggantikan plasma semen kuda yang tidak tahan pendinginan dengan plasma semen kuda yang tahan pendinginan.
0 20 40 60 80 100 0 3 6 9 12 15
Lama penyimpanan (jam)
P e rs e n ta s e ( % ) %M ruang %M 3-5oC %H ruang %H 3-5oC
Gambar 12. Grafik penurunan motilitas dan persentase hidup semen segar pada suhu ruang dan suhu 4-6 o
C
Dapat disimpulkan bahwa berdasarkan parameter spermatozoa motil progresif dan spermatozoa hidup, penyimpanan semen segar pada suhu ruang lebih dapat mempertahankan kualitas daripada penyimpanan pada suhu 4-6 o
C. Penurunan motilitas semen segar terbesar baik pada penyimpanan pada suhu ruang maupun pada
suhu 4-6 oC adalah pada 3 jam pertama (Tabel 11). Hal ini mungkin berkaitan dengan
masa penyesuaian spermatozoa terhadap lingkungan. Terlihat bahwa penurunan M% dan H% pada penyimpanan suhu 4-6 oC lebih cepat daripada suhu ruang, walaupun
pada akhir pengamatan cenderung sama (Gambar 12). Hal ini karena pada penyimpanan di bawah suhu 20 o
C, spermatozoa kuda sangat rentan terhadap efek cold shock sehingga perlu proses pendinginan secara perlahan dari 20 o
C sampai dengan 5 o
C (-0.05o
C/menit), walaupun dari 37 o
C ke 20 o
C bisa dilakukan secara cepat (Kayser et al. 1992).
Kerentanan spermatozoa terhadap efek penyimpanan pada suhu dingin berkaitan dengan perbandingan antara asam lemak takjenuh (unsaturated fatty acids) terhadap asam lemak jenuh (saturated fatty acids) di dalam fosfolipid, dan kandungan kolesterol pada struktur membran (White 1993). Semakin tinggi rasio asam lemak takjenuh terhadap asam lemak jenuh dan semakin rendah kandungan kolesterol maka spermatozoa relatif lebih rentan terhadap efek penyimpanan pada suhu dingin. Sebuah pengujian rasio antara asam lemak takjenuh dan asam lemak jenuh pada fosfolipid spermatozoa menunjukkan bahwa spermatozoa sapi, domba dan babi yang mempunyai rasio 2.5-3.0 lebih rentan daripada spermatozoa kelinci, anjing, manusia dan ayam yang mempunyai rasio sekitar 1.0 (White 1993, Amann 1999). Ini tejadi terutama pada proses pendinginan dari 20 o
C ke 0 o
C secara cepat.
Efek cold shock berkaitan dengan fase transisi fosfolipid pada membran spermatozoa, yaitu perubahan bentuk dari cair liqiud crystalline ke bentuk gel yang terjadi pada suhu di bawah 20oC (Kayser 1992). Akibat dari perubahan bentuk
fosfolipid diantaranya adalah terjadi perubahan tatanan rantai asam lemak dan protein secara acak (berbeda dari seharusnya) sehingga pada tempat tertentu terjadi kebocoran atau selektivitas membran menjadi rusak yang menyebabkan ion-ion tertentu bebas masuk (Graham 1996, Morel 1999). Penyimpanan pada suhu dingin juga menyebabkan kehilangan pospolipid substansial dari plasma membran spermatozoa (White 1993).
Kandungan asam lemak takjenuh yang tinggi pada kondisi aerob (terdapat O2)
rentan terhadap reaksi peroksidasi yang menghasilkan radikal bebas (anion superoksida), misalnya hydroxynonenal (White 1993). Pada sel somatis, efek toksik
glikolisis, pelisisan eritrosit, oksidasi --SH groups dan penghambatan --SH enzymes, modifikasi protein dan asam amino, kerusakan membran dan inaktivasi membrane-
bound enzymes, dan denaturasi DNA. Pada spermatozoa kuda dan sapi peroksidasi asam lemak terutama ditemukan pada daerah midpiece (Neild et al. 2002). Efek
peroksidasi pada spermatozoa domba, babi, kuda, manusia, kelinci dan sapi menyebabkan kehilangan motilitas permanen, penghambatan fruktolisis dan respirasi, serta kerusakan enzim intraseluler dan struktur membran plasma (Hammerstedt 1993,
White 1993).
Studi fisiko-kimia pada membran model menunjukkan bahwa polyunsaturated fatty acids (asam lemak takjenuh dengan ikatan rangkap lebih dari satu) membentuk lapisan, dan keberadaan kolesterol menyebabkan asam lemak berkondensasi pada permukaan membran spermatozoa (White 1993). Dapat berarti, kolesterol penting pada pembentukan permeabilitas spesifik dan kohesivitas struktur membran, terutama dengan keberadaan asam lemak takjenuh yang tinggi. Ini dibuktikan dengan diketahui kadar kolesterol pada spermatozoa domba dan sapi yang rentan terhadap efek suhu dingin adalah sekitar 300 µg/109
spermatozoa, sedangkan spermatozoa kelinci dan manusia yang kurang rentan mengandung sekitar 500 µg/109
spermatozoa.
Pada metabolisme spermatozoa, oksigen yang berlebihan (kondisi aerob) akan menyebabkan berbagai kerusakan peroksidatif, sehingga matriks lipid akan rusak dan membran menjadi tidak stabil (viskositas berubah). Metabolisme sel memerlukan oksigen sebagai terminal aseptor elektron pada proses yang menggunakan elektron bebas sebagai intermediat. Pada tahap berikutnya, oksigen yang bereaksi dengan eletron bebas akan membentuk anion superoksida. Apabila anion superoksida bereaksi dengan oksigen yang lain akan menyebabkan kerusakan membran yang permanen. Reaksi ini bersifat autokatalis, sekali dimulai banyak ikatan karbon ganda yang rentan akan rusak (Hammerstedt 1993). Walaupun demikian, beberapa senyawa antioksidan seperti alfa tokoferol (Baumer et al. 2002), dan enzim seperti peroksidase dan superoksida dismutase dapat menyelamatkan sel dengan mengubah radikal bebas menjadi senyawa tidak toksik, yaitu O2 dan H2O (Hammerstedt 1993).
Kualitas Semen Cair dalam Pengencer Dimitropoulos yang Disuplementasi dengan Fruktosa, Trehalosa atau Rafinosa
Semua perlakuan menunjukkan pola penurunan M% dan H% yang relatif sama, baik penyimpanan pada suhu ruang maupun suhu 4-6 o
C (Tabel 12 dan 13). Pada suhu ruang (26-28 o
C), perbedaan M% secara nyata (P<0.05) diantara perlakuan dapat teramati setelah 3 jam penyimpanan, sedangkan perbedaan H% baru teramati setelah 12 jam (Tabel 12). Perlakuan F50 (pengencer DV + fruktosa 50 mM) cenderung mempunyai M% dan H% lebih tinggi, sedangkan perlakuan T150 (pengencer DV + trehalosa 150 mM) dan R150 (pengencer DV + rafinosa 150 mM) cenderung lebih rendah dari perlakuan lain, walaupun pada beberapa pengamatan tidak berbeda nyata. Penyimpanan lebih dari 15 jam sudah tidak dapat ditoleransi oleh spermatozoa karena pada semua perlakuan menunjukkan M% kurang dari 25%.
Penyimpanan semen cair pada suhu 4-6 o
C, perbedaan yang nyata (P<0.05) di antara perlakuan berdasarkan parameter M% mulai terlihat setelah 12 jam, sedangkan berdasarkan H% setelah 36 jam (Tabel 13). Setelah 12 jam penyimpanan, perlakuan R150 (pengencer DV + rafinosa 150 mM) menunjukan M% nyata lebih rendah dari seluruh perlakuan, kecuali R100 (pengencer DV + rafinosa 100 mM) dan T150 (pengencer DV + trehalosa 150 mM). Namun demikian, perbedaan M% terhadap perlakuan DV0 baru terlihat ketika sampel disimpan selama 72 jam, yaitu perlakuan F50 (pengencer DV + fruktosa 50 mM) memperlihatkan hasil nyata lebih tinggi.
Secara umum pola penurunan H% dan M% adalah mirip dengan selisih sekitar 20% lebih tinggi H% dari M% baik pada penyimpanan suhu ruang maupun lemari es (Gambar 13, 14, 15 dan 16). Ini menyarankan bahwa banyak spermatozoa masih bertahan hidup selama penyimpanan tetapi tidak motil progresif. Secara keseluruhan, selama 24 jam (suhu ruang) dan 96 jam (lemari es) penyimpanan memperlihatkan bahwa semakin besar suplementasi fruktosa, trehalosa dan rafinosa cenderung menurunkan kualitas semen cair.
Parlevliet et al. (1992) melaporkan bahwa penyimpanan semen cair dengan konsentrasi 200 x 106
sel/mL pada suhu 20 o
C dan 5 o
C menunjukkan M% dan velocity (µm/detik) yang berbeda. Hingga 42 jam penyimpanan M% lebih baik pada suhu 20 o
C, sedangkan berdasarkan velocity lebih baik pada suhu 5 o
C. Persentase motilitas pada 6 jam, 18 jam dan 42 jam masing-masing adalah 53%, 47% dan 39%
pada suhu 20 oC, serta 55%, 41% dan 33% pada suhu 5 oC. Sedangkan velocity pada 6
jam, 18 jam dan 42 jam masing-masing adalah 66, 51 dan 40 pada suhu 20 oC, serta
70, 58 dan 46 pada suhu 5 oC.
Apabila diasumsikan batas minimal M% semen cair adalah 25% (Sqiures & Pickett 1996), maka pada penyimpanan suhu ruang semua perlakuan masih layak untuk IB hingga 12-15 jam penyimpanan, kecuali R150 hingga 9 jam. Sedangkan penyimpanan pada suhu 4-6 o
C, semua perlakuan masih layak untuk IB hingga 48-60 jam penyimpanan, kecuali F50 hingga 72 jam.
Kecenderungan penurunan M% dan H% semen cair dengan semakin tingginya konsentrasi karbohidrat baik pada penyimpanan suhu ruang maupun suhu 4-6 o
C mungkin berkaitan dengan semakin meningkatnya tekanan osmotik (hiperosmolaritas) media. Pada penelitian ini osmolaritas media yang digunakan berkisar antara 293 mOsm/kg (DV0 = pengencer DV tanpa suplementasi) dan 479 mOsm/kg (R150 = pengencer DV + rafinosa 50 mM) (Tabel 7). Perlakuan dengan osmolaritas media melebihi 450 mOsm/kg adalah F150 (pengencer DV + fruktosa 150 mM), T150 (pengencer DV + trehalosa 150 mM) dan R150 (pengencer DV + rafinosa 150 mM) dengan osmolatitas secara berurutan adalah 461, 472 dan 479 mOsm/kg.
Hasil ini mirip dengan laporan Pommer et al. (2002) yang menguji efek osmolaritas media antara 75 mOsm/kg hingga 900 mOsm/kg terhadap kualitas semen cair kuda dengan inkubasi pada suhu 22 oC selama 10 menit. Hasilnya menyatakan
bahwa media dengan osmolaritas 75, 150, 600 dan 900 mOsm/kg menghasilkan M% yang nyata lebih rendah (P<0.05) daripada kontrol (300 mOsm/kg). Sedangkan osmolaritas media 300 dan 450 mOsm/kg menghasilkan M% dan H% yang tidak berbeda nyata. Namun demikian berdasarkan parameter H%, media dengan osmolaritas 300-900 mOsm/kg tidak berbeda nyata, sedangkan media dengan osmolaritas 75-150 mOsm/kg nyata lebih rendah dari kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa osmolaritas media mendekati 300-450 mOsm/kg dapat ditoleransi oleh spermatozoa. Sedangkan menurut Morel (1999) osmolaritas media yang dapat ditoleransi dengan baik oleh spermatozoa kuda adalah sekitar 250-400 mOsm/kg.
0 10 20 30 40 50 60 70 0 3 6 9 12 15 18 21 24
Lama Penyimpanan (jam)
M o ti li ta s ( % ) D0 F50 F100 F150 T50 T100 T150 R50 R100 R150
Gambar 13. Grafik penurunan motilitas semen cair dalam pengencer DV yang disuplementasi fruktosa, trehalosa atau rafinosa pada suhu ruang
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 3 6 9 12 15 18 21 24
Lama Penyimpanan (Jam)
P e rs e n ta s e H id u p D0 F50 F100 F150 T50 T100 T150 R50 R100 R150
Gambar 14. Grafik penurunan spermatozoa hidup semen cair dalam pengencer DV yang disuplementasi fruktosa, trehalosa atau rafinosa pada suhu ruang Media hipotonik menyebabkan sel mengembang karena cairan ekstraseluler masuk ke dalam sel, sedangkan media hipertonik menyebabkan sel berkerut karena cairan intraseluler ke luar sel. Media yang hipotonik akan menyebabkan spermatozoa menggembung, sedangkan media hipertonik akan menyebabkan spermatozoa mengkerut. Penggembungan sel sampai 28% dari valume atau pengerutan sampai 11% nampaknya dapat ditoleransi oleh spermatozoa kuda (Pommer et al. 2002). Penggembungan sel lebih berefek negatif terhadap spermatozoa daripada pengerutan, setidaknya berdasarkan parameter M%, H% dan potensial membran mitokondria. Hal
ini karena spermatozoa mampu memelihara keseimbangan elektrolit dan potensial membran lebih baik pada saat pengkerutan daripada saat penggembungan.
Selain stres tekanan osmotik, daya tahan spermatozoa (semen cair) juga ditentukan oleh efek cold shock (White 1993, Devireddy et al. 2002). Stres osmotik (hipertonik) berpengaruh pada motilitas spermatozoa terkait dengan fase transisi fosfolipid yang menyebabkan penurunan fluiditas membran. Sedangkan efek cold shock lebih karena permeabilitas selektif membran rusak sehingga ion/senyawa tertentu mudah masuk ke dalam sel dan menyebabkan kerusakan. Kerentanan terhadap efek cold shock berkaitan dengan komposisi asam lemak pada fosfolipid, dan kandungan kolesterol membran (White 1993). Semakin tinggi rasio asam lemak