Isolasi DNA Total Tumbuhan
Isolasi DNA total merupakan tahap awal dari pembuatan pustaka genom. DNA dipisahkan dari bahan-bahan lain yang ada dalam sel. DNA total yang diperlukan untuk pembuatan genom, harus bagus dalam kualitas maupun kuantitas. DNA harus utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil. Selain utuh, DNA yang diperlukan juga harus mempunyai konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi yang tinggi ini dapat dicapai dengan cara pemekatan atau dengan mengurangi jumlah pelarut. Konsentrasi DNA yang rendah dapat dipekatkan dengan pengendapan kembali menggunakan isopropanol sebanyak 0.7 x volume. Pengendapan kadang dapat menurunkan kualitas DNA.
Tingkat kemurnian DNA dari kontaminan protein diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280nm. DNA yang
digunakan harus murni dengan nilai 260/280 > 1.75 (Promega 1996).
Sementara hasil perhitungan 260/280 nm dari DNA tumbuhan yang telah
diisolasi adalah sebesar 1.2 yang berarti bahwa DNA tersebut kurang murni, dan masih terdapat adanya kontaminan yang berupa protein. Selain protein, DNA
M. malabathricum banyak terkontaminasi oleh polisakarida yang cukup tinggi.
Adanya kontaminan polisakarida menyebabkan rendemen isolasi DNA menjadi rendah. Usaha yang telah dilakukan dalam mengurangi kontaminan antara lain: dengan penambahan PVP (poly vinil pirolidon) sebanyak 2 % pada saat isolasi, dan isolasi dengan DNA mini kit yang menggunakan saringan berbahan resin.
Pemotongan DNA Tumbuhan secara Parsial
Hasil pemotongan 8 μg DNA M. malabathricum L. secara parsial meng-gunakan enzim restriksi Sau3A I pada konsentrasi 0.01 hingga 0.04 unit untuk setiap g DNA menunjukkan bahwa pemotongan dengan 0.01 unit menghasilkan potongan yang berukuran besar (Gambar 3). Konstruksi pustaka genom memerlukan DNA yang cukup banyak, sehingga untuk mendapatkan potongan DNA besar dalam jumlah banyak dilakukan pemotongan dengan skala besar. Pemotongan skala besar menggunakan 20 μg DNA total yang dipotong secara parsial dengan enzim restriksi Sau3A I pada konsentrasi 0.01 unit tiap µg DNA,
19 menghasilkan fragmen DNA yang sebagian besar terdapat pada ukuran 2 - 15 kpb (Gambar 4).
Gambar 3 Hasil pemotongan parsial terhadap 8 μg DNA M. malaba-thricum menggunakan enzim restriksi Sau3A I dengan berbagai konsentrasi pada suhu 37oC selama 30 menit. M=marker, 1=0.010 U, 2=0.015 U 3=0.020 U, 4=0.040 U. Gambar 4 Hasil pemotongan parsial terhadap 20 μg DNA M. Malaba-thricum menggunakan enzim restriksi Sau3A I dengan kon-sentrasi 0.010 U pada suhu 37oC selama 30 menit. M= marker, 1= fragmen DNA hasil pemotongan.
Enzim Sau3A I mengenali situs spesifik NGATC yang memotong antara N dan G sehingga pemotongan dengan Sau3A I menghasilkan fragmen yang berujung kohesif dengan nukleotida GATC. Setelah disisipi dengan nukleotida dATP dan dGTP menghasilkan ujung 5’GA3’ yang tidak dapat berpasangan dengan ujung 3’AG5’ dari fragmen DNA yang lain sehingga penyambungan kembali di antara fragmen dapat dicegah (Gambar 5) 4000 - pb M 1 8000- 1000- 3000- 400015000 1000 2000 -3000 - 5000 15000 -pb M 1 2 3 4
20
Gambar 5 Fill in dATP dan dGTP pada fragmen DNA M. malabathricum hasil pemotongan parsial dengan Sau3A I.
Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor fage
Enzim restriksi Xho I mengenali situs spesifik 5’CTCGAG3’ yang
memotong antara C dan T sehingga vektor fage yang dipotong dengan enzim
restriksi Xho I menghasilkan fragmen DNA menggantung yang menyisakan basa nitrogen 5’TCGA3’di ujung yang satu dan 3’AGCT5’ di ujung lainnya. Kedua ujung tersebut dapat berpasangan kembali bila tidak dicegah. Penambahan dTTP dan dCTP menyisakan 5’TC3’di satu ujung dan 3’CT5’ di ujung lain yang menyebabkan kedua ujung tersebut tidak dapat berpasangan secara`komplementer (Gambar 6)
Gambar 6 Fill in dTTP dan dCTP terhadap vektor λ BlueSTAR-1 yang dipotong XhoI.
Potong dg Sau3A I
Potong dg Xho I
Tambah dTTP & dCTP
Kedua lengan dan pengisi tidak cocok C TCGAG
GAGCT C Pengisi lac C TCGAG GAGCT C
CTC TCGAG
GAGCT CTC Pengisi lac CTC TCGAG GAGCT CTC
21 Setelah vektor fage dicampur dengan potongan DNA M. malabathricum dalam
satu tabung, maka potongan DNA fage berujung basa 5’TC3’ akan
berpasangan dengan basa 3’AG5’ yang terdapat pada ujung potongan DNA M.
malabathricum. Pasangan kedua fragmen DNA tersebut selanjutnya diligasi oleh
DNA T4 ligase (Gambar 7).
Gambar 7 Penyisipan fragmen DNA M. malabathricum ke dalam vektor λ BlueSTAR-1.
Penyisipan 0.5 g DNA M. malabathricum ke dalam vektor fage dengan
perbandingan 2.9 : 1 berdasarkan molaritas, menghasilkan DNA rekombinan.
Setelah dikemas dalam mantel protein, fage rekombinan ini ditransveksikan ke
dalam E coli galur ER1647. Dalam media yang mengandung IPTG dan X-gal, fage rekombinan membentuk plak bening yang terdapat di antara koloni biru (non rekombinan) (Gambar 8). Konstruksi pustaka genom dilakukan dua kali.
nonrekombinan
rekombinan
Gambar 8 Koloni E. coli galur ER1647 non rekombinan (biru) dan plak putih (fage rekombinan).
Proses pengemasan menghasilkan titer sebesar antara 1.4 x 105 dan 2.3 x 105
dengan rata-rata 1.9 x 105pfu/ml (Tabel 1). Persentase fage rekombinan yang
terbentuk adalah berkisar antara 5.4% dan 17.3% dengan rata-rata 11.4%,
GATC GA
AG M.malabathricum CT AG λBlueSTAR-1 λBlueSTAR-1 λ CGAGCTTC CTTCGAGC
22
sehingga besarnya titer rekombinan yang terbentuk adalah 2.2 x 104 pfu/ml.
Persentase fage rekombinan ini lebih rendah dibandingkan dengan persentase
fage rekombinan pada konstruksi pustaka genom kedelai yang dilakukan oleh Suharsono (2002).
Tabel 1. Jumlah titer dan persentase fage λ rekombinan Perco
baan Pengencer-an (x) BiruJumlah plak (pfu)Bening Total rekombinan% plak Konsentrasi fage (pfu /ml)
I 100 1000 8315 13 4 9619 13.521.1 0.96 x 10 5 1.9 x 105 Rata-rata I 17.3 1.4 x 105 II 100 1000 226 21 15 1 241 22 6.24.5 2.41 x 10 5 2.2 x 105 Rata-rata II 5.4 2.3 x 105 Rata-rata I dan II 11.4 1.9 x 105
Persentase fage rekombinan yang rendah disebabkan oleh DNA M.
malabathricum yang digunakan kurang murni. Hal ini disebabkan oleh adanya
kontaminan, terutama oleh polisakarida. Polisakarida ini dapat menghambat proses pemotongan DNA oleh enzim restriksi. Masalah lain adalah adanya DNA yang tidak utuh (smear). Hal ini dapat terjadi jika DNA disimpan terlalu lama, atau diendapkan beberapa kali untuk pemekatan. Selain itu proses isolasi DNA dapat menyebabkan terpotongnya DNA secara fisik.
Untuk mengetahui ukuran DNA M. malabathricum yang menyisip ke
dalam fage , fage rekombinan (Gambar 9A) dari plak putih hasil lisis E coli
galur ER1647 selanjutnya ditransveksikan ke E. coli galur BM 25.8. Di dalam E.
coli galur BM 25.8, fage rekombinan mengalami proses eksisi dan berubah menjadi plasmid rekombinan (Gambar 9B, 9C). Hal ini terjadi karena galur BM25.8 dapat mensintesis rekombinase cre yang dapat menginduksi proses
rekombinasi pada dua situs loxP yang saling berpasangan yang ada pada fage
tersebut. Dua situs loxP tersebut mengapit situs pengklonan, titik asal replikasi (ori) dan gen resistensi terhadap ampisilin (Ap) (Gambar 2 & 9). Rekombinasi pada loxP ini menyebabkan kedua ujung λ BlueSTAR-1 sebelum loxP pertama dan setelah loxP kedua hilang, dan daerah yang diapit dua loxP tersebut membentuk molekul sirkuler berupa plasmid (Gambar 9B, 9C). Setelah diisolasi,
23
Gambar 9 Proses eksisi fage λ rekombinan menjadi plasmid rekombinan A, Fage λ rekombinan (linear), B.Pindah silang pada situs Lox P C. Plasmid rekombinan mengandung Ori & Ap, dan fragmen turunan DNA tanpa Ori (hilang), D. Plasmid rekombinan
& situs penyisipan. Lox P Lox P Lox P OriAp Ap Ori Hilang Plasmid rekombinan Ap Ori A B C D Fragmen DNA M. malabathricum
24 plasmid rekombinan diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5 agar mudah diperbanyak.
Ukuran fragmen DNA sisipan
Setelah diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5plasmid rekombinan diisolasi, kemudian dipotong dengan enzim EcoRI untuk memastikan bahwa DNA plasmid tersebut merupakan DNA rekombinan, sekaligus mengetahui ukuran dari fragmen DNA yang disisipkan ke dalam plasmid tersebut.
Tiga sampel plasmid rekombinan berhasil diisolasi. Hasil isolasi ini dipotong dengan EcoR1, kemudian dimigrasikan pada gel elektroforesis yang menghasilkan dua fragmen atau lebih (Gambar 10)
Plasmid rekombinan I (No.1, Gambar 10) setelah dipotong dengan
EcoR1 menghasilkan fragmen DNA berukuran 2100 pb (pasangan basa) dan 1200
pb (No.4, Gambar 10). Plasmid rekombinan II (No.2, Gambar 10) setelah dipotong dengan Eco R1 menghasilkan fragmen DNA berukuran 2100 pb dan 850 pb (No.5, Gambar 10). Plasmid rekombinan III (No.3, Gambar 10) setelah dipotong dengan EcoR1 menghasilkan fragmen DNA sebesar 8000 pb, 3500 pb dan 2100 pb (No. 6, Gambar 10).
Gambar 10 Plasmid rekombinan hasil proses eksisi yang tidak dipotong dan yang dipotong dengan enzim EcoR1. M=marker; 1, 2, 3 = plasmid rekombinan I, II, III yang tidak dipotong; 4, 5, 6 = plasmid rekombinan I, II, III yang dipotong Eco R1.
Ketiga plasmid ini (No. 4, 5, 6, Gambar 10) mengandung fragmen DNA berukuran 2100 pb, yang merupakan plasmid pengklonan turunan dari λ Blue
-2100 pb M 1 2 3 4 5 6 pb - 850 -1200 -3500 -8000
25 STAR-1 , sedangkan fragmen DNA yang berukuran 1200 pb (plasmid No. 4), 850 pb (plasmid No. 5), serta 8000 pb dan 3500 pb (plasmid No. 6) merupakan fragmen DNA sisipan yang berasal dari M. malabathricum. Hal ini menun-jukkan bahwa besarnya DNA M. malabathricum yang menyisip ke dalam fage adalah antara 850 pb dan 11500 pb (Tabel 2).
Tabel 2 Hasil analisis restriksi menggunakan enzim restriksi EcoRI Sampel
plasmid rekombinan
Ukuran fragmen (kpb) Ukuran sisipan
total DNA tumbuhan (kpb) Rata-rata sisipan DNA total tumbuhan (kpb) Turunan fage λ Sisipan DNA tumbuhan 1 2.1 1.2 1.2 4.52 2 2.1 0.85 0.85 3 2.1 8.0 & 3.5 11.5
Panjang gen pada tumbuhan telah diketahui oleh beberapa peneliti, khususnya panjang cDNA. Mao et al. (2004) telah mengidentifikasi 20 fragmen yang berasal dari transkripsi (Transcript derived fragments =TDFs) gen OsAR (Oryza sativa Al- regulated) yang diregulasi oleh Al dengan cDNA-AFLP pada padi yang berukuran antara 112 pb dan 572 pb. Zang et al. (2007) menggunakan
Differensial Display Reverse Transcription- Poly Chain Reaction (DDRT-PCR)
telah mencatat lebih dari 140 cDNA responsif terhadap Al pada tanaman padi, dengan ukuran antara 141-624 pb serta 12 gen asimilasi sulfur berukuran antara 319-1090 pb. Kovermann et al. (2007) melaporkan bahwa cDNA AtALMT9 (Arabidopsis thaliana Aluminum-Activated Malate Transporter) berukuran 1797 pb mempunyai enam ekson, yang ditranskripsi dari gen yang panjangnya sekitar 3000 pb. Berdasarkan ukuran gen cDNA dan perkiraan ukuran intronnya, maka dengan rata-rata besarnya sisipan fragmen DNA M. malabathricum sebesar 4.52 kpb kemungkinan bisa mengandung gen utuh.
Mengingat ukuran genom M. malabathricum belum diketahui, maka untuk mengetahui kelengkapan pustaka genomnya harus dibandingkan dengan genom dari spesies yang terdekat. M. malabathricum dan Dissotis canescens termasuk anggota famili Melastomataceae. Genom haploid Dissotic canescens berukuran
1.81 x 105 kpb (Hanson et al. 2001), sehingga ukuran genom diploidnya adalah
26
4.52 kpb, maka diperlukan klon rekombinan minimal sebesar 8 x 104 agar
mencakup seluruh pustaka genom.
Dalam penelitian ini, titer rekombinan yang terbentuk sebesar 2.2 x 104
pfu/ml, sehingga dalam 0.5 ml fage rekombinan terdapat 1.1 x 104 pfu. Dengan
menggunakan rumus N = ln(1-p)/ln(1-f), dimana N = jumlah fage rekombinan, p = peluang sembarang gen terdapat dalam pustaka genom, dan f = rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom (Sambrook et al. 1989), maka peluang sembarang gen yang terdapat di dalam pustaka genom M. malabathricum adalah sebesar 12.6 %.
27