Hasil
Isozim AAT
Zimogram atau pola pita isozim AAT pala yang berasal dari daerah Malu-ku tampak pada Gambar 17. Analisis isozim menunjukkan bahwa isozim AAT pala ekotipe Ambon, Banda, dan Luhu bersifat monomorfik. Sifat monomorfik dapat diartikan bahwa pala Banda Maluku tidak memperlihatkan keragaman atau variasi ekspresi pada level protein isozim AAT.
Gambar 17 Zimogram isozim AAT pala Maluku. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi)
Tidak seperti halnya pala Maluku, zimogram AAT pala Maluku Utara memperlihatkan sedikit polimorfisme. AAT pala ekotipe Tidore dan Bacan menunjukkan sifat polimorfisme yang rendah namun pala ekotipe Ternate bersifat monomorfik (Gambar 18). Dua dari enam sampel tanaman pala ekotipe Tidore mengekspresikan pita protein dimer yaitu masing-masing dua pita, sementara pala Bacan satu pita berbeda.
Gambar 18 Zimogram isozim AAT pala Maluku Utara.
Variasi pola pita AAT pala ekotipe Tidore dan Bacan secara kualitatif sangat kecil sehingga tidak memadai untuk dipakai sebagai penciri tanaman pada level molekuler.
Isozim ACP
Analisis isozim ACP menunjukkan bahwa terdapat sedikit variasi (satu pi-ta) antara pala ekotipe Banda dengan ekotipe Ambon dan Luhu. Pala ekotipe Am-bon dan Luhu memperlihatkan pola ACP yang monomorfik. Gambar 19 memper-lihatkan pala sampel nomor 7 ekotipe Banda mengekspresikan protein dimer (dua pita protein).
Gambar 19 Zimogram isozim ACP pala Maluku. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi)
Analisis isozim pala Maluku Utara memperlihatkan adanya variasi ACP yang terjadi pada pala ekotipe Tidore dengan dua pita yang berbeda (Gambar 20). Dua ekotipe lainnya, Ternate dan Bacan, memperlihatkan pola ACP yang mono-morfik.
Gambar 20 Zimogram isozim ACP pala Maluku Utara. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi)
Isozim PER
Analisis isozim menunjukkan pala Maluku dan Maluku Utara tidak mem-perlihatkan perbedaan PER yang berarti. Pola pita keduanya bersifat monomorfik (Gambar 21 dan 22). Tidak ada yang dapat membedakan antara pala ekotipe Ban-da Ban-dan ekotipe lainnya Ban-dalam karakteristik PER.
Gambar 21 Zimogram isozim PER pala Maluku. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi)
Gambar 22 Zimogram isozim PER pala Maluku Utara. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi) Isozim EST
Seperti isozim EST, pala Maluku dan Maluku Utara juga memperlihatkan karakteristik dengan pola pita monomorfik. Keenam ekotipe pala mengekspre-sikan EST dengan pita protein tunggal (monomer).
Gambar 23 Zimogram isozim EST pala Maluku. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi)
Stabilitas karakteristik isozim EST pala Maluku dan Maluku Utara dapat dilihat pada zimogram Gambar 23 dan 24.
Gambar 24 Zimogram isozim EST pala Maluku Utara. (pita-pita di bagian bawah gel adalah interpretasi)
Profil DNA
Pola pita DNA genom pala yang berasal dari Maluku dan Maluku Utara tampak pada Gambar 25 dan 26. Pada kedua gambar tampak polimorfisme DNA pala Banda yang diamplifikasi dengan primer OPE-10 dan OP-11.
Pola pita DNA yang diamplifikasi dengan primer OPE-11 tampak pada Gambar 26. Pola pita DNA dengan primer OPE-11 memperlihatkan bahwa pala ekotipe Banda sangat mirip dalam dua ekotipe lainnya di Maluku dengan SI masing-masing 95% terhadap Ambon dan 100% terhadap Luhu. Untuk Maluku Utara, SI pala ekotipe Banda menjadi lebih kecil, masing-masing 78, 78, dan 83% masing-masing terhadap ekotipe Ternate, Tidore, dan Bacan (Tabel 44).
Gambar 25 Pola pita DNA M. fragrans Houtt, dengan primer OPE-10. (lin 1 dan 2 pala Ambon, 3 dan 4 pala Banda, 5 dan 6 pala Luhu; 7 dan 8 pala Ternate,
9 dan10 pala Tidore, 11 dan 12 pala Bacan).
Gambar 26 Pola pita DNA M. fragrans Houtt, dengan primer OPE-11. (lin 1 dan 2 pala Ambon, 3 dan 4 pala Banda, 5 dan 6 pala Luhu; 7 dan 8 pala Ternate,
9 dan10 pala Tidore, 11 dan 12 pala Bacan).
Dengan menggunakan primer OPE-10 menghasilkan SI 73 sampai 100%, dengan OPE-11, SI pala Banda antara 78 dan 100% (Tabel 44). Untuk Maluku, SI pala ekotipe Banda berbeda 83% dengan ekotipe Ambon dan 100% dengan ekotipe Luhu. Untuk pala Maluku Utara, SI pala ekotipe Banda berbeda 73, 79, dan 86% berturut-turut terhadap ekotipe Ternate, Tidore, dan Bacan (Tabel 44).
Berdasarkan indeks original Nei (Nei 1978) diketahui bahwa jarak genetik enam ekotipe pala 0 sampai 0,271 unit; sementara identitas genetiknya 0,7626 sampai 1,0000 unit (Tabel 48). Jarak genetik terdekat (0,000 unit) terjadi antara pala ekotipe Banda dan Luhu dan antara Bacan dan Tidore, sementara jarak
gene-tik terjauh terjadi antara pala ekotipe Ambon dan Ternate (0,2710 unit). Jarak genetik 0,000 berarti tidak tidak ada perbedaan antara dua ekotipe yang dibandingkan. Identitas genetik yang paling kecil terjadi antara pala ekotipe Ambon dan Ternate dan sebaliknya yang paling besar adalah antara pala ekotipe Banda dan Luhu dan antara Tidore dan Bacan.
Tabel 48 Indeks Kesamaan (SI) pola pita DNA tanaman pala Banda
Primer Lokasi/Ekotipe SI∗) OPE 10 Maluku: Banda 100 Ambon 83 Luhu 100 Maluku Utara: Ternate 73 Tidore 79 Bacan 86 OPE 11 Maluku: Banda 100 Ambon 95 Luhu 100 Maluku Utara: Ternate 78 Tidore 78 Bacan 83 *)
SI (dalam%) pala ekotipe Banda adalah referensi.
Pala yang berasal dari Maluku mengelompok dalam klaster yang sama, se-mentara pala Maluku Utara yang memperlihatkan variasi dan cenderung masuk ke dalam grup Maluku Utara. Pala ekotipe Ambon dan Luhu memiliki identitas genetik yang sama begitu pula halnya pala ekotipe Ternate dan Bacan (Tabel 49).
Tabel 49 Identitas genetik dan jarak genetik pala Banda
Ekotipe Ambon Banda Luhu Ternate Tidore Bacan
Ambon **** 0,9703 0,9703 0,7626 0,7785 0,7785 Banda 0,0302 **** 1,0000 0,7976 0,8122 0,8122 Luhu 0,0302 0,0000 **** 0,7976 0,8122 0,8122 Ternate 0,2710 0,2261 0,2261 **** 0,8858 0,8858 Tidore 0,2504 0,2080 0,2080 0,1213 **** 1,0000 Bacan 0,2504 0,2080 0,2080 0,1213 0,0000 **** Ket.: Identitas genetik Nei (diagonal atas) dan jarak genetik (diagonal bawah).
Keenam ekotipe pala bila digambarkan menurut identitas genetik dan kede-katan jarak genetik tampak seperti pada Gambar 27. Pada Gamber 27 tampak pa-la Banda mengelompok ke dapa-lam ekotipe asalnya masing-masing, yaitu Maluku dan Maluku Utara. Dendogram mengindikasikan bahwa kedekatan geografis men-jadi faktor yang melatarbelakangi pengelompokan pala.
Banda Ambon Luhu Ternate Tidore Bacan 9,21 4,21 1,29 0,0
Indeks Jarak Genetik
Gambar 27 Dendogram enam ekotipe pala Banda menurut pola DNA.
Pembahasan
Isozim penting dalam karakterisasi tanaman. Tanskley dan Orton (1983) menjelaskan bahwa isozim merupakan produk langsung dari gen, terdiri atas berbagai molekul aktif yang mempunyai struktur kimia yang berbeda tetapi mengkatalisis reaksi kimia yang sama. AAT merupakan salah satu isozim tanaman yang mengkatalisis reaksi transaminasi balik antara L-aspartat dan 2-oxoglutarat menghasilkan oxaloacetat dan L-glutamate (Wilkie et al. 1996). Pada penelitian diketahui AAT pala Banda secara umum memperlihatkan ekspresi yang stabil di enam ekotipe. Pola pita isozim AAT pala Banda yang sebagian besar monomorfik dapat diinterpretasi sebagai gambaran stabilitas ekspresi protein enzim AAT pada beragam ekotipe. Pola isozim sebagai karakteristik atau fenotipe tanaman pada level molekuler merupakan hasil dari interaksi antara faktor genetik dan lingkungan. Eskpresi isozim dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan fase per-tumbuhan tanaman. Penggunaan isozim sebagai penciri tanaman dalam beberapa
penggunaan isozim di antaranya adalah bentuk/pola isozim yang konstan untuk waktu yang lama selama siklus hidup tanaman, memberikan informasi struktur monomerik atau oligomerik enzim dalam keadaan homozigot atau heterozigot dari suatu gen pada suatu lokus, dan dapat diamati pada tahap pertumbuhan dini tanaman sehingga mempercepat proses identifikasi.
Pada pala Maluku Utara, AAT memperlihatkan polimorfisme yang rendah. Jarak geografis yang cukup jauh antara Maluku dan Maluku Utara menciptakan kondisi berbeda yang dapat mempengaruhi secara eksternal proses pertumbuhan dan perkembangan pala termasuk dalam hal ekspresi isozim. Kondisi lingkungan yang berbeda pada Maluku Utara memberikan pengaruh yang berbeda dalam ekspresi isozim AAT. Dua pita AAT ekotipe Tidore mengekspresikan protein enzim dimer, dan satu dimer pada ekotipe Bacan. Tingkat kesamaan karakter morfologi 90% pala Banda tampaknya proporsional dengan variasi yang kecil yang ditunjukkan oleh AAT oleh pala ekotipe Tidore dan Bacan Maluku Utara. Hubungan karakter morfologi dengan ekspresi isozim tertentu tidak mudah dipahami (Lebeda et al. 2003). Menurut Premoli et al. (2001) kisaran geografis atau ekotipe yang luas merupakan prediktor yang baik mengenai tingkat variasi ekspresi enzim pada tanaman. Jarak geografis yang cukup jauh antara ekotipe Banda dengan ekotipe lainnya di Maluku Utara cukup mendukung pernyataan di atas. Premoli et al. (2001) selanjutnya menyatakan bahwa spesies yang memiliki penyebaran luas, memiliki populasi yang besar dan membentuk variasi yang tinggi kurang dipengaruhi oleh efek genetic drift yang cenderung mengurangi variasi genetik pada spesies dengan wilayah penyebaran geografisnya terbatas.
Pola ekspresi yang hampir sama dengan AAT terjadi pada isozim ACP. Pala ekotipe Tidore mengekspresikan tingkat variasi isozim ACP yang rendah. Variasi isozim ACP yang terjadi pada pala Maluku Utara dapat dipandang sebagai respon adaptasi pala Banda di luar ekotipe aslinya, Pulau Banda. Variasi tersebut penting karena merupakan unsur dasar adaptasi dan juga untuk menjaga stabilitas tanaman dalam suatu ekosistem (Hamrick dan Godt 1989). Selain sebagai respon adaptasi, ekspresi isozim tertentu bersifat konstitutif yang berarti diekspresikan
sebagai proses metabolisme normal tanaman yang tidak bergantung pada perubahan kondisi lingkungan, seperti stres fisiologis. Isozim PER tergolong jenis konstitutif. PER adalah enzim yang diperlukan setiap saat oleh tanaman un-tuk menjaga agar metabolisme sel tidak terganggu oleh radikal bebas peroksida yang berbahaya. PER berperan menetralkan peroksidase melalui proses oksidasi sehingga menjadi aman bagi tumbuhan. Pada penelitian dengan isozim PER tidak memperlihatkan variasi ekspresi. Manjunatha et al. (2003) menemukan hal yang hampir sama pada tebu, yaitu PER memperlihatkan polimorfisme yang sangat rendah. Pada penelitian dengan PER memperlihatkan fenotipe monomorfik pada semua ekotipe. Pola ekspresi monomorfik PER juga sama dengan EST.
Karakteristik isozim yang monomorfik dan stabil (seperti PER dan EST) bukan suatu yang tidak lazim. Penelitian dengan isozim katalase (CAT) pada tanaman kenaf juga memperlihatkan pola isozim yang serupa dengan PER dan EST (Indriani et al. 2002). Monomorfisme dalam isozim dapat dipergunakan sebagai karakteristik molekuler pala Banda.
Ekspresi gen yang tergambar dalam pola pita DNA banyak digunakan sebagai penciri atau karakteristik tanaman pada tingkat molekuler. Dalam penelitian, karakteristik molekuler pala Banda dinyatakan dalam bentuk polimor-fisme DNA atau RAPD. Pala Banda yang berasal dari Maluku memper-lihatkan variasi yang sangat rendah (indeks kesamaan, 83-100%). Kemiripan pala Banda di Maluku Utara menurun dengan indeks kesamaan 73-86%. Lokasi geo-grafis atau ekotipe yang cukup jauh antara Maluku dan Maluku Utara kemungkinan dapat menjelaskan variasi ekspresi DNA yang terjadi. Variasi dalam DNA pada pala Banda, seperti yang diperlihatkan pala ekotipe Ternate danTidore, dapat merupakan ekspresi atas perbedaan secara geografis/ekotipe pala Banda.
Pada penelitian tampak bahwa semakin jauh jarak geografis dari ekotipe Banda, DNA cenderung bervariasi meskipun identitas genetik (0,7626 unit) dan jarak genetik (0,2710 unit) tidak cukup banyak berubah. Di luar ekotipe aslinya, pala Banda tidak cukup banyak mengalami variasi dalam level DNA. Stabilitas genetik bagi pala Banda adalah sifat yang penting terutama bila dihubungkan
dengan karakteristik produksi buah dan komponen minyak atsiri. Meskipun belum ada bukti yang menunjukkan perubahan karakteristik produksi dan komponen minyak atsiri atas perubahan pada struktur genetik pala Banda, namun untuk menjaga sifat khas pala Banda agar tetap dalam kondisi seperti ekotipe yang sekarang adalah hal yang penting.
KESIMPULAN
1. Isozim AAT pala Banda secara umum relatif stabil dalam agroekologi Maluku namun agak bervariasi dalam ekotipe Tidore dan Bacan (Makuku Utara). Hal serupa terjadi pada isozim ACP pala ekotipe Tidore.
2. Pala Banda dari Maluku dan Maluku Utara secara umum tidak dapat dibeda-kan berdasardibeda-kan isozim PER dan EST.
3. Terdapat 0,2710 unit jarak genetik antara pala Banda dari Maluku dan Maluku Utara.
4. Terjadi penurunan identitas genetik 0,7626 unit pada pala Banda setelah ber-kembang pada ekotipe Ternate, Maluku Utara.
