KARAKTERISASI SERAT SUTERA DAN GEN PENYANDI FIBROIN PADA ULAT SUTERA LIAR
HASIL PENELITIAN
Struktur Serat pada KokonC. trifenestrata
Pola serat kokon C. trifenestrata disajikan pada Gambar 26. Pada Gambar tersebut, nampak bahwa antar satu lubang jala saling tumpang tindih. Setiap lubang jala disusun oleh dua sampai tiga lapis serat. Setiap lapis merupakan untaian ganda dari serat.
Perbandingan morfologi antara serat kokon C. trifenestrata dengan dan tanpadegummingdan serat suteraB. mori disajikan pada Gambar 27.
Perbandingan morfologi antara serat kokon C. trifenestrata dengan dan tanpadegummingdan serat suteraB. mori disajikan pada Gambar 27.
3 2 L L L 1 2 1 2 1 3
Gambar 26 Pola serat penyusun jala kokonC. trifenestrata; lubang kokon (L), lapisan serat dari dalam ke luar (1,2,3).
Gambar 27 Perbandingan serat kokonC. trifenestrata(kiri) dan serat sutera B. mori (kanan) . Serat kokon C. trifenestrata mentah (A), degumming dengan NaOH 0.5 g /L (B), 2 g/L (C), 4 g/L (D).
A B
Gambar 27 menunjukkan bahwa rerata diameter serat kokon mentah C. trifenestrata berukuran 22.5 µm. Hasil degumming dengan konsentarasi NaOH 0.5 g/L , 2 g/L dan 4 g/L berturut-turut adalah 21.9 µm, 21 µm dan 17.5 µm. Sedangkan diameter serat sutera B. moriberukuran rata-rata 11.7 µm. Perbandingan serat sutera hasil degumming dengan konstrasi NaOH berbeda disajikan pada Gambar 28.
Kelenjar Sutera
Pada larva instar V C. trifenestrata, kelenjar sutera mudah diamati. Kelenjar ini berupa sepasang tabung yang berpangkal pada bagian dasar rongga mulut dimana terdapat saluran pelepasan (spinneret), kemudian memanjang ke bagian belakang rongga tubuh. Kelenjar sutera terdiri atas tiga bagian, yaitu bagian depan (anterior), bagian tengah (median) dan bagian belakang (posterior) (Gambar 39).
Hasil Amplifikasi Gen FibroinC. trifenestrata
Hasil amplifikasi gen fibroin C. trifenestrata dari populasi Kabupaten Bogor, Kabupaten Purwakarta dan Kabupaten Bantul, berukuran ±1035 nukleotida (nt) (Gambar 30). Setelah dilakukan pensejajaran berganda, maka nukleotida yang dikarakterisasi sepanjang 986 nt. Nukleotida tersebut terdiri atas 42 nt ekson I, 113 nt intron dan 831nt Gambar 29 Kelenjar sutera dikeluarkan dari tubuh (A & B): bagian anterior
(1), median (2) dan posterior (3).
A B
1 2 3
Gambar 28 Serat sutera hasildegummingdengan konsentrasi NaOH berbeda: 0,5 g/L (A), 2 g/L (B) dan 4 g/L (C).
fragmen ekson II (Gambar 31). Urutan nukleotida dari gen tersebut telah didaftar padaGenBankdan dapat diakses dengan nomor JF264729.
Karakteristik Nukleotida Ekson I
Empat puluh dua nukleotida pada ekson I gen fibroinC. trifenestrata tidak menunjukkan keragaman intra populasi. Hasil pensejajaran berganda nukleotida tersebut dengan ekson I gen fibroin genus lain, yaitu sesama famili Saturniidae (Antheraea): A. pernyi, A. yamamai, A. mylitta dan berbeda famili (Bombycidae), yaituB. mori, menunjukkan 83.3% (35/42) nukleotida yang bersifat conserve(kekal) dan 16.7% (7/42) nukleotida yang bervariasi. Nukleotida ke-25 (C) dan ke-35 (T) merupakan nukleotida diagnostik bagi C. trifenestratayang berbeda dengan nukleotida dari spesies lain, baik sesama famili (Saturniidae), maupun dengan famili berbeda Gambar 31 Skema posisi Primer FfCt dan RfCt pada fragmen gen fibroin
A. pernyi, mengamplifikasi gen fibroin C. trifenestrata sepanjang 1035 nt (A), dan dikarakterisasi sepanjang 986 nt (B). Blok hitam: nukleotida primer forwarddanreverse, blok transparan: nukleotida yang teramplifikasi, blok terputus- putus: nukleotida yang dipotong, blok wana biru: nukleotida yang dikarakterisasi. A B FfCt 986 nt 1035 nt RfCt
Gambar 30 Produk PCR Gen FibroinC. trifenestrata:1. Marker 100 nt, 2-7 sampel yang teramplifikasi (1035 nt).
500 nt 1000 nt 3000 nt 1035 nt 1 2 3 4 5 6 7
(Bombycidae). Nukleotida ke-9, ke-11, ke-13, ke-18, dan ke-37 adalah diagnostik untuk B. mori (Bombycidae), yang berbeda dengan Saturniidae. Tidak ditemukan nukleotida diagnostik untuk genusAntheraea (Tabel 11).
Tabel 11 Posisi runutan nukleotida ekson I pada C. trifenestrata, A. yamamai, A. pernyi, A. mylittadanB. mori
Nukleotida ke 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012
C.trifenestrata ATG AGA GTA ACA GCC TTC GTG ATC CTG TGC TGC GTT TTG CAG A.yamamai ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... .C. ... ... A.pernyi ... ... ... .T. ... ... ... ... T.. ... ... .C. ... ... A.mylitta ... ... ... .T. ... ... ... ... T.. ... ... .C. ... ... B.mori ... ... ..C .A. A.. ..T ... ... T.. ... ... .C. C.. ...
arah pembacaan nukleotida, (.) nukleotida identik. A (adenin), T(timin), C (citosin), G (guanin), huruf yang dicetak tebal menunjukkan situs diagnostik untuk C. trifenestrata.
Tabel 11 menunjukkan bahwa komposisi nukleotida penyusun ekson I gen fibroinC. trifenestrataterdiri atas 19% A, 28% G, 21% C dan 31% T. Jumlah dan prosentase nukleotida yang berbeda antar spesies yang dibandingkan, disajikan pada Tabel 12.
Tabel 12 Jumlah dan prosentase (%) perbedaan nukleotida ekson I (42 nukleotida) dari gen fibroin C. trifenestrata, Antheraea, dan B. mori Spesies 1 2 3 4 5 [1] C. trifenestrata - [2] A. yamamai 2(4,8) [3] A. pernyi 3(7,1) 1(2,3) [4] A. mylitta 3(7,1) 1(2,3) 0 [5] B. mori 7(16,7) 5(11,9) 5(11,9) 5(11,9) - Angka dalam kurung menunjukkan prosentase nukleotida berbeda.
Tabel 12 menunjukkan bahwa diantara tiga spesies dari genus Antheraea yang dibandingkan, A. yamamai memiliki perbedaan nukleotida terkecil dengan C. trifenestrata. Selain itu, A. yamamai juga memiliki perbedaan nukleotida dengan dua spesies dari genus Antheraea lainnya. Sedangkan B. mori sebagai out group, konsisten dengan perbedaan nukleotida terbesar, baik denganC. trifenestratamaupun denganAntheraea. Filogeni yang dibuat dengan metode Neighbor-Joining, Boostrap 1000x, dengan model p-distance maupun Kimura 2-Parameter, adalah
sama, sehingga hanya satu yang ditampilkan. A. yamamaimenempati nodus yang sama dengan C. trifenestrata, sedangkan A. pernyi dan A. mylitta menempati nodus yang sama, tetapi berbeda dengan A. yamamai. B. mori menempati nodus terluar (Gambar 32).
Karakteristik Asam Amino Ekson I
Hasil pensejajaran berganda asam amino ekson I dari gen fibroin antara C. trifenestrata, Antheraea dan B. mori menunjukkan 79% (11/14) asam amino bersifat conserve antar spesies yang dibandingkan, dan hanya 21% (3/14) asam amino yang bervariasi. Asam amino valin (situs ke-12) adalah penanda bagi C. trifenestrata. Asam amino lisin dan treonin (situs ke-4 dan ke-5) adalah penanda bagiB. mori.Asam amino alanin dan treonin (situs ke-5) merupakan penanda bagi masing-masing famili, yaitu Saturniidae dan Bombycidae (Tabel 13).
Tabel 13 Situs asam amino berbeda yang dikode oleh ekson I gen fibroin C. trifenestrata, Antheraea, danB. mori
Asam amino ke 1 1 1 1 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 C.trifenestrata M R V T A F V I L C C V L Q A._yamamai . . . A . . A._mylitta . . . I . . . A . . A. pernyi . . . I . . . A . . B. mori . . . K T . . . A . .
arah pembacaan asam amino, (.) asam amino identik. M : metionin, R : arginin V:valin, K : lisin T: treonin, A: alanin, F: fenilalanin, I: isoleusin L : leuisin, C : cistein, Q : glutamin. Huruf yang dicetak tebal menunjukkan situs asam amino yang bersifat diagnostik untukC. trifenestrata.
C. trifenestrata(B1) C. trifenestrata(B2) C. trifenestrata(P1) C. trifenestrata(P2) C. trifenestrata(J1) C. trifenestrata(J2) A.yamamai A.pernyi A.mylitta B. mori 64 65 100 0.02 A B
Gambar 32 Filogeni berdasarkan runutan 42 nukleotida ekson I gen fibroin dengan metodeNeighbor-Joining, bootstrapped 1000x, model jarak genetik Kimura 2-Parameter, nodus Bombycidae (A), nodus Saturniidae (B).
Berdasarkan perbedaan asam aminonya, maka filogeni antar spesies dengan metode Neighbor- Joining, bootstrap1000x disajikan pada Gambar 33.
Filogeni antar spesies menunjukkan bahwa C. trifenestrata mengelompok sendiri pada nodus terdalam, diikuti oleh A. yamamai. Di sebelah luar nodus tersebut ditempati bersama oleh A. pernyi dan A. mylitta.SedangkanB. mori sebagaiout group,berada pada nodus terluar.
Karakteristik Nukleotida Ekson II
Nukleotida pada ekson II gen fibroin C. trifenestrata tidak menunjukkan adanya keragaman antar populasi, tetapi sangat berbeda dengan nukleotida pada ekson II gen fibroin A. pernyi, A. mylitta, A. yamamai dan B. mori. Perbandingan antar spesies menunjukkan bahwa nukleotida variabel lebih besar daripada nukleotida yang kekal. Sifat tersebut berkebalikan dengan nukleotida ekson I. Terdapat 65% (589/904) nukleotida yang bervariasi (variabel) antar spesies, yang secara umum bersifat diagnostik, dan hanya 35% (296/904) nukleotida yang konserve/kekal antar spesies. Jumlah nukleotida yang berbeda pada ekson II C. trifenestrata, Antheraea dan B. mori disajikan pada Tabel 14 dan Lampiran 3. C. trifenestrata(B1) C. trifenestrata(B2) C. trifenestrata(P1) C. trifenestrata(P2) C. trifenestrata(J1) C. trifenestrata(J2) A.yamamai A. pernyi A.mylitta B. mori 71 66 100 B 0.02
Gambar 33 Filogeni berdasarkan runutan 14 asam amino yang dikode oleh ekson I gen fibroin dengan metode Neighbor-Joining dan bootstrap 1000x, model p-distance, nodus Bombycidae (A), nodus Saturniidae (B).
.
Tabel 14 Jumlah dan prosentase perbedaan nukleotida ekson II gen fibroin C. trifenestrata, Antheraea, danB. mori
Spesies 1 2 3 4 5 [1] C. trifenestrata - [2] A. yamamai 233(25,8) [3] A. pernyi 221(24,5) 81(8,9) [4] A. mylitta 233(25,8) 91(10,1) 75(8,3) [5] B. mori 384(42,6) 393(43,5) 388(43,1) 382(42,3) -
Angka dalam kurung menunjukkan prosentase nukleotida berbeda.
Komposisi nukleotida ekson II gen fibroin C. trifenestrata terdiri atas 32.7% guanine (G), 26.5% adenine (A), 21.1 % timin (T) dan 19.7% citosin (C). Jika dibandingkan dengan Antheraea, maka terdapat reduksi penggunaan basa C dan G sekitar 10%, yang diiringi dengan peningkatan penggunaan basa T dan A (Lampiran 4).
Filogeni yang disusun berdasarkan perbedaan nukleotida dengan metode Neighborn-Joining, bootstrapped 1000x dengan model p-distance dan Kimura 2-Parameter, menunjukkan bahwa masing-masing spesies berada pada kelompok yang berbeda, tetapi dengan topologi sama, sehingga hanya satu yang ditampilkan (Gambar 34).
Gambar 34 Filogeni berdasarkan runutan 904 nukleotida ekson II gen fibroin dengan metode Neighborn Joining dan bootstrapped 1000x; berdasarkan model jarak genetikKimura 2-parameter, nodus Bombycidae (A), nodus Saturniidae (B).
C.trifenestrata (B1) C.trifenestrata(B2) C.trifenestrata(P1) C.trifenestrata (P2) C. trifenestrata(J1) C.trifenestrata (J2) A.pernyi A.yamamai A.mylitta B. mori 39 100 100 0.1 A B
Karakteristik Asam Amino Ekson II
Delapan ratus tiga puluh satu nukleotida yang telah dirunutkan pada daerah awal ekson II C. trifenestrata mengkode 277 asam amino. Asam amino tersebut seragam antar populasi C. trifenestrata, tetapi sangat beragam dibandingkan denganAntheraea, danB. mori(Tabel 15). Terdapat 79% (250/317) asam amino yang bersifat variabel antar spesies, dan hanya 21% (67/317) asam amino yang conserve/kekal antar spesies. Situs-situs yang bersifat variabel umumnya juga bersifat diagnostik (Lampiran 5).
Tabel 15 Jumlah dan prosentase perbedaan asam amino ekson II gen fibroin C. trifenestrata, AntheraeadanB. mori
Spesies 1 2 3 4 5 [1] C.trifenestrata - [2] A. yamamai 105(33,1) [3] A. pernyi 101(31,9) 26(8,2) [4] A. mylitta 109(34,3) 26(8,2) 29 [5] B. mori 178(56,4) 178(56,4) 179(56,5) 179(56,5) -
Angka dalam kurung menunjukkan prosentase asam amino berbeda.
Perbedaan asam amino ekson II, tidak saja ditunjukkan pada runutannya tetapi juga pada komposisinya. Lebih dari 60% asam amino tersebut berupa alanin, glisin, dan serin, sisanya adalah asam amino esensil lainnya dengan jumlah masing-masing tidak melebihi 5.5% (Tabel 16). Asam-asam amino tersebut tersusun dengan pola yang khas, menunjukkan adanya pengulangan asam amino alanin (A) mulai dari dua sampai dengan 12 asam amino alanin (polialanin). Polialanin ini membentuk blok melalui ikatan dengan asam amino glisin (G) dan serin (S), serta asam amino lainnya. Blok polianalin berupa: (A)2S(A)2, (A)3SS(A)3, (A)2GSAS(A)3,
(A)7SAAGSSGRGLGGYDGSVDGGYGSGSGS(A)10, (A)10GSSGRGIGG-
YDGFVDGGYGSGSGS(A)12, (A)12GSSGRGLGGYDGWVDDGYGS-
GSGS(A)12.
Tabel 16 Prosentase asam amino utama yang dikode oleh ekson II gen fibroinC. trifenestrata, AntheraeadanB. mori
Alanin Glisin Serin Lain-lain
Jumlah Total Asam amino C. trifenestrata 27.08 21.66 13.72 37.54 100 A. Yamamai 30.74 19.26 12.22 37.78 100 A. pernyi 29.78 21.32 12.50 36.40 100 A. mylitta 31.56 20.21 10.99 37.24 100 B. mori 25.26 28.33 7.85 38.56 100
Berdasarkan asam amino ekson II gen fibroin, jarak genetik (p- distance) antara C. trifenestrata dengan, A. pernyi, A. yamamai, A. mylitta, dan B. mori, berturut-turut adalah 0.40, 0.42, 0.43 dan 0.71. Berdasarkan hal tersebut, maka nampak bahwa Antheraea pernyi menempati nodus sendiri, sedangkanA. yamamaidanA. mylitta menempati nodus lainnya. B. morikonsisten sebagaiout group (Gambar 35).
Karakteristik Gen FibroinC. trifenestrataHasil Penggabungan Ekson I dan Parsial Ekson II
Penggabungan ekson I dan ekson II parsial gen fibroin tidak merubah pembacaan kodon triplet basa nukleotida, sehingga jumlah asam amino berbeda yang dibandingkan bersifat kumulatif saja. Meskipun demikian, hal yang menyolok adalah penggabungan tersebut menyebabkan jarak genetik antar spesies yang dibandingkan akan berubah. Hal ini disebabkan oleh karena: (1) ekson I relatif lebih pendek dibandingkan dengan ekson II, (2) Ekson I sangat terkonservasi, sedangkan ekson II sangat variabel.
Berdasarkan perbedaan nukleotida dan asam aminonya, filogeni antar spesies yang dibandingkan disajikan pada Gambar 36A dan B .
C. trifenestrata(B1) C. trifenestrata(B2) C. trifenestrata(P1) C. trifenestrata(P2) C. trifenestrata(J1) C. trifenestrata(J2) A. pernyi A. yamamai A. mylitta B. mori 83 100 100 A B
Gambar 35 Filogeni berdasarkan runutan 317 asam amino yang dikode oleh ekson II gen fibroin dengan metode Neighborn Joining dan bootstrap 1000x; model p-distance, nodus Bombycidae (A), nodus Saturniidae (B).
Karakteristik Intron Gen Fibroin
Intron atau daerah bukan pengkode asam amino pada gen fibroinC. trifenestrata berukuran 113 nt. Sekuen ini tidak menunjukkan keragaman antar populasi C. trifenestrata, tetapi sangat beragam jika dibandingkan dengan intron gen fibroin yang terdapat padaGenBank (Lampiran 6). Hasil pensejajaran berganda pada 5 spesies tersebut di atas, menunjukkan bahwa daerah terdapat konservatif hanya 0.3% (48/160), sedangkan daerah
C.trifenestrata(B2) C.trifenestrata (J2) C.trifenestrata (P1) C.trifenestrata (P2) C.trifenestrata (B1) C.trifenestrata (J1) A.pernyi A.yamamai A.mylitta B. mori 75 100 100 0.05 B C.trifenestrata (P1) C.trifenestrata (P2) C.trifenestrata (J1) C.trifenestrata (J2) C.trifenestrata (B2) C. trifenestrata (B1) A.yamamai A.pernyi A.mylitta B. mori 44 100 100 0.1 A
Gambar 36 Filogene berdasarkan 946 nukleotida coding region ekson I dan parsial ekson II gen fibroin dengan metode Neighbor- Joining, boostrap 1000x, model Kimura 2-Parameter (A), dan filogeni berdasarkan runutan 331 asam amino model p- distance(B).
variabel ada 62.5% (100/160). Perbedaan nukleotida pada masing-masing spesies yang dibandingkan, disajikan pada Tabel 17, dan komposisi nukleotida, masing-masing spesies yang dibandingkan, disajikan pada Tabel 18.
Tabel 17 Jumlah dan prosentase perbedaan nukleotida intron gen fibroinC. trifenestrata, Antheraea, danB. mori
Spesies 1 2 3 4 5 [1] C. trifenestrata - [2] A. yamamai 32(20,0) [3] A. pernyi 36(22,5) 7(4,4) [4] A. mylitta 32(20,0) 9(5,6) 15(9,4) [5] B. mori 60(37,5) 61(38,1) 60(37,5) 56(35,0) - Angka dalam kurung menunjukkan prosentase nukleotida berbeda.
Tabel 18 Komposisi nukleotida (%) intron gen fibroin C. trifenestrata, AntheraeadanB. mori
T(U) C A G Total C. trifenestrata 37.2 11.5 39.8 11.5 113 A. yamamai 36.7 8.0 48.0 7.3 150 A. pernyi 40.0 11.7 39.2 9.2 120 A. mylitta 44.4 7.5 40.6 7.5 133 B. mori 27.3 16.0 42.7 14.0 150 Rata-rata 37.0 11.2 41.2 10.6 123.1
Tabel 18 menunjukkan bahwa nukleotida T(U) dan A lebih banyak (≥ 70%) dibandingkan nukleotida C dan G, kecuali padaB. morinukleotida Adenin mendominasi nukleotida lainnya.
Filogeni yang dibuat berdasarkan 113 nukleotida intron dengan metode Neighborn-Joining, boostratp 1000x, dengan model p-distance dan Kimura 2-Parameter tidak menunjukkan perbedaan, sehingga hanya satu filogeni yang ditampilkan (Gambar 37).
PEMBAHASAN