Isolasi dan Identifikasi Colletotrichum dematium var. truncatum
Isolasi C. dematium var. truncatum diperoleh dari polong kedelai yang bergejala antraknosa. Gambar 1 memperlihatkan gejala antraknosa pada polong kedelai dan morfologi C. dematium. Polong kedelai yang terinfeksi menunjukkan gejala berupa adanya bercak coklat kehitaman yang dipenuhi aservulus seperti titik – titik hitam yang tidak beraturan atau konsentris (Gambar 1a). Pengamatan mikroskopis memperlihatkan aservulus yang ditumbuhi setae berwarna hitam kecoklatan dengan konidia seperti bulan sabit berwarna hialin (Gambar 1b dan 1c). Hal ini sesuai dengan pernyataan Sharma (2002), C. dematium var. truncatum
memiliki aservulus berwarna hitam berbentuk oval memanjang, setengah bulat kerucut terpotong dengan rambut (setae) berukuran 60-300 x 3-8 µm. Pada konidiofor tumbuh konidia yang berbentuk panjang meruncing, melengkung, unisel, dan hialin berukuran 17-31 x 3.5 µm. Pada tahap awal reproduksi, gejala terbentuk tidak teratur, daerah berbercak coklat dapat muncul pada batang, polong, dan tangkai. Jaringan yang terinfeksi ditutupi dengan tubuh buah hitam (aservulus) yang menghasilkan duri berwarna hitam (setae) yang dapat dilihat dengan mata telanjang (Manandhar & Hartman 1999). Miselium cendawan C. dematium awalnya berwarna putih lalu berubah menjadi abu – abu kehitaman dan ditumbuhi bintik – bintik berwarna hitam yang merupakan aservulus (Gambar 1d).
Gambar 1 Gejala antraknosa dan morfologi C. dematium: (a) gejala pada polong kedelai, (b) aservulus dan setae C.truncatum, (c) konidia C. dematium,(d) koloni C. dematium pada media PDA terbalik
a
c
b
Uji Hipersensitif
Uji hipersensitif digunakan untuk mengetahui potensi bakteri sebagai patogen. Tanaman tembakau biasanya digunakan untuk uji ini karena kemudahan infiltrasi daun, kenyamanan tumbuh dan pemeliharaan di bawah kondisi laboratorium (Sigee 1993). Tahapan uji hipersensitif ini dilakukan sebagai seleksi awal dalam memilih bakteri – bakteri hasil eksplorasi non patogenik. Tabel 3 menunjukkan hasil pengujian reaksi hipersensitif bakteri eksplorasi. Sebanyak lima bakteri dari eksplorasi kratok, delapan dari eksplorasi kecipir, dan sepuluh dari esplorasi kedelai bersifat non patogenik. Gejala nekrotik pada uji hipersensitif dapat dilihat pada Gambar 2.
Tabel 3 Pengujian reaksi hipersensitif bakteri eksplorasi
Eksplorasi Kratoka Eksplorasi Kecipira Eksplorasi Kedelaia
Kode Hasil ujib Kode Hasil ujib Kode Hasil ujib
R1 + J1 - KA + R2 + J2 + KB + R3 + J3 - KC - R4 + J4 + KD - R5 + J5 - KE - R6 + J6 - KF + R7 + J7 + KG + R8 + J8 - KH + R9 + J9 + KI - R10 + J10 + KJ + R11 + J11 - KK - R12 + J12 + KL + R13 + J13 - KM - R14 - J14 + KN - R15 + J15 - KO - R16 - KP - R17 + KQ + R18 + KR + R19 + KS + R20 + KT + R21 - KU + R22 + KV - R23 + KW + R24 - KX + R25 + KY + R26 + KZ + R27 + K1 + R28 + K2 + R29 - K3 + R30 + K4 + K5 + K6 + K7 + K8 + K9 +
aR= bakteri dari perakaran kratok, J= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai; b(-) = tidak terdapat bercak nekrotik setelah 48 JSI, (+)= terdapat bercak nekrotik setelah 48 JSI.
Gambar 2 Hasil uji hipersensitif pada daun tembakau: (a) bakteri patogenik, (b)
.kontrol negatif, (c).bakteri non patogenik
Uji Pemacuan Perkecambahan Kedelai
Seleksi awal pada perkecambahan kedelai dilakukan dengan menggunakan 23 isolat bakteri hasil eksplorasi yang lolos uji hipersensitif (Tabel 3). Sebanyak empat isolat bakteri kemudian dipilih yang mampu memacu pertumbuhan panjang batang dan akar perkecambahan serta memiliki daya perkecambahan minimal 80% dibanding kontrol (Tabel 4). Maka terpilih isolat bakteri J15, KV, KE, dan KN untuk kemudian diuji pada tanaman di pot (Lampiran 2).
Tabel 4 Seleksi awal bakteri eksplorasi terhadap perkecambahan kedelai No Bakteria Panjang batang dan akar
kecambah (cm)b Daya berkecambah (%)
1 Kontrol 7.13bc 84.1 2 R14 6.34c 91.7 3 R16 6.74bc 88.3 4 R21 6.53c 81.7 5 R24 7.10bc 71.7 6 R29 6.32c 95 7 J3 6.37c 78.3 8 J5 6.45c 78.3 9 J6 6.36c 98.3 10 J8 6.76bc 98.3 11 J11 6.73bc 91.7 12 J12 7.00bc 96.7 13 J13 6.71bc 96.7 14 J15 7.95abc 98.3 15 KC 7.04bc 75 16 KD 6.53c 88.3 17 KE 8.52ab 80 18 KI 6.95bc 88.3 19 KK 6.39c 81.7 20 KM 7.12bc 78.3 21 KN 8.15abc 98.3 22 KO 7.04bc 88.3 23 KP 7.08bc 88.3 24 KV 8.86a 95
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai; bAngka yang diikuti huruf
a b c
Uji Gram PGPR Terpilih
Uji Gram merupakan salah satu metode sederhana yang digunakan untuk mengetahui taksonomi suatu bakteri. Pengujian ini membagi bakteri ke dalam dua kelompok berbeda yaitu Gram positif dan negatif berdasarkan hasil korelasi antara larutan KOH 3% dan aktivitas aminopeptida (Sigee 1993). Sebanyak empat bakteri yang terpilih, J15 dan KN termasuk bakteri Gram negatif sedangkan KV dan KE merupakan bakteri Gram positif (Tabel 5). Gambar 3 memperlihatkan reaksi yang terjadi dalam uji Gram menggunakan KOH 3%.
Tabel 5Pengujian Gram bakteri PGPR terpilih
Bakteria Gramb
J15 -
KV +
KE +
KN -
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai; b(-) = bakteri Gram negatif, (+) = bakteri Gram positif.
Gambar 3 Hasil uji Gram bakteri terpilih: (a) bakteri Gram negatif, (b) bakteri
.Gram positif
Pengujian PGPR terhadap Pertumbuhan Tanaman Kedelai tanpa Inokulasi Patogen
Pengukuran tinggi tajuk merupakan salah satu parameter untuk mengetahui pengaruh PGPR terhadap pertumbuhan tanaman yang diberikan pada saat perendaman benih dan penyiraman ketika 10 HST. Pada pengamatan minggu pertama tampak tinggi tanaman dengan perlakuan KN berbeda nyata terhadap kontrol dan perlakuan lainnya. Pemberian bakteri KN dengan metode perendaman benih dinilai cukup efekif dalam memacu pertumbuhan tinggi tajuk tanaman kedelai dibandingkan perlakuan lainnya. Pada penelitian sebelumnya, bakteri
Pseudomonas aeruginosa Pal (PGPR) mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai dalam meningkatkan tinggi tanaman maksimum, jumlah cabang maksimum, jumlah daun maksimum, bobot basah dan kering akar, dan bobot kering biji. Perlakuan benih dengan PGPR dilakukan untuk pengkolonian PGPR seawal mungkin pada akar, sehingga akan mencegah pengkolonian akar oleh mikroba patogen (Khalim &Wirya 2009). Namun tinggi tajuk tanaman pada minggu selanjutnya dengan berbagai perlakuan PGPR tidak berbeda nyata terhadap kontrol (Tabel 6).
a b
Tabel 6 Tinggi tajuk tanaman kedelai di pot pada berbagai perlakuan PGPR (cm)
Perlakuana Minggu ke-b
1 2 3 4
KV 10.65ab 24.11a 39.85a 63.37a
KN 12.79a 25.09a 41.44a 63.27a
KE 12.13ab 24.77a 40.57a 63.57a
J15 12.49ab 25.90a 43.32a 62.35a
PF+BP 12.20ab 24.47a 41.41a 62.49a
K 10.43b 22.91a 38.79a 61.00a
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai, PF+BP = Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa; bAngka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Pada akhir pengamatan aspek agronomis (Tabel 7 dan 8) menunjukkan bahwa penggunaan berbagai perlakuan PGPR tidak berbeda nyata dengan kontrol dalam memacu perkembangan tanaman berdasarkan hasil sidik ragam (anova) dengan uji Duncan. Hal ini memperlihatkan bahwa pemberian PGPR tidak dapat memacu pertumbuhan tanaman hingga 6 MST. Meskipun demikian, perlakuan J15 memiliki besar diameter pangkal batang, berat basah dan jumlah daun yang lebih tinggi dibandingkan perlakuan lainnya. Menurut Thakuria et al. (2004), rhizobakteri memiliki kemampuan dalam menyediakan dan memobilisasi penyerapan unsur hara dari dalam tanah, melarutkan fosfor dan menghasilkan hormon pertumbuhan (IAA, sitokinin, giberelin, etilen) sehingga dapat memacu pertumbuhan tanaman.
Tabel 7 Diameter batang, berat basah tajuk, tinggi tajuk, dan jumlah daun
.tanaman kedelai pada akhir masa vegetatif (6 MST) dengan perlakuan
.PGPR Perlakuana Diameter batang (mm)b Berat basah tajuk (g)b Tinggi tajuk (cm)b Jumlah daun (helai)b
KV 4.88a 26.05ab 106.58a 37.75a
KN 4.92a 21.95ab 108.57a 34.65a
KE 4.95a 17.00b 97.02a 28.25a
J15 5.00a 30.10a 98.74a 40.67a
PF+BP 4.95a 21.48ab 96.14a 28.73a Kontrol 4.60a 20.54ab 96.67a 31.53a
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai, PF+BP = Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa; bAngka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Pengamatan terhadap berat basah akar, panjang akar, jumlah bintil akar, dan volume akar pada berbagai perlakuan tidak berbeda nyata dengan kontrol (Tabel 8). Gambar 4 memperlihatkan perakaran kedelai pada berbagai perlakuan. Beberapa PGPR diazotrof dapat memfiksasi nitrogen yang dibutuhkan oleh tanaman sehingga bermanfaat dalam menyediakan nutrisi dan efisiensi nitrogen, contoh rhizobia diazotrof adalah Rhizobium (Choudhary et al. 2007). Simbiosis antara rhizobia dengan akar tanaman legum akan menghasilkan organ penambat nitrogen yaitu bintil akar (Dierolf et al. 2001). Jumlah bintil akar pada percobaan kali ini tidak memberikan pengaruh nyata terhadap pemacuan pertumbuhan. Hal
dengan besar aspek agronomis tajuk dan bobot basah akar (Tabel 8). Menurut penelitian Purwaningsih et al. (2012) mengenai pengaruh inokulasi rhizobium berdasarkan kriteria kultivar memperlihatkan bahwa kultivar yang termasuk kriteria inokulasi rhizobium tidak meningkatkan fiksasi nitrogen salah satunya adalah kedelai varietas Wilis. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan rhizobium, antara lain pH tanah, suhu, sinar matahari, dan unsur hara tanah (Suprapto 1999). Gambar 5 memperlihatkan bintil akar pada perakaran kedelai.
Tabel 8 Berat basah akar, panjang akar, jumlah binti akar, dan volume akar tanaman kedelai pada akhir masa vegetatif (6 MST)
Perlakuana Berat basah akar (g)b Panjang akar (cm)b Jumlah bintil akarb Volume akar (ml)b
KV 7.74a 29.59a 35.60a 7.10a
KN 5.95b 31.87a 27.55a 5.43b
KE 5.38b 30.82a 43.22a 5.57b
J15 7.67a 31.79a 34.00a 7.08a
PF+BP 6.38ab 27.57a 36.60a 6.13ab
Kontrol 6.13ab 29.79a 36.67a 6.00ab
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai, PF+BP = Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa; bAngka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Gambar 4 Perbandingan akar tanaman kedelai pada semua perlakuan: (a)KE, (b) KN, (c).Kontrol, (d) J15, (e) KV, (e) PF+BP
Gambar 5 Bintil akar pada perakaran kedelai
Pengaruh Beberapa Isolat PGPRpada Potongan Daun dan Batang Kedelai Berbagai perlakuan PGPR diharapkan dapat menginduksi resistensi sistemik pada tanaman. Patogen diinokulasikan pada potongan batang dan daun kedelai umur 5 MST dengan ukuran daun dan besar batang yang seragam.
a b c d e f
Perlakuan in vivo pada potongan batang yang diinokulasi patogen secara penempelan menunjukkan gejala berupa nekrotik berwarna hitam kecoklatan dan daerah tersebut menjadi lunak. Semua potongan batang 100% menunjukkan gejala tersebut. Gambar 6 memperlihatkan gejala nekrotik pada potongan batang yang terinfeksi C. dematium. Panjang nekrotik yang timbul pada batang dengan berbagai perlakuan tidak berbeda nyata dengan kontrol (Tabel 9).
Tabel 9 Panjang nekrotik potongan batang kedelai pada berbagai perlakuan
.PGPR
Perlakuana Panjang nekrotik (mm)b
KV 6.30ab KN 5.60b KE 6.40a J15 6.40a PF+BP 6.00ab K 6.20ab
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai, PF+BP = Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa; bAngka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Gambar 6 Perlakuan in vivo potongan batang kedelai: (a) KE, (b) KV,(c) PF+BP,
.(d) J15, (e) KN, (f) Kontrol +, (g) Kontrol –
f e d c b a g 14
Induksi resistensi adalah keadaan dimana terjadi peningkatan kapasitas ketahanan yang ditimbulkan oleh tanaman pada saat ada rangsangan. Systemic acquired resistance (SAR) dan induced systemic resistance (ISR) adalah dua jenis resistensi induksi yang terimbas oleh infeksi sebelumnya atau rangsangan yang kemudian dihasilkan untuk melawan patogen atau parasit (Choudharyet al. 2007). Bahan penginduksi eksternal yang menstimulus pembentukan ketahanan dapat berupa agens biologi, kimia dan fisika (Agrios 2005). PGPR bisa menjadi agens antagonis dengan mengaktifkan sintesis beberapa metabolit antipatogen dalam tanaman secara tidak langsung (Tilak et al. 2010). Pemberian PGPR berperan sebagai bahan penginduksi eksternal dalam menstimulus pembentukan ketahanan tanaman. Efektifitas induksi ketahanan tergantung pada jenis senyawa yang digunakan, kondisi tanaman dan lingkungan tumbuh, dan rendahnya tingkat kolonisasi (Walters et al. 2005; Lugtenberg et al. 2001).
Tabel 10 Luas bercak, lama inkubasi dan frekuensi daun nekrotik pada uji in vivo
daun tanaman kedelai
Perlakuana Luas bercak (cm2)b Lama inkubasi (hari ke-)b Frekuensi daun berbercak (n =10)b KV 2.83ab 2 5 KN 2.17ab 2 4 KE 2.25ab 3 9 J15 1.42b 3 4 PF+BP 2.50ab 2 7 Kontrol + 4.17a 2 10
aJ= bakteri dari perakaran kecipir, K= bakteri dari perakaran kedelai, PF+BP = Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa; bAngka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Gambar 7 memperlihatkan bercak nekrotik pada daun dengan berbagai perlakuan. Gejala penyakit yang timbul pada daun setelah inokulasi patogen berupa bercak nekrotik meluas yang dikelilingi oleh halo. Gejala ini sesuai dengan pernyataan Adisarwanto & Wudianto (1999) bahwa bagian daun menggulung dan terjadi nekrosis pada tangkai atau tulang daun. Akhirnya daun berguguran sebelum waktunya. Pada percobaan ini, perlakuan J15 berbeda nyata dengan kontrol dan memiliki lama inkubasi sehari lebih lambat dibandingkan percobaan lain kecuali KE. Daun yang diinokulasi PGPR J15 memperlihatkan luas bercak yang lebih kecil dibandingkan perlakuan lainnya dan daun yang menunjukkan gejala hanya pada 4 daun dari 12 helai yang diuji. Pada perlakuan lainnya ada yang menunjukkan luas gejala yang besar pada beberapa daun dan luas gejala kecil tapi pada banyak daun uji. Perbandingan terlihat pada daun KV, KN dan KE. Hal ini mengindikasikan terekspresikannya induksi ketahanan pada tanaman sehingga terdapatnya daya hambat terhadap infeksi C. dematium.
Gambar 7 Perlakuan in vivo daun: (a) KV, (b) KN, (c) KE, (d) PF+BP, (e).Kontrol + , (f) J15, (g) Kontrol –
Menurut penelitian Arman et al. (2013), tingginya populasi mikroba antagonis yang mengkolonisasi pada perakaran tanaman sawi diduga akan berhubungan dengan kemampuannya dalam menginduksi ketahanan tanaman dengan cara penebalan dinding sel dan secara kimiawi dengan meningkatkan senyawa fenol dan fitoaleksin. Penebalan dinding sel pada tanaman menyebabkan patogen terhambat dalam proses penetrasinya ke dalam jaringan tanaman sehingga munculnya gejala awal serangan patogen menjadi lebih lama.
Percobaan dengan metode penetesan inokulum ini dipengaruhi oleh faktor fisiologi tanaman di antaranya rambut - rambut pada daun yang mempengaruhi proses penetrasi inokulum pada permukaan tanaman. Menurut Manandhar et al.
(1985), tumbuhnya hifa dari apresorium dipengaruhi oleh pembukaan stomata. Infeksi oleh cendawan C. dematium terjadi umumnya melalui sel epidermis, sedangkan yang melalui stomata maupun sel penjaga jarang sekali.
c b a g f e d 16