HASIL DAN PEMBAHASAN - Ekstrak metanolik daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) sebagai agen

Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan : a. 0 : kurang dari 5% (Sangat kuat) b. 1+ : 6% - 25% (Kuat)

c. 2+ : 26% - 50% (Sedang) d. 3+ : 51% - 75% (Lemah)

e. 4+ : 76% - 100% (Sangat lemah)

(Zang, dkk., 2002).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan ekstrak daun rosemary pada penelitian ini dilakukan dengan metode refluks menggunakan pelarut metanol. Refluks merupakan cara ekstraksi menggunakan pemanasan. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus mampu melarutkan senyawa yang diharapkan, dan memiliki titik didih lebih rendah dibandingkan dengan senyawa target, dengan hal tersebut kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metanol merupakan pelarut yang mampu menyari senyawa bersifat polar maupun nonpolar, sehingga diharapkan senyawa target dalam daun rosemary mampu tersari dengan baik. Ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini dengan metode refluks menggunakan pelarut metanol didapatkan rendemen sebesar 12%.

Berdasarkan penelitian Abe dkk. (2002), diketahui bahwa daun rosemary yang diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol mampu menyari senyawa aktif seperti asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Metode refluks dapat digunakan pada metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik didih yang tinggi

sebesar 284 C, dan pelarut metanol yang digunakan memiliki titik didih 64,5 C. Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan senyawa ekstrak metanol daun rosemary, namun diperkirakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antikanker oleh adanya senyawa-senyawa tersebut. Penelitian lain menggunakan asam betulinat pada sel kanker serviks HeLa memiliki aktivitas antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar

30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis Xu, dkk., 2014 . Menurut Yim dkk. 2006)

asam ursolat sebesar 15 μM mampu menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa.

Asam oleanolat sebesar 40 μM memiliki efek sitotoksik dan mampu menginduksi apotosis pada sel kanker hati HepG2 (Wang, dkk., 2013).

Perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, cuaca, dan kondisi lingkungan menyebabkan kandungan senyawa aktif dalam daun rosemary berbeda-beda, namun dengan menggunakan metode ekstraksi yang sama pada penelitian sebelumnya oleh Abe dkk. (2002) diharapkan senyawa yang tersari sama dengan penelitian tersebut. Menurut Yesil-Celiktas dkk. (2010), menyatakan bahwa ada beberapa kandungan senyawa aktif lainnya yang diidentifikasi dari daun rosemary antara lain asam carnosic, dan asam rosmarinic. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi kandungan senyawa dalam ekstrak metanol daun rosemary.

Uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) merupakan uji yang digunakan untuk mengukur viabilitas sel. MTT masuk ke dalam sel dan direduksi oleh enzim suksinat dehydrogenase menjadi formazan berwarna ungu yang tidak larut dan pada mitrokondria (Riss, dkk., 2013). Sel HeLa yang hidup ditandai dengan terbentuknya kristal formazan berwarna ungu, sehingga metode ini dapat digunakan untuk mengukur viabilitas sel. Formazan tersebut dapat larut setelah ditambahkan stopper (SDS), sehingga dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan ELISA reader dan dapat mengetahui IC50 dari ekstrak.

Aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa memberikan pengaruh pada morfologi sel setelah 24 jam perlakuan. Pada kelompok kontrol sel, sel berbentuk poligonal dan menempel pada plate (Gambar 1A). Pada kelompok perlakuan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi 62,5 μg/mL (Gambar 1B), morfologi sel HeLa terlihat mengkerut yang ditandai dengan sel berbentuk bulat, tidak menempel pada plate, serta kepadatan sel berkurang, begitu juga pada kelompok perlakuan cisplatin (Gambar 1C).

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. (A) Morfologi kontrol sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak metanol daun rosemary dengan konsentrasi 62,5 μg/mL. (C) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 μg/mL. Keterangan : menunjukkan sel menjadi mengkerut (berbentuk bulat), menunjukkan sel hidup dengan bentuk sel poligonal.

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin pada sel kanker serviks HeLa. Sel HeLa (1x10⁶ sel/mL) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary selama 24 jam. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam.

0 20 40 60 80 100 120 0 100 200 300 400 500 600 Viabi li tas sel (% )

Ekstrak metanol daun rosemary (µg/mL)

0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 via bil itas sel ( % ) Cisplatin (µg/mL) A ^B ^C A B

memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL (Gambar 2A) dan nilai IC50 cisplatin yaitu sebesar 36 µg/mL (Gambar 2B). Semakin tinggi konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary yang diberikan, sel HeLa yang hidup semakin berkurang. Secara umum efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan fenomena dose-dependent. Cisplatin adalah first line agen kemoterapi yang dalam pengobatan kanker serviks. Oleh karena itu cisplatin dapat dijadikan sebagai kontrol positif dalam pengembangan agen kemoprevensi.

Potensi suatu ekstrak dikatakan sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga kategori yaitu agen sitotoksik kuat apabila nilai IC₅₀< 20 µg/mL, sedang apabila memiliki nilai IC₅₀< 50 µg/mL dan lemah apabila nilai IC₅₀> 50 µg/mL (Ellithey, dkk., 2014). Menurut Machana dkk. (2011), menyatakan bahwa ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker apabila nilai IC₅₀ >500 µg/mL. Berdasarkan kriteria tersebut maka dapat dikatakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik atau memiliki aktivitas antikanker yang lemah terhadap sel kanker serviks HeLa.

Ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks HeLa, namun tetap dapat dijadikan agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat pada obat kemoterapi cisplatin memiliki kelemahan yaitu tidak selektif terhadap sel kanker, cisplatin bersifat toksik pada sel kanker dan sel normal sehingga muncul efek samping (Dasari dan Bernard, 2014). Oleh karena itu, dengan ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks HeLa, maka diharapkan tidak bersifat toksik terhadap sel normal, namun tetap diperlukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal.

Ekstrak metanol daun rosemary memiliki efikasi pengobatan yang rendah yang disebabkan efek sitotoksik lemah pada sel kanker serviks, sehingga untuk meningkatkan efikasi pengobatan ekstrak metanol daun rosemary dapat dikombinasikan dengan agen kemoterapi yang sudah ada seperti cisplatin. Kombinasi tersebut bertujuan untuk meningkatan efikasi dengan mengurangi efek toksik cisplatin pada sel atau jaringan normal dan resistensi (Hemaiswarya dan Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui efek sinergis dari kandungan ekstrak metanol daun rosemary dan obat kemoterapi.

Apoptosis adalah kematian sel yang terprogram, hal ini memicu fagositosis oleh makrofag, tanpa menimbulkan inflamasi (Hanahan dan Weinberg, 2000). Metode flowcytometry

digunakan dalam penelitian ini untuk mengetahui jenis kematian sel dan menampilkan data secara kuantitatif.

Sel- sel normal bersifat hidrofobik dan memiliki membran fosfolipid. Pada bagian luar lipid bilayer terdapat fosfatidilkolin dan sfingomielin, sedangkan pada bagian dalam terdapat fosfatidilserin. Ketika sel tersebut mengalami apoptosis, fosfatidilserin akan menuju ke bagian luar dan Annexin V akan berikatan secara spesifik dengan fosfatidilserine dibantu oleh ion Ca²⁺ (Hingorani, dkk., 2011). Sel yang mengalami kerusakan membran reagen propidium iodida akan berikatan dengan DNA, dan dapat memberikan data jumlah sel yang mengalami nekrosis (Vermes, dkk., 1995).

Gambar 3. Efekekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menginduksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa.Sel HeLa (1x 10⁶/mL) yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi ekstrak metanol daun rosemary 160 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan diwarnai dengan reagen annexin V dan propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A) Kontrol sel kanker serviks HeLa. (B) Sel kanker serviks HeLa yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL).

Hasil uji apoptosis menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol sel, sel yang masih hidup sebanyak 88,28%. Pada sel HeLa yang diberi cisplatin konsentrasi ½ IC50, menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 2,69%, sel yang mengalami apoptosis total sebanyak 36,06%, dan sel yang masih hidup sebanyak 61,80%. Pada sel HeLa yang diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50

R2 R4 R1 R2 R4 R1 R2 R4 R1 A B C

apoptosis total sebanyak 27,02%, dan sel yang masih hidup sebanyak 54,09% (Tabel I). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary menginduksi kematian sel melalui apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Pada kelompok sel yang mengalami nekrosis, nekrosis tersebut yaitu nekrosis sekunder karena dalam penelitian secara in vitro

yang dilakukan tidak ada peristiwa fagositosis oleh makrofag. Tahap kelanjutan dari peristiwa apoptosis akan terdeteksi sebagai nekrosis sekunder (Demoy, dkk., 2000). Pada penelitian yang dilakukan yaitu dengan waktu inkubasi 24 jam, peristiwa apoptosis sebelum terdeteksi sebagai nekrosis sekunder belum teramati. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis sebelum 24 jam.

Tabel I. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode Flowcytometry

Apoptosis dibagi menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik. Jalur ekstrinsik yaitu melalui aktivasi caspase-8 oleh ligan yang berikatan dengan reseptor

tumor necrosis factor (TNF) seperti Fas atau TNFR1. Jalur intrinsik disebabkan oleh peristiwa seperti kerusakan DNA sehingga berpengaruh terhadap ekspresi dari family protein Bcl-2 seperti Bax, Bcl-2, dan Bad (Weyhenmeyer, dkk., 2012).

Sel kanker serviks Hela memiliki karakteristik ekspresi p53 dalam jumlah yang kecil dan overekspresi Bcl-2. Overekspresi protein Bcl-2 menghambat pelepasan sitokrom–c dari mitokondria. Sitokrom-c tidak akan mengikat apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1), kemudian tidak terbentuk kompleks teraktivasi dari (d)ATP, sehingga caspase-3 tidak teraktivasi dan menyebabkan terjadiya penghambatan apoptosis (Weyhenmeyer, dkk., 2012). Uji imunositokimia digunakan untuk mengetahui aktivitas ekstrak metanol daun rosemary terhadap ekspresi protein Bcl-2.

Pada uji imunositokimia, perubahan warna yang terjadi akibat perubahan DAB dapat dijadikan penanda adanya kompleks antigen dan antibodi pada sel (Uhlen, dkk., 2016). Warna coklat pada sitoplasma menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu

Total Sel (%)

Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4 Sel Hidup Early Apoptosis Late Apoptosis Nekrosis

Kontrol Sel 88,28 3,55 2,58 5,67

Cisplatin 61,80 25,44 10,62 2,69

Ekstrak Metanol

kualitatif, namun dapat dijadikan uji semikuantitatif, dengan pengambilan tiga lapang pandang dari tiap preparat. Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader.

Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan dengan cisplatin konsentrasi IC50 dan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50

mampu menekan ekspresi dari Bcl-2 (Gambar 4). Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 pada kelompok perlakuan dengan cisplatin adalah bernilai 0 (sangat kuat). Pada kelompok perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary level ekspresi Bcl-2 adalah 1+ (kuat) (Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary dalam induksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa salah satunya diperantarai oleh penekanan ekspresi protein Bcl-2. Perhitungan ekspresi Bcl-2 dalam uji imunositokimia dalam penelitian ini hanya bersifat semikuantitatif, oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan metode lain untuk mendeteksi adanya suatu protein Bcl-2 secara kuantitatif.

Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker serviks HeLa. Sel HeLa (2 x 10⁵/mL) ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL). (D) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). Pengamatan dilakukan di bawah

mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Keterangan : sel tidak mengekspresikan Bcl-2, sel mengekspresikan Bcl-2.

Apoptosis yang terjadi akibat aktivasi caspase-3 tidak hanya diperantarai oleh penghambatan protein Bcl-2. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Yim dkk. (2006) menyatakan bahwa dengan meningkatkan ekspresi Fas, akan mengaktivasi caspase-8 dan

A B

pada sel kanker serviks HeLa. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan ekspresi Bcl-2.

Tabel II. Perhitungan Ekspresi Bcl-2

^{Lapang Pandang}

Ekspresi

Bcl-2 ^Level Kontrol Sel Tanpa

Antibodi 1 (n = 90) 0 (0%) 0 2 (n = 85) 0 (0%) 0 3 (n = 107) 0 (0%) 0 Kontrol Sel dengan Antibodi 1 (n = 105) 105 (100%) 4+ 2 (n = 97) 97 (100%) 4+ 3 (n = 106) 106 (100%) 4+ Cisplatin 1 (n = 128) 1 (0,78%) 0 2 (n = 125) 3 (2,4%) 0 3 (n = 107) 0 (0%) 0 Ekstrak Metanol Daun Rosemary 1 (n = 271) 23 (8,49%) 1+ 2 (n = 257) 31 (12,06%) 1+ 3 (n = 296) 23 (7,77%) 1+ KESIMPULAN

Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak metanol daun rosemary memiliki efek sitotoksik lemah terhadap sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar320µg/mL, namun tetap memiliki potensi sebagai agen kemopreventif. Jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks.

Saran untuk penelitian berikutnya yaitu dilakukan identifikasi senyawa aktif dalam ekstrak metanol daun rosemary, mengetahui efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal, melakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis sebelum 24 jam, mendeteksi adanya suatu ekspresi protein Bcl-2 secara kuantitatif, serta mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan ekspresi Bcl-2.

Abe, F., Yamauchi, T., Nagao, T., Kinjo, J., Okabe, H., Higo, H., dan Akahane, H., 2002. Ursolic acid as a Trypanocidal Constituent in Rosemary. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25 (11), 1485–1487.

American Cancer Society, 2015. Treatment Options for Cervical Cancer, by Stage,

http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguidecervicalcancer-treating-targeted-therapy diakses pada tanggal 1 April 2016.

Anggraeni, C. D., 2015. Aktivitas Sitotoksik Ekstrak metanolik Daun Rosemary (Rosmarimus officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor Estrogen-α ERα . Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Cancer Chemoprevention Research Center^a, 2009. Prosedur Tetap: Pengamatan Ekspresi Protein dengan Metode Immunositokimia, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta,

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Center^b, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel untuk Flowcytometry, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Center^c, 2009. Prosedur Tetap: Uji Sitotoksik Metode MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Center^d, 2009. Prosedur Tetap: Panen Sel, Unversitas

Gajah Mada, Yogyakarta,

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Capes, D., Theodosopoulos G., & Atkin, I., 2010. Check Your Cultures! A List of Cross-Contaminated or Misidentified Cell Lines. Int J Cancer, 127 (1): 1–8.

Dasari, S., dan Bernard, P., 2014. Cisplatin in cancer therapy :

Molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology, 1–15.

Demoy, M., Minko, T., & Kopeckova, P. 2000. Time- and concentration-dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymer-bound doxorubicin in human ovarian carcinoma cells, 69, 185–196.

Alternative Medicine, 14, 77.

Guimaraes, M.C.M., dkk., 2005. Immunohistochemical Expression of p16^INK4a and bcl-2 According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4), 509–16.

Goodwin, E.C., and DiMaio, D., 2000. Repression of Human Papillomavirus Oncogenes in Hela Cervical Carcinoma Cells Causes the Orderly Reactivation of Dormant Tumor Suppressor Pathways. Biochemistry, Vol.97, no.23.

Hanahan, D., dan Weinberg, R.A., 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell., 100, 57-70. Hemaiswarya, S., dan Doble, M., 2013. Combination of Phenylpropanoids with

5-Fluorouracil as Anti-Cancer Agents against Human Cervical Cancer (HeLa) Cell Line. Phytomedicine, 20(2), 151–58.

Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., & Mittar, D, 2011. Detection of Apoptosis Using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerse^TM System. BD Biosciences, 1–12.

Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015. Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53-dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–

1502.

Ibeanau, O.A., 2011. Molecular Pathogenesis of Cervical Cancer. Cancer Biology & Therapy,11(3), 295- 306.

International Agency for Research on Cancer WHO (IARC), 2015. Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam www.http://globocan.iarc.fr/, diakses tanggal 5 April 2016.

Leisching, G., Loss, B., Botha, M., Engelbrecht, A., 2015. Bcl-2 Confers Survival in Cisplatin Treated Cervical Cancer Cells: Circumventing Cisplatin Dose-Dependent Toxicity and Resistance. J Transl Med, 13, 328.

Machana, S., dkk., 2011. Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line. Chin Med, 6(1), 1-8.

Nobakht, G. M., Kadir, M. a, Stanslas, J., & Charng, C. W., 2014. Cytotoxic effect of Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–1024.

Nurzijah, I., Putri, D. D. P., Rivanti, E., & Meiyanto, E., 2012. Secang (Caesalpinia sappan L.) Heartwood Ethanolic Extract Shows Activity as Doxorubicin Co-

Riss, T.L., Richard, A.M., Andrew, L.N., Helene, A.B., Tracy, J.W., Lisa, M., 2013, Assay

Guidance Manual: Cell Viability Assays,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/, diakses pada tanggal 8 April 2016.

Setiawati, A., Immanuel, H., & Utami, M. T., 2016. The inhibition of Typhonium flagelliforme Lodd. Blume Leaf Extract on COX-2 Expression of WiDr Colon Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6(3), 251–255.

Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Cancer Science Therapy, S3:e001.

Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilsson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., dkk., 2016, Immunocytochemistry, http://www.proteinatlas.org/learn/method/, immunocytochemistry, diakses pada tanggal 22 April 2016.

Vermes, I., Clemens, H., Helga, S., dan Chris, R., 1995, A Novel Assay for Apoptosis Flow Cytrometric Detection of Phospatidylserine Expression on early Apoptic Cells Using Flourescein Labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 184: 39-51.

Wang, X., dkk., 2013. Inhibitory effect of oleanolic acid on hepatocellular carcinoma via ERK–p53-mediated cell cycle arrest and mitochondrial-dependent apoptosis.

Carcinogenesis, 34(6)1323-1330.

Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., & Murphy, B. M., 2012. Targeting the Anti-apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer. Experimental Oncology, 34(3), 192–199.

Xu, T., dkk., 2014. Proteomic Investigation into Betulinic Acid-Induced Apoptosis of Human Cervical Cancer HeLa Cells. PLoS ONE, 9(8), 1–11.

Yesil-Celiktas, O., SevimLi, C., Bedir, E., & Vardar-Sukan, F., 2010. Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carnosic acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines. Plant Foods for Human Nutrition, 65(2), 158–163. Yim, E. K., dkk., 2006. Antiproliferative and Antiviral Mechanisms of Ursolic Acid and

Dexamethasone in Cervical Carcinoma Cell Lines. International Journal of Gynecological Cancer, 16(6), 2023–2031.

Zhang, H., Ph, D., Sun, X., & Ph, D., 2002. Overexpression of Cyclooxygenase-2 Correlates With Advanced Stages of Colorectal Cancer. Am J Gastroenterol, 97(4), 1–5.

Gambar 5. Tanamanan rosemary dan serbuk daun rosemary

Gambar 6. Ekstraksi dengan refluks dan pemekatan dengan vaccum rotary evaporator

Ekstrak metanol daun rosemary

10 mg + 100 µL DMSO = 100.000 µg/mL Intermediet = 2000 µg/mL (16 µL bulk + 784 µL /MK) Konsentrasi Sampel MK 1000 µg/mL (C1) 400 µL intermediet 400 µL 500 µg/mL (C2) 400 µL C1 400 µL 250 µg/mL (C3) 400 µL C2 400 µL 125 µg/mL (C4) 400 µL C3 400 µL 62,5 µg/mL (C5) 400 µL C4 400 µL 31,25 µg/mL (C6) 400 µL C5 400 µL 15,625 µg/mL (C7) 400 µL C6 400 µL Cisplatin 10 mg/10 mL = 1000 µg/mL Konsentrasi Sampel MK 156,25 µg/mL (C1) 125 µL 675 µL 78 µg/mL (C2) 400 µL C1 400 µL 39 µg/mL (C3) 400 µL C2 400 µL 20 µg/mL (C4) 400 µL C3 400 µL 10 µg/mL (C5) 400 µL C4 400 µL 5 µg/mL (C6) 400 µL C5 400 µL 2,5 µg/mL (C7) 400 µL C6 400 µL

Tabel III.Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Cisplatin Konsentrasi Cisplatin (µg/mL) Viabilitas sel (%) SD 1 2 3 Rata-rata 0 100 100 100 100 0 5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053 10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357 20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,62 39 31,159 31,834 37,402 33,465 3,426 78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979

Tabel IV.Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Rosemary Konsentrasi ekstrak (µg/mL) Viabilitas sel (%) _SD 1 2 3 Rata-rata 0 100 100 100 100 0 15,63 90,757 92,167 91,854 91,593 0,74 31,25 86,527 89,191 82,924 86,214 3,145 62,5 81,044 83,238 79,948 81,410 1,675 125 76,345 81,514 75,561 77,807 3,234 250 55,352 59,269 61,149 58,590 2,958 500 32,637 22,454 24,334 26,475 5,419

File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000

Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000

Quad % Gated % Total

UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 R2 R4 R1

File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000

Re gion % Gated % Total R1 61.80 61.80 R2 25.44 25.44 R3 10.62 10.62

R4 2.69 2.69

File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000

Quad % Gated % Total

UL 2.54 2.54 UR 10.54 10.54 LL 61.02 61.02 LR 25.91 25.91 R2 R4 R1

File: rosemary HeLa.003 Gate: No G ate

Tota l Even ts: 20000

Re gion % Gated % Total R1 54.09 54.09 R2 11.82 11.82 R3 15.20 15.20 R4 19.55 19.55 File: rosemary HeLa.003 Gate: No G ate

Tota l Even ts: 20000

Quad % Gated % Total UL 18.71 18.71 UR 15.10 15.10 LL 53.87 53.87 LR 12.31 12.31 R2 R4 R1

27 A. Kontrol sel tanpa antibodi

B. Kontrol sel dengan antibodi

Penulis skripsi dengan judul “Ekstrak Metanolik Daun Rosemary

(Rosmarinus officinalis L.) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) melalui Regulasi Bcl-2” memiliki nama lengkap Lela Francisca Adi Liana. Anak pertama dari pasangan Bapak Risman Adi dan Ibu Dwi Istiyani. Penulis lahir di Jepara, 4 Maret 1995. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di TK Ester 1 Bondo (2000-2001). Pendidikan dilanjutkan ke SD Negeri 4 Bondo (2001-2007), setelah itu dilanjutkan ke SMP Negeri 2 Jepara (2007-2010), pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Jepara (2010-2013). Kemudian pendidikan dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam keorganisasian dan kepanitian di dalam kampus, antara lain menjadi anggota seksi pubdekdok Pharmacy Performance Road to School (2014), anggota Media Farmasi (2015), anggota seksi acara Donor Darah JMKI (2015), anggota seksi pubdekdok Sidang Terbuka Pengambilan Sumpah Apoteker (2016). Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler (2015 dan 2016).

Dalam dokumen Ekstrak metanolik daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi Bcl-2. (Halaman 24-46)