Pembentukan Kalus
Transformasi genetik jarak pagar dilakukan dengan menggunakan potongan kotiledon (Gambar 7) yang diperoleh dari hasil pengecambahan biji selama 2 minggu. Penggunaan kotiledon sebagai sumber eksplan bertujuan untuk mempermudah proses pengumpulan eksplan untuk transformasi dalam waktu yang singkat serta peningkatan efisiensi regenerasi dan transformasi. Kotiledon merupakan bakal daun yang terbentuk pada embrio, dapat berfungsi sebagai organ cadangan makanan bagi sebagian kelompok tumbuhan dan organ fotosintetik pertama. Li et al. (2006) menyatakan bahwa kotiledon yang diperoleh dari pengecambahan biji merupakan eksplan yang lebih baik untuk transformasi genetik jarak pagar dengan perantara Agrobacterium tumefaciens dibandingkan dengan bagian hipokotil, epikotil dan daun. Beberapa penelitian transformasi genetik dengan perantara A. tumefaciens juga menggunakan kotiledon sebagai eksplan (Li et al. 2008; Mazumdar et al. 2010; Pan et al. 2010; Kajikawa et al.
2012). Menurut Kalimuthu et al. (2007), penggunaan kotiledon sebagai sumber eksplan dapat meningkatkan efisiensi regenerasi karena kotiledon berkembang secara embriogenesis somatik. Embriogenesis somatik merupakan perkembangan embrio lengkap dari sel vegetatif dan menjanjikan untuk perbanyakan dalam waktu cepat pada tanaman pertanian (Zulkarnain 2009).
Gambar 7 Kotiledon dari kecambah jarak pagar. A= umur 8 hari; B= umur 14 hari; C = potongan kotiledon, bar = 1 cm.
Setelah diinokulasi dengan bakteri A. tumefaciens, eksplan ditanam pada media ko-kultivasi selama 3 hari. Setelah 3 hari, eksplan dicuci dengan air steril yang mengandung 200 mg l-1 cefotaxim dan selanjutnya dipindahkan pada media penginduksi kalus. Cefotaxim tidak hanya digunakan untuk mencuci eksplan, tetapi juga ditambahkan ke dalam media dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 100 mg l-1. Penggunaan cefotaxim bertujuan untuk mematikan A. tumefaciens (Valvekens et al. 1988) sehingga pertumbuhan dan regenerasi tanaman jarak tidak terganggu. Konsentrasi cefotaxim yang terlalu tinggi dapat
mengganggu pertumbuhan kalus dan regenerasi eksplan. Oleh sebab itu konsentrasi cefotaxim pada media lebih rendah dibandingkan pada saat pencucian eksplan. Eksplan jarak pagar yang diinokulasi A. tumefaciens yang ditanam pada media dengan konsentrasi cefotaxim 500 dan 300 mg l-1 dapat menghasilkan kalus namun warnanya menjadi hijau kecoklatan yang akhirnya mengalami kematian. Eksplan yang ditanam pada media dengan konsentrasi cefotaxim 100 mg l-1 menghasilkan kalus dengan warna eksplan tetap hijau segar (Gambar 8). Penggunaan cefotaxim dengan konsentrasi 100 mg l-1 sudah cukup untuk menekan pertumbuhan bakteri. Pada penelitian ini, konsentrasi cefotaxim yang digunakan pada media adalah sebesar 100 mg l-1 yang sangat berbeda dengan penelitian-penelitian sebelumnya, yaitu 300 mg l-1 (Zong et al. 2010) dan 500 mg l-1 (Li et al. 2008; Sulistyaningsih 2012).
Gambar 8 Pembentukan kalus dari eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens pada media dengan berbagai konsentrasi cefotaxim. A = 500 mg l-1; B = 300 mg l-1; C = 100 mg l-1 , bar = 1 cm.
Kalus dari eksplan yang diinokulasi A. tumefaciens berbeda dengan kalus dari eksplan yang tidak diinokulasi A. tumefaciens. Kalus dari eksplan yang tidak diinokulasi A. tumefaciens mulai muncul pada hari kesepuluh sedangkan eksplan yang diinokulasi A. tumefaciens menghasilkan kalus pada hari ketiga belas dengan persentase jumlah eksplan yang membentuk kalus masing-masing sebesar 90% dan 77% (Tabel 2). Kalus dari eksplan yang tidak diinokulasi A. tumefaciens
berwarna putih menutupi seluruh tepi eksplan. Kalus membesar 2-3 kali dari ukuran awal eksplan dan bagian tengah eksplan masih tetap berwarna hijau. Kalus dari eksplan yang diinokulasi berwarna putih hampir diseluruh tepi eksplan namun bagian tengah eksplan berwarna hijau kekuningan. Kalus membesar 1-2 kali dari ukuran awal eksplan dan sedikit mengalami pencoklatan (browning) (Gambar 9).
Perbedaan perkembangan kalus antara eksplan yang tidak diinokulasi dan diinokulasi ini diduga akibat produksi senyawa fenol oleh eksplan yang terinfeksi
A. tumefaciens sebagai bentuk pertahanan. Sel-sel tanaman akan menghasilkan senyawa fenol sebagai bentuk pertahanan terhadap patogen, untuk proses pertumbuhan dan reproduksi (Lattanzio et al. 2006). Pada permukaan eksplan yang terluka dan terinfeksi terjadi peningkatan kandungan senyawa fenol untuk
mengurangi kerusakan sel akibat luka (Huque et al. 2013). Senyawa fenol ini selanjutnya mengalami proses oksidatif mengakibatkan terbentuknya kuinon yang beracun terhadap jaringan tanaman dan terjadi perubahan warna menjadi kecoklatan (Abohatem et al. 2011). Proses perubahan warna kecoklatan (browning) pada kalus dapat disebabkan aktivitas enzim PPO (polyphenol oxidase). PPO merupakan katalis dalam oksidasi yang dapat mengakibatkan terjadinya bentuk pigmen coklat. PPO diperkirakan terletak pada plastid dan terpisah dari senyawa fenol yang terdapat di vakuola. Ketika jaringan tanaman terluka akibat pemotongan maupun serangan parasit, pemisahan kedua senyawa tersebut hilang sehingga terjadi kontak yang menyebabkan aktifnya PPO (Vaughn and Duke 1984). Menurut He et al. (2009) pencoklatan pada kalus dapat menyebabkan penurunan kemampuan beregenerasi, pertumbuhan yang rendah dan bahkan menyebabkan kematian.
Tabel 2 Perkembangan kalus eksplan jarak pagar Perlakuan
eksplan
Jumlah eksplan yang ditanam
Jumlah eksplan yang membentuk kalus (%) Waktu kemunculan Kalus (hari) Tidak Diinokulasi 88 90 10 Diinokulasi 127 77 13
Gambar 9 Perkembangan eksplan J. curcas pada media CI. A-B = eksplan yang sebelumnya tidak diinokulasi A. tumefaciens di media non selektif; C-D = eksplan yang sebelumnya diinokulasi dengan A. tumefaciens; A = 0 hari; B = kalus pada hari ke-13; C = 0 hari; D = kalus pada hari ke 16 ,bar = 1 cm.
Regenerasi Tunas
Setelah satu minggu di media induksi tunas (SIM), kalus yang berasal dari eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens (non-transgenik) pada media non higromisin mulai berubah warna menjadi warna putih kehijauan (Gambar 10). Begitu juga dengan kalus yang berasal dari eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens mengalami perubahan warna menjadi warna putih kehijauan di media SIM yang mengandung 1.5 mg l-1 higromisin. Eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens dan eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens mulai menghasilkan tonjolan-tonjolan calon tunas berturut-turut setelah hari kesepuluh dan hari keempat belas (Gambar 10). Tonjolan calon tunas mulai berkembang menjadi tunas pada hari keempat belas pada eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens. Hal yang berbeda diperoleh pada eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens. Tonjolan calon tunas baru mulai berkembang menjadi tunas semenjak hari kedelapan belas. Tunas lengkap diperoleh setelah eksplan berada dimedia pemanjangan tunas selama 3 hingga 5 minggu dan selanjutnya disebut tunas transgenik putatif (Gambar 11).
Perkembangan regenerasi eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens
lebih lama daripada yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens. Hal ini kemungkinan dapat disebabkan akibat adanya penambahan antibiotik pada media, yaitu higromisin dan cefotaxime yang dapat menghambat pertumbuhan eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens. Nauerby et al. (1997) mengungkapkan bila penggunaan 500 mg l-1 cefotaxime tidak mempengaruhi perkembangan tunas tembakau namun dapat menghambat regenerasi eksplan hingga 81% setelah 2 bulan kultur.
Gambar 10 Perkembangan kalus pada media induksi tunas (SIM); A - C = Kalus dari eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens di SIM yang tidak mengandung higromisin; D – F = Kalus dari eksplan yang diinokulasi dengan A. tumefaciens diSIM yang
mengandung 1.5 mg l-1 higromisin; A dan D = hari ke-1; B dan E = hari ke-7; C dan F = tonjolan calon tunas , bar = 1 cm.
Sebanyak 47 eksplan dari 60 eksplan non-transgenik awal yang ditanam pada SIM yang tidak mengandung higromisin berhasil membentuk tunas, dengan jumlah tunas sebanyak 99 tunas. Hal ini menunjukkan bahwa efisiensi regenerasi dari kalus untuk menjadi tunas non transgenik adalah sebesar 78.3% (Tabel 3). Kumar et al. (2011) memperoleh efisiensi regenerasi sebesar 81.07% dari eksplan kotiledon. Varshney and Johnson (2010) menggunakan embrio jarak pagar yang belum dewasa sebagai sumber eksplan dan memperoleh efisiensi regenerasi sebesar 90%. Perbedaan efisiensi regenerasi ini dapat disebabkan karena perbedaan genotipe jarak pagar dan media tumbuhnya.
Gambar 11 Perkembangan tunas pada media pemanjangan tunas (SEM); A-B = ditanam pada media SEM yang tidak mengandung higromisin; C- E = ditanam pada SEM yang mengandung 1.5 mg l-1 higromisin; A = Tunas non-transgenik dari eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens pada hari ke-14; B = Tunas non-transgenik pada hari ke-18; C = Tunas eksplan transgenik putatif mulai muncul pada hari ke-18; D-E = Tunas lengkap eksplan transgenik putatif, bar = 1 cm.
Kalus transgenik putatif yang mampu mempertahankan warna kehijauan hingga muncul tonjolan tunas pada media seleksi pertama selanjutnya disubkultur pada media seleksi kedua dengan konsentrasi higromisin sebesar 2.5 mg l-1. Tunas yang bertahan hidup pada seleksi kedua selanjutnya ditanam pada media pemanjangan tunas. Di media seleksi kedua, 25 dari 98 kalus transgenik putatif dapat bertahan hidup dan menghasilkan 40 tunas transgenik putatif (Tabel 3).
Tunas non-transgenik yang sebelumnya diinokulasi dengan A. tumefaciens
ditanam pada media yang mengandung higromisin dan mulai memperlihatkan respon pada hari keenam, yaitu daun mengalami perubahan warna menjadi putih memucat, kecoklatan hingga akhirnya mengalami kematian. Eksplan yang sebelumnya diinokulasi dengan A. tumefaciens mengalami kematian sebanyak
32.6% pada seleksi pertama. Dari eksplan yang tumbuh di media seleksi pertama, 62% mengalami kematian pada seleksi kedua (Tabel 3). Kumar et al. (2010) memperoleh hasil bahwa 60% tunas mengalami kematian di media yang
mengandung higromisin dengan konsentrasi 2.5 g ml-1
. Hal ini sangat berbeda dengan Li et al. (2008) yang menyatakan bahwa eksplan jarak pagar masih bisa bertahan dan menghasilkan tunas pada media yang mengandung 5 mg l-1 higromisin. Eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens yang ditanam pada media seleksi juga mengalami kematian. Eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens mulai memucat semenjak hari ketiga dan terjadi pencoklatan pada beberapa daerah hingga akhirnya mati pada hari keenam. Seluruh eksplan yang tidak diinokulasi dengan A. tumefaciens yang ditanam pada media yang mengandung higromisin, baik 1.5 mg l-1 dan 2.5 mg l-1, mengalami kematian. Hal ini memperlihatkan bila tanaman jarak pagar sangat sensitif terhadap antibiotik higromisin (Tabel 3).
Tabel 3 Perkembangan regenerasi eksplan jarak pagar
Perlakuan eksplan* Media** ∑ Awal Eks plan ∑ eks plan ber tunas ∑ tun as ∑ tunas / eks plan Seleksi I (1.5 mg l-1 higromisin) Seleksi II (2.5 mg l-1 higromisin) Hidup Mati Hidup Mati A C 98 25 (25.5%) 40 1.6 66 (67.4%) 32 (32.6%) 25 (37.8%) 41 (62.1%) B C 20 - 0 (0%) 20 (100%) - - B D 60 47 (78.3%) 99 2.1 - - 47 (78.3%) - * Dengan A. tumefaciens; A = diinokulasi; B = tidak diinokulasi
** Jenis media; C = media selektif (media yang mengandung antibiotik higromisin dan cefotaxime); D = media non selektif
Rendahnya jumlah eksplan yang diinokulasi A. tumefaciens yang mampu bertahan pada media seleksi kedua disebabkan adanya antibiotik higromisin sebagai agen seleksi. Agen seleksi tunas transgenik putatif harus beracun bagi sel tanaman sehingga dapat membunuh sel-sel tanaman yang tidak ditransformasi. Adanya gen penanda seleksi, menyebabkan sel yang ditransformasi dapat bertahan hidup pada media yang mengandung agen seleksi. Penggunaan higromisin sebagai agen penyeleksi eksplan transgenik putatif didasarkan pada gen penanda seleksi yang terdapat pada plasmid yang diintroduksikan kedalam tanaman, yaitu gen hpt (hygromycin phosphotransferase). Senyawa higromisin merupakan antibiotik aminocyclitol yang dapat mengganggu sintesis protein dan dapat mematikan sel yang sensitif lebih cepat daripada kanamisin (Chawla 2002). Oleh sebab itu, pada eksplan yang tidak diinokulasi A. tumefaciens dan eksplan transgenik palsu yang tidak mengandung gen hpt akan mengalami kematian. Karena gen hpt difusikan dengan gen MaMt2 dengan jarak yang pendek, maka kedua gen tersebut dapat menyisip di genom J. curcas bersama-sama. Oleh sebab itu, tunas yang muncul dari proses regenerasi di media seleksi selain mengandung gen hpt diharapkan mengandung gen MaMt2.
Analisis Molekular
Tunas transgenik putatif yang diperoleh dari eksplan yang diinokulasi A. tumefaciens diisolasi untuk memperoleh DNA genom. Begitu juga dengan tunas non-transgenik yang tidak diinokulasi A. tumefaciens. Tanaman jarak pagar merupakan tanaman dengan kandungan senyawa fenol dan saponin yang cukup tinggi. Oleh sebab itu, ekstraksi DNA genom dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Doyle JJ and Doyle JL 1990) yang dimodifikasi, yaitu 2% PVP ditambahkan ke buffer ekstraksi serta pasir kuarsa untuk penggerusan. PVP ditambah ke buffer ekstraksi untuk mengurangi senyawa polifenol, yaitu senyawa kontaminan dalam isolasi DNA yang dapat menyebabkan larutan sampel menjadi kental berwarna coklat hingga menghitam. DNA seperti ini tidak dapat dipotong oleh enzim restriksi endonuklease dan tidak dapat diamplifikasi dengan PCR. PVP membentuk kompleks ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol dan selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA dengan sentrifugasi (Lodhi et al. 1994). Penggunaan pasir kuarsa dalam penggerusan bertujuan untuk memudahkan proses penggerusan sampel tunas yang memiliki ukuran sangat kecil.
Analisis kemurnian dan konsentrasi DNA genom dilakukan dengan mengukur kerapatan optik dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Rasio OD260/OD280 DNA genom yang diperoleh berkisar antara 1.8 sampai 2.0. Hal ini menunjukkan bahwa DNA genom yang diekstraksi sudah cukup murni dari berbagai kontaminan. Pengukuran konsentrasi DNA
genom dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm memperlihatkan rendemen isolasi DNA yang cukup tinggi dan optimal (Tabel 4).
Integritas DNA genom dianalisis dengan melakukan elektroforesis di gel agarose. Hasil elektroforesis memperlihatkan pita yang merupakan DNA genom jarak pagar (Gambar 12A). DNA genom yang diperoleh baik dari tanaman transgenik maupun non-transgenik selanjutnya digunakan sebagai cetakan pada analisis PCR dengan menggunakan primer actin yang menghasilkan amplikon yang berukuran 122 pb (Gambar 12B). Hal ini menunjukkan bahwa isolasi DNA telah menghasilkan DNA dengan kualitas yang baik.
Daerah DNA-T yang memiliki pembatas kanan (right border = RB) dan pembatas kiri (left border = LB) yang terdapat dalam plasmid akan diintegrasikan. Pembatas kanan memiliki peran yang lebih penting dalam hal transfer daerah T- DNA daripada pembatas kiri. Karena pada daerah pembatas kanan terdapat protein VirD2 yang berperan dalam pemotongan DNA-T (Gelvin 2003) sehingga diintegrasikan ke dalam genom tanaman lebih dahulu daripada DNA lain. Hal ini menjadi salah satu hal yang perlu dipertimbangkan ketika menempatkan gen target dan gen penanda seleksi dalam merancang vektor ekspresi. Gen target sebaiknya berada dekat dengan daerah pembatas kanan, sedangkan gen penanda seleksi berada dekat dengan daerah pembatas kiri, sehingga kemungkinan gen target terintegrasi lebih dulu ke dalam genom tanaman lebih besar daripada gen penanda seleksi.
Tabel 4 Hasil isolasi DNA genom
DNA genom
Absorban pada Kemurnian DNA Konsentrasi DNA ( g ml-1 ) 260 280 Nt * 0.208 0.106 1.96 2432.2 Jt**1 0.354 0.190 1.86 2478 Jt2 0.220 0.114 1.92 1540 Jt3 0.185 0.098 1.88 3237.5 Jt4 0.147 0.078 1.88 2572.5 Jt5 0.109 0.057 1.91 1907.5 Jt6 0.057 0.029 1.96 664.9 Jt7 0.087 0.048 1.81 609 Jt8 0.044 0.024 1.83 770 Jt9 0.143 0.079 1.81 1001
* Nt = non-transgenik = DNA tunas non-diinokulasi dengan A. tumefaciens
** Jt = Jatropha transgenik putatif = DNA tunas diinokulasi dengan A. tumefaciens (tunas transgenik putatif)
Gambar 12 Hasil kualifikasi DNA genom jarak pagar; A = hasil elektroforesis DNA genom; B = hasil analisis PCR dengan primer JcACTF1-
JcACTR1; M = penanda lambda 5 l; nt = DNA genom tunas
non-transgenik; jt1 – jt9 = tunas transgenik putatif.
Dari 98 eksplan yang diinokulasi A. tumefaciens hanya 25 kalus yang mampu bertahan dan membentuk tunas pada seleksi kedua. Dari duapuluh lima tunas transgenik putatif, lima belas tunas diambil secara acak untuk dianalisis keberadaan gen MaMt2 melalui PCR dengan primer spesifik UbiQF dan NosTR serta kombinasi primer SMt2F dan NosTR. Penggunaan kedua primer spesifik
tersebut berturut-turut akan menghasilkan DNA dengan ukuran 1160 pb dan 526 pb. Analisis PCR dengan primer UbiQF dan NosTR terhadap lima belas tunas transgenik putatif menunjukkan bahwa tujuh tunas menghasilkan amplikon sesuai dengan yang diharapkan (Gambar 13). Analisis PCR dengan primer SMT2F dan NosTR terhadap tujuh tunas tersebut menunjukkan bahwa tiga tanaman menghasilkan amplikon sesuai yang diharapkan (Gambar 14). PCR terhadap DNA tunas dari tanaman non transgenik tidak menghasilkan amplikon. Hasil ini menunjukkan bahwa ketiga tunas tersebut adalah transgenik yang membawa transgen MaMt2.
Efisiensi transformasi melalui perantara A. tumefaciens dapat ditingkatkan dengan memodifikasi metode transformasi seperti umur eksplan kotiledon yang digunakan, waktu inkubasi eksplan pada bakteri, strain dan kepadatan bakteri, waktu eksplan pada media ko-kultivasi serta kultivar jarak pagar yang digunakan (Mazumdar et al. 2010; Zong et al. 2010). Joshi et al. (2011) memperoleh efisiensi transformasi sebesar 44.7% dengan menggunakan metode penembakan partikel gen. Penggunaan metode penembakan partikel gen dalam tranformasi genetik masih relatif jarang dilakukan terkait dengan biaya yang diperlukan jauh lebih besar bila dibandingkan dengan transformasi melalui A. tumefaciens.
Gambar 13 Hasil analisis PCR dengan primer spesifik UbiQF-NosTR; M = penanda 1 kb; nt = tunas non-transgenik (tipe liar); K+ = pIG6-MaMt2 (kontrol positif); jt1, jt2, jt3, jt4, jt5, jt6, jt9 = tunas transgenik putatif.
Gambar 14 Hasil analisis PCR dengan primer spesifik SMt2F dan NosTR. M = penanda 1 kb; K+ = pIG6-MaMt2 (kontrol positif); nt = tunas non- transgenik (tipe liar); jt1, jt4, jt6 = tunas transgenik putatif.