HASIL DAN PEMBAHASAN
5.3. HASIL PENAPISAN FITOKIMIA
Penapisan fitokimia memperlihatkan secara kualitatif keberadaan golongan senyawa kimia di dalam sampel. Pada keempat bahan penelitian mengandung flavonoid, saponin, steroid dan minyak atsiri. Alkaloid tidak terdapat pada binahong, kuinon dan tanin tidak terdapat pada binahong dan gendarusa. Sirih merah lengkap mengandung semua senyawa
28 kimia yaitu alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid/triterpenoid, kuionon, kumarin dan minyak atsiri.
Tabel 5.6. Hasil penapisan fitokimia daun binahong
Golongan senyawa
Daun binahong tidak terdeteksi adanya alkaoid , tanin dan minyak atsiri. Golongan senyawa kimia lebih banyak didapatkan pada fase n-butanol, air dan etil asetat dibanding n-heksan.
Tabel 5.7. Hasil penapisan fitokimia daun sirsak
Golongan senyawa
-Pada daun sirsak hampir semua golongan senyawa terdeteksi kecuali triterpenoid.
Fase etil asetat lebih terdapat banyak golongan senyawa dibanding dengan n-butaol dan air.
29 Tabel 5.8. Hasil penapisan fitokimia daun sirih merah
Golongan senyawa
Semua golongan senyawa pada skrining fitokimia dapat dideteksi dalam daun sirih merah.
Fase etil asetat adalah fase ekstrak yang terbanyak dapat melarutkan golongan senyawa kecuali steroid.
Tabel 5.9. Hasil penapisan fitokimia daun gandarusa
Golongan senyawa
Daun gandarusa tidak memiliki kandungan senyawa yang tidak selengkap sirih merah. Kandungan senyawa yang ada pada fase etil asetat sama dengan kandungan senyawa yang ada pada serbuknya.
30 5.4. HASIL PENETAPAN KONDISI OPTIMUM
Pada orientasi metode penetapan aktivitas enzimatik tidak dapat diperoleh panjang gelombang yang optimum sesuai dengan produk yaitu asam urat. Maka dilakukan penetapan aktivitas enzim secara tidak langsung yaitu berdasarkan pengukuran sisa substrat xantin yang tidak bereaksi dengan panjang gelombang maksimum yaitu 265 nm. Penetapan kondisi optimum memberikan hasil sbb. kadar enzim 0,3 U/mL, suhu 25oC, waktu inkubasi 45 menit
Dengan menggunakan substrat xantin berbagai konsentrasi, didapatkan panjang gelombang maksimum adalah 265 nm. Panjang gelombang tersebut merupakan panjang gelombang sisa xantin. Diperkirakan produk berupa asam urat yang dihasilkan oleh enzim xantin oksidase sangat kecil sehingga kurang terdeteksi oleh instrumen spektrofotometer. Karenanya metode penetapan dilakukan secara indirek yaitu dengan mengukur sisa xantin
Gambar 4 Grafik optimasi panjang gelombang dan konsentrasi substrat xantin
Karena metode yang dipilih adalah metode indirek maka nilai optimum dipilih berdasarkan nilai absorban sisa xantin yang paling kecil berarti produk yang paling besar. Pada optimasi konsentrasi enzim didapatkan konsentrasi enzim terbaik adalah 0,3 U/mL
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300
Serapan
Panjang Gelombang (nm)
0,1 mMolaritas 0,15 mMolaritas 0,2 mMolaritas 0,25 mMolaritas 0,3 mMolaritas
31
Gambar 5 Grafik optimasi konsentrasi enzim xantin oksidase
Waktu inkubasi yang dimaksud adalah waktu yang ditetapkan untuk memberikan kesempatan agar substrat berekasi dengan enzim sehingga produk dapat terbentuk.
Dibanding 30 menit maka 45 menit menunjukkan hasil reaksi yang maksimal .
Gambar 6 Grafik optimasi waktu inkubasi
Sesuai dengan anjuran pada leaflet maka suhu optimum enzim xantin oksidase adalah 25oC.
Gambar 7 Grafik optimasi suhu 0,34
0,36 0,38 0,4 0,42
30 menit 45 menit
Serapan Sisa Xantin pada λ265 nm
Waktu Inkubasi
0,32 0,34 0,36 0,38 0,4 0,42
25°C 37°C
Serapan Sisa Xantin pada λ265 nm
Suhu 0,38
0,385 0,39 0,395 0,4 0,405
0,1 U/ml 0,2 U/ml 0,3 U/ml
Serapan Sisa Xantin padaλ265 nm
Konsentrasi Enzim
32 5.5. HASIL UJI PENGHAMBATAN XANTIN OKSIDASE
Tabel 5.10. IC 50 Daun binahong
No. Ekstrak
Gambar 8. Rata-rata IC50 ekstrak daun binahong
Dari gambar 7 terlihat bahwa IC50 daun binahaong yang dipartisi dengan etil asetat dan air menunjukkan nilai yang relatif lebih kecil dibanding serbuk, ekstrak etanol kasar dan fase n-butanol.
Tabel 5.11. IC 50 Daun sirsak
No. Ekstrak daun sirsak IC50 rerata (ppm) SD (±)
IC50penghambatan xantin oksidase (bpj) Etanol 96%
n-heksan Etil asetat n-butanol Air Alopurinol
33 Gambar 9. Rata-rata IC50 ekstrak daun sirsak
Fase etil asetat pada daun sirsak memberikan nilai IC50 penghambatan xantin oksidase yang paling kecil dibanding ekstrak dan fase lain.
Tabel 5.11. IC 50 Daun sirih merah
No. Ekstrak
Gambar 10. Rata-rata IC50 ekstrak daun sirih merah
1642,28 IC50penghambatan xantin oksidase (bpj)
Etanol 96%
Kelompok Ekstrak Daun Sirih Merah
IC50penghambatan xantin oksidase (bpj) Etanol 96%
n-heksan Etil asetat n-butanol Air Alopurinol
34 Sama seperti ekstrak binahong, ekstrak daun sirih merah pada fase etil asetat dan air memberikan nilai IC50 yang paling kecil berturut-turut 16,86 bpjdan 23,74 bpj.
Tabel 5.12. IC 50 Daun gandarusa
No. Ekstrak
Gambar 11. Rata-rata IC50 ekstrak daun gendarusa
Berbeda dengan 3 ekstrak sebelumnya, ekstrak daun gendarusa memperlihatkan nilai IC50 paling kecil adalah 100 bpj dan nilai tersebut dimiliki oleh ekstrak kasar etanol. Ketika ekstrak kasar etanol dipartisi, IC 50 justru semakin besar.
5.6 PEMBAHASAN
Beberapa laporan penelitian menunjukkan bahwa flavonoid merupakan senyawa yang berperan dalam penghambatan xantin oksidase (Hariana, 2008). Pada umumnya, flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil-sulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain-lain (Markham, 1988). Adanya gula yang terikat pada
2058,69
IC50penghambatan xantin oksidase (bpj)
Etanol 96%
35 flavonoid (bentuk umum yang ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter (pelarut nonpolar) dan kloroform (pelarut semipolar) (Markham, 1988).
Pada penelitian ini, tanaman yang diuji diekstraksi dengan etanol, kemudian dipartisi menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda sehingga menghasilkan lima fase ekstrak daun sirih merah, yaitu fase etanol 96%, fase heksan, fase etil asetat, fase n-butanol, dan fase air. Partisi ini dilakukan dengan tujuan mengetahui pelarut yang sesuai untuk mengekstraksi senyawa poten penghambat xantin oksidase.
Semakin kecil nilai IC50, maka semakin poten ekstrak tersebut karena hanya diperlukan konsentrasi yang kecil untuk menghambat kerja enzim xantin oksidase sebesar 50%. Fase yang memiliki nilai IC50 terkecil menunjukkan bahwa fase tersebut merupakan fase aktif yang mengandung senyawa poten penghambat kerja enzim xantin oksidase. Kontrol positif yang digunakan adalah alopurinol. Pada penelitian ini, alopurinol memiliki nilai IC50
sebesar 0,9963 ppm.
Menurut jurnal Apaya dan Hernandez yang dikutip dari Sweeney AP dikatakan bahwa jika ekstrak dapat menghambat lebih dari 50% aktivitas enzim pada konsentrasi 50 ppm maka dapat diteliti lebih lanjut (Apaya, 2001). Berdasarkan kategori tersebut, fase etil asetat, fase n-heksan, dan fase air dari ekstrak etanol daun sirih merah serta fase air dari daun binahong memiliki aktivitas kuat sebagai penghambat xantin oksidase.
Beberapa laporan penelitian menyatakan bahwa flavonoid yang memiliki cincin benzopiran seperti silbinin, galangin, apigenin, baikalin, dan krisin mampu menghambat kerja enzim xantin oksidase (Umamaheswari, 2012). Laporan lain menyatakan bahwa senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas penghambatan enzim xantin oksidase adalah krisin, apigenin, kuersetin, luteolin, galangin, dan kaemferol ( Cos P., et al, 1998). Salah satu metabolit sekunder yang terkandung dalam daun sirih merah adalah flavonoid. Jenis flavonoid yang terdapat pada daun sirih merah adalah senyawa flavonol, flavanon, isoflavon, dan auron (Arishandy, 2010). Kaemferol dan kuersetin merupakan senyawa golongan flavonol. Apigenin dan luteolin merupakan senyawa golongan flavon. Isolasi yang telah dilakukan terhadap ekstrak sirih merah menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid pada fraksi etil asetat dan kuersetin (senyawa golongan flavonoid) pada fraksi etanol yang mampu bekerja sebagai antioksidan (Rachmawati, 2011). Senyawa flavonol, flavanon, dan isoflavon
36 memiliki struktur cincin benzopiran. Oleh karena itu, daun sirih merah berpotensi dalam menghambat xantin oksidase.
Penelitian mengenai isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dalam daun binahong didapatkan informasi, yaitu beberapa isolat dalam fase n-butanol dari ekstrak metanol mengandung senyawa flavonol dan flavon (Djamil R, 2009), sedangkan kandungan flavonoid ekstrak kering dan segar daun binahong termasuk golongan flavonol (Selawa, 2013).
Flavonoid yang ditemukan dari hasil isolasi ekstrak etil asetat daun binahong mengandung 8-Glucopyranosyl-4’,5,7-trihydroxyflavone (Djamil R, 2012), sedangkan isolat flavonoid dari ekstrak etil asetat daun binahong berdasarkan karakterisasi menggunakan spektrofotometer dengan pereaksi geser adalah 3,5,3’,4’-tetrahidroksiflavonol (Rahmawati). Namun, hasil penelitian ini didapatkan fase air yang memiliki nilai IC50 terkecil sehingga diduga didalam fase air mengandung senyawa poten yang dapat menghambat aktivitas xantin oksidase.
Berdasarkan hasil fitokimia, fase air mengandung senyawa flavonoid, saponin, steroid, dan triterpenoid. Akan tetapi, belum ada laporan penelitian yang menemukan hasil isolasi golongan senyawa flavonoid yang terkandung dalam fase air ekstrak daun binahong.
Nilai IC50 xantin oksidase <50 ppm dimiliki oleh ekstrak daun sirih merah yang dipartisi oleh n-heksan, etil asetat dan air sebesar berturut-turut 40,2257, 16,8598, 23,7402 ppm serta ekstrak daun binahong yang dipartisi dengan air sebesar 49,0921 ppm. IC50< 50 ppm mempunyai harapan untuk dilanjutkan pada uji khasiat antihiperurisemia.
37 BAB 6