Isolasi dan Seleksi Awal Bakteri Endofit Asal Tanaman Sirih dan Padi
Bakteri endofit yang diperoleh dari isolasi pada tanaman sirih berjumlah 50 isolat. Isolat bakteri endofit diisolasi dari bagian akar dan batang sirih karena komposisi bakteri endofit lebih banyak terdapat pada bagian akar dan batang tanaman daripada bagian tanaman lainnya (Hallmann et al. 1997). Menurut Lugtenberg dan Kravchenko (1999) Eksudat akar yang berperan sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme terdapat pada daerah sekitar perakaran. Berdasarkan uji hipersensitif pada tanaman tembakau dihasilkan 12 isolat bakteri yang menunjukkan reaksi negative Tabel 2.
Tabel 2 Hasil reaksi hipersensitif isolat bakteri endofit asal tanaman sirih pada tanaman tembakau. No Kode isolat Asal Uji hipersensitif No Kode Isolat Asal Uji Hipersensitif 1 AS1 AKAR Positif 27 BS1 BATANG Positif 2 AS2 AKAR Negatif 28 BS2 BATANG Positif 3 AS3 AKAR Positif 29 BS3 BATANG Positif 4 AS4 AKAR Positif 30 BS4 BATANG Positif 5 AS5 AKAR Positif 31 BS5 BATANG Positif 6 AS6 AKAR Positif 32 BS6 BATANG Positif 7 AS7 AKAR Positif 33 BS7 BATANG Positif 8 AS8 AKAR Positif 34 BS9 BATANG Positif 9 AS9 AKAR Positif 35 BS10 BATANG Positif 10 AS10 AKAR Positif 36 BS11 BATANG Negatif 11 AS11 AKAR Positif 37 BS12 BATANG Positif 12 AS12 AKAR Positif 38 BS13 BATANG Positif 13 AS13 AKAR Positif 39 BS14 BATANG Negatif 14 AS14 AKAR Negatif 40 BS15 BATANG Positif 15 AS15 AKAR Negatif 41 BS16 BATANG Positif 16 AS17 AKAR Positif 42 BS17 BATANG Positif 17 AS18 AKAR Negatif 43 BS18 BATANG Positif 18 AS19 AKAR Positif 44 BS19 BATANG Positif 19 AS20 AKAR Negatif 45 BS20 BATANG Positif 20 AS21 AKAR Negatif 46 BS21 BATANG Negatif 21 AS22 AKAR Negatif 47 BS23 BATANG Positif 22 AS23 AKAR Positif 48 BS25 BATANG Positif 23 AS24 AKAR Positif 49 BS26 BATANG Positif 24 AS25 AKAR Negatif 50 BS27 BATANG Positif 25 AS26 AKAR Positif
26 AS29 AKAR Negatif
Reaksi negatif pada uji hipersensitif menunjukkan bahwa suatu bakteri tidak berpotensi sebagai patogen tanaman. Hal ini dapat dilihat dari ada tidaknya gejala nekrosis pada daun tanaman tembakau yang telah disuntikkan suspensi bakteri
7
endofit. Menurut Suwanto (1996) pengujian reaksi hipersensitif terhadap tanaman tembakau dilakukan untuk melihat potensi suatu mikroorganisme (bakteri) bersifat patogen atau nonpatogen.
Seleksi Bakteri Endofit.
Dari 12 isolat bakteri endofit kemudian dilakukan seleksi uji antagonis terhadap patogen Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, dan Fusarium solani, yang kemudian dihasilkan 2 isolat bakteri AS2 dan BS14. Pengujian ini bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri endofit dalam menekan perkembangan patogen rebah kecambah yang berasal dari jenis cendawan yang berbeda. Bakteri endofit asal padi diperoleh melalui seleksi penghambatan paling tinggi terhadap patogen Rhizoctonia solani dan data pertumbuhan bakteri paling cepat. Diperoleh 4 isolat bakteri endofit yaitu AS2, BS14, Ci10, dan Ci6 kemudian dilakukan uji antibiosis terhadap Pythium sp. data pengujian antibiosis disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Seleksi bakteri endofit terhadap R. solani, S. rolfsii, dan F. solani secara in vitro.
No Isolate bakteri bakteri endofit
Aktifitas penghambatan bakteri endofit terhadat patogen
Sclerotium rolfsii Rhizoctonia solani Fusarium solani 1 AS2 + + + 2 AS14 - - - 3 AS15 - - - 4 AS18 - - - 5 AS20 - - - 6 AS21 - - - 7 AS22 - - - 8 AS25 - - - 9 AS29 - - - 10 BS11 - - - 11 BS21 - - - 12 BS14 + + + 13 Ci6 + + + 14 CI10 + + +
Keterangan: (+) menunjukkan adanya penghambatan bakteri endofit terhadap cendawan patogen, sedangkan (–) menunjukkan tidak adanya efek penghambatan bakteri endofit terhadap cendawan patogen.
Uji Antibiosis Bakteri Endofit terhadap Pythium sp.
Pengujian antibiosis bakteri endofit terhadap Pythium sp. dilakukan untuk mengetahui daya hambat bakteri endofit dalam uji in vitro. Data hasil uji antibiosis dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Uji antibiosis bakteri endofit terhadap Pythium sp.
No Kode Isolat Persentase penghambatan
1 Hari 2 Hari 3 Hari
1 AS2 0.00a 14.9a 20.0ab
2 BS14 0.00a 18.9a 47.0ab
3 Ci6 0.00a 35.8a 72.9a
4 Ci10 0.00a 16.9a 55.0ab
5 Kontrol 0.00a 0.0a 0.0b
Ket: angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan)
Hasil uji antibiosis isolat bakteri endofit Ci6 menunjukkan adanya zona penghambatan bakteri endofit terhadap Pythium sp. (gambar 1). Berbeda dengan isolat bakteri endofi AS2, BS14 dan Ci10 yang tidak menunjukkan adanya zona penghambatan terhadap Pythium sp., namun terjadi penghambatan terhadap patogen yang menyebabkan terhentinya pertumbuhan koloni patogen pada batas media yang ditumbuhi oleh koloni bakteri endofit. Penghambatan bakteri endofit terhadap patogen kemungkinan disebabkan oleh adanya metabolit sekunder yang dihasilkan oleh bakteri endofit. Menurut Hallmann et al. (1997) mekanisme antibiosis bakteri endofit berkaitan erat dengan kemampuan isolat bakteri endofit dalam menghasilkan enzim seperti kitinase, protease, selulase maupun senyawa sekunder lainnya yang sangat berperan dalam menginduksi ketahanan tanaman. Enzim kitinase mampu mendegradasi kitin yang merupakan komponen penyusun dinding sel cendawan patogen Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, dan Sclerotium rolfsii sedangkan enzim selulase mampu mengurai selulosa pada dinding cendawan Phytophthora capsici (Raaijmaker et al. 2008).
Gambar 1 Hasil uji antibiosis bakteri endofit dengan Pythium sp.
Uji Efikasi Bakteri Endofit untuk Pengendalian Pythium sp.
Pengujian pengaruh isolat bakteri endofit AS2, BS14, Ci10, dan Ci6 terhadap daya perkecambahan mentimun dilakukan dengan pengujian secara in vivo. Dimana pada pengujian ini parameter yang diamati adalah jumlah benih mentimun yang berkecambah dan jumlah benih yang terserang penyakit rebah
9
kecambah. Jumlah benih mentimun yang tumbuh dan terserang gejala rebah kecambah pada pengujian invivo disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5 Pengaruh perlakuan benih dengan isolat bakteri endofit terhadap daya tumbuh benih dan persentase kejadian penyakit rebah kecambah tanaman mentimun. No Kode perlakuan Daya kecambah (%) Kejadian penyakit (%) Penurunan tingkat serangan (%) Kejadian penyakit (%) Penurunan tingkat serangan (%) 1MST 1MST 2 MST 2 MST 1 AS2 100 16.67 0 25 62.5 2 BS14 100 8.33 50 25 62.5 3 Ci10 100 0 100 41.67 37.5 4 Ci6 91.67 8.33 50 8.33 87.6 5 K+ 83.33 16.67 0 66.7 0 6 K- 100 0 100 16.67 75.9
Data di atas menunjukkan bahwa jumlah benih mentimun yang berkecambah pada setiap perlakuan hampir mendekati angka 100% dibandingkan dengan kontrol positif. Hasil pengujian secara in vivo menunjukkan bahwa pada perlakuan kontrol positif persentase benih mentimun yang terserang rebah kecambah mengalami peningkatan dari minggu pertama hingga minggu ke dua pengamatan yaitu dari 16.67% hingga 66.67%. Selain itu, pada kontrol positif ditemukan gejala pre-emergence damping off pada minggu pertama dan post-emergence damping off pada minggu pertama maupun minggu kedua. Pada benih mentimun yang diberi perlakuan bakteri endofit persentase serangan rebah kecambah tertinggi terjadi pada perlakuan Ci10 yaitu terdapat peningkatan serangan dari 0% menjadi 41.67% atau penurunan tingkat serangan penyakit sebesar 37.5% pada 2 MST. Pada perlakuan Ci10 juga ditemukan pre-emergence damping off pada minggu pertama namun persentasenya lebih kecil dibanding kontrol positif. Menurut Muis (2007) rebah kecambah yang terjadi pada saat benih belum muncul ke permukaan tanah ditandai dengan gejala benih menjadi lunak dan berwarna coklat. Pada serangan rebah kecambah yang terjadi setelah benih tumbuh menyebabkan tanaman berwarna kuning, layu dan mati. Persentase tingkat serangan rebah kecambah pada perlakuan Ci6 lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Perlakuan benih mentimun yang direndam dengan isolat bakteri endofit Ci6 terjadi penurunan tingkat serangan penyakit hingga 87.6% pada minggu ke dua. Secara keseluruhan dari hasil percobaan pada setiap perlakuan menunjukkan bahwa benih mentimun yang di rendam dengan isolat bakteri endofit memiliki nilai persentase serangan rebah kecambah lebih rendah dibandingkan dengan kontrol positif. Hal ini membuktikan bahwa bakteri endofit di dalam tanah dapat menghambat kejadian penyakit rebah kecambah yang disebabkan oleh Pythium sp. pada tanaman mentimun.
Kemampuan bakteri endofit dalam menekan perkembangan patogen bisa disebabkan oleh beberapa hal, diantaranya adalah dengan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang bersifat antimikrob. Beberapa hasil penelitian sebelumnya telah melaporkan kemampuan dari bakteri endofit dalam menekan
kejadian penyakit pada tanaman, seperti isolat bakteri endofit yang diisolasi dari pisang dapat menekan kejadian penyakit darah pada pisang hingga 66.67-83.33% (Marwan et al. 2011), dan isolasi bakteri endofit dari tanaman tomat dapat menghambat perkembangan patogen Fusarium oxysporum subsp Lycopersici (Munif et al 2012).
Gambar 2 Kecambah terserang damping off dan mikroskopis Pythium sp. (a) gejala rebah kecambah pada benih yang belum tumbuh ke permukaan tanah (b) gejala layu pada benih yang telah tumbuh (c,d) sporangium Pythium sp.
Pengaruh Bakteri Endofit terhadap Pertumbuhan Tanaman Mentimun
Bakteri endofit selain memiliki kemampuan dalam meningkatkan ketahanan tanaman terhadap infeksi patogen, memiliki kemampuan juga dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Hasil pengamatan terhadap pengaruh bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap tinggi dan jumlah daun tanaman mentimun.
perlakuan Tinggi tanaman (cm) Jumlah daun tanaman (helai)
1 MST 2 MST 1 MST 2 MST
AS2 9.69a 11.90a 1.00a 1.63a
BS14 8.85abc 11.07a 1.00a 1.11b
Ci6 9.52ab 11.67a 1.00a 1.00b
Ci10 9.08abc 11.27a 1.00a 1.00b
K+ 7.88c 9.08b 1.00a 1.00b
K- 8.03bc 10.33ba 1.00a 1.00b
Ket; angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
Hasil perhitungan terhadap tinggi kecambah mentimun berdasarkan analisis statistik menunjukkan bahwa pada perlakuan AS2 dan Ci6 pada 1 MST berbeda nyata dengan kontrol negatif. Sedangkan pada pengamatan 2 MST semua perlakuan berbeda nyata dengan kontrol negatif namun tidak berbeda nyata dengan kontrol positif. Peningkatan persentase tinggi tanaman tertinggi dari minggu pertama hingga minggu kedua terjadi pada perlakuan AS2 yaitu sebesar 22.97% pada 1 MST dan 31.13% pada 2 MST. Nilai persentase tinggi tanaman selanjutnya pada perlakuan BS14, Ci6 dan Ci10 secara berurutan adalah 12.37%, 20.79%, 15.27% pada 1 MST dan 21.98%, 28.63%, 24,20% pada 2 MST. Pada perlakuan AS2 menunjukkan bahwa kecambah tumbuh lebih cepat dibandingkan
11
dengan perlakuan lainnya. Dalam hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit AS2 dapat meningkatkan tinggi tanaman sebesar 31.13% dibandingkan dengan isolat BS14, Ci6, dan Ci10.
Berdasarkan data tinggi tanaman dan jumlah helai daun kecambah, isolat AS2 dan BS14 berpotensi sebagai bakteri endofit pemacu pertumbuhan tanaman mentimun, karena kedua isolat bakteri tersebut secara konsisten dapat meningkatkan pertambahan tinggi tanaman dan jumlah helai daun tanaman mentimun. Hal ini membuktikan bahwa bakteri endofit memiliki kemampuan dalam memacu pertumbuhan tanaman. Menurut Hallmann et al (1997) bakteri endofit dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman karena dapat menyediakan nutrisi seperti nitrogen fosfat dan mineral lain serta dapat memproduksi hormon pertumbuhan seperti etilen, auksin, dan sitokinin. Zinniel et al. (2002) menambahkan bahwa selain dapat melindungi tanaman dari serangan patogen, kemampuan bakteri endofit dalam memfiksasi nitrogen juga dapat berperan dalam meningkatkan tinggi tanaman. Adanya kemampuan isolat bakteri endofit dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman disebabkan karena bakteri endofit mampu memproduksi fitohormon, meningkatkan produksi penyerapan mineral, fiksasi nitrogen, mengurangi kerusakan akibat perubahan cuaca dan meningkatkan ketahanan tanaman dari penyakit.
Uji Gram dan Penyimpanan Bakteri Endofit
Uji gram bakteri endofit terpilih dengan menggunakan KOH 3% menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit BS14 adalah bakteri gram positif karena tidak ditemukannya lendir pada koloni bakteri. Sedangkan bakteri endofit AS2, Ci6, dan Ci10 bersifat gram negatif karena terdapat lendir pada hasil campuran KOH 3% dan koloni bakteri. Lendir pada suspensi bakteri menunjukkan bahwa bakteri adalah gram negatif. Pengujian gram bakteri endofit dengan pewarnaan menunjukkan hasil yang sama dengan pengujian gram menggunakan KOH. Hasil pewarnaan gram terhadap koloni bakteri BS14 menunjukkan warna ungu yang menandakan bakteri endofit tergolong ke dalam bakteri gram positif. Sedangkan koloni bakteri endofit AS2, Ci6, dan Ci10 bersifat gram negatif karena berwarna merah. Bakteri gram positif berwarna ungu karena dinding sel tersusun atas lapisan yang tebal. Sebaliknya, bakteri gram negatif berwarna merah karena mempunyai lapisan dinding sel yang tipis sehingga pada saat dilakukan pewarnaan warna akan meresap ke dalam dinding sel bakteri. Bakteri endofit terpilih hasil uji gram kemudian disimpan dalam tabung eppendorf berisi TSB + gliserol sebanyak 0.5ml pada suhu -4 oC sebagai koleksi.
Gambar 4 Koloni bakteri endofit hasil pewarnaan gram pada perbesaran mikroskop 40 × 10: (a) bakteri endofit BS14 gram positif (b) bakteri endofit Ci6 gram negatif.
13
