BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Tujuan metode validasi adalah menjamin bahwa metode yang digunakan dalam penelitian ini valid dan memenuhi persyaratan parameter yang telah ditetapkan sehingga memberikan hasil analisis sesuai dengan yang diharapkan. Dengan demikian perlu adanya suatu pedoman yang dapat menjamin kevalidan suatu metode analisis. Metode analisis yang valid dapat memberikan hasil analisis yang akurat dan memiliki ketelitian tinggi pada penelitian yang dilakukan. Validasi metode analisis tidak hanya menentukan karakteristik metode yang digunakan tetapi juga verifikasi bahwa metode yang digunakan sesuai dengan tujuan sehingga mengurangi kemungkinan terjadinya kesalahan pada sampel dengan jumlah yang sedikit.
Validasi metode yang digunakan pada penelitian ini dilakukan dengan menguji akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas dari kurva standar baku kapsaisin. Validasi dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Untuk analisis, digunakan hasil dari validasi yang menunjukkan hasil terbaik.
Tabel IV. Hasil pengukuran absorbansi seri kurva baku kapsaisin yang direaksikan dengan DPPH
Replikasi I Replikasi II Replikasi III Konsentrasi Kapsaisin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Kapsaisin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Kapsaisin (µg/mL) Absorbansi 5 0,598 5,008 0,600 5,016 0,594 10 0,526 10,016 0,535 10,032 0,512 15 0,453 15,024 0,451 15,048 0,427 20 0,385 20,032 0,385 20,064 0,362 25 0,310 25,040 0,319 25,080 0,288
Persamaan regresi linier A = 0,6695
B = -0,0143
y = -0,0143x + 0,6695 r = 0,9999
Persamaan regresi linier A = 0,6716
B = -0,0142
y = -0,0142x + 0,6716 r = 0,9990
Persamaan regresi linier A = 0,6648
B = -0,0154
y = -0,0154x + 0,6648 r = 0,9989
Hasil yang didapat dari seri kurva baku kapsaisin digunakan untuk pengukuran akurasi dan presisi. Persamaan regresi linier yang digunakan untuk menghitung akurasi dan presisi adalah persamaan regresi linier replikasi I karena memiliki nilai r yang paling baik dari ketiga replikasi. Nilai r yang baik adalah nilai r yang mendekati satu. Persamaan yang digunakan adalah y = -0,0143x + 0,6695 dengan nilai r 0,9999 (Tabel IV)
1. Spesifisitas metode uji aktivitas antioksidan
Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur analit secara akurat tanpa adanya gangguan dari komponen-komponen lain seperti matriks sampel, produk hasil sintesis, eksipien, produk degradasi, dan senyawa pengotor (Gonzáles and Herrador, 2007). Spesifisitas pada penelitian ini dilakukan dengan membaca absorbansi senyawa-senyawa lain yang digunakan dalam uji aktivitas antioksidan pada panjang gelombang maksimum DPPH, yaitu 517,5 nm. Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH, namun senyawa yang diukur tidak hanya DPPH sehingga perlu adanya pengujian spesifisitas dari metode. Adanya senyawa lain yang terbaca pada panjang gelombang yang digunakan akan mempengaruhi hasil pembacaan absorbansi sehingga memungkinkan ketidakvalidan metode.
Dari hasil scanning larutan baku kapsaisin (Lampiran 7), larutan uji (Lampiran 7), dan pelarut etanol (Lampiran 7) menunjukkan tidak adanya absorbansi pada panjang gelombang 517,5 nm, sehingga saat pengukuran DPPH yang ditambahkan senyawa baku kapsaisin maupun larutan uji,
absorbansi yang terukur hanyalah absorbansi dari DPPH hasil reaksi. Berdasarkan hasil tersebut, metode uji aktivitas antioksidan memenuhi persyaratan validasi untuk spesifisitas.
2. Akurasi metode uji aktivitas antioksidan
Akurasi adalah ukuran derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit secara teoritis yang dinyatakan dalam nilai persen perolehan kembali (% recovery). Hasil akurasi yang baik untuk sampel dengan konsentrasi analit sebesar 10 ppm bila persen perolehan kembali yang didapat antara 90 – 107% (González and Herrador, 2007).
Pengukuran akurasi dilakukan pada baku kapsaisin peringkat rendah (5 µg/mL), peringkat sedang (15 µg/mL), dan peringkat tinggi (25 µg/mL) dengan replikasi sebanyak tiga kali.
Tabel V. Nilai perolehan kembali (% recovery) uji aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin
Peringkat Kadar kapsaisin (µg/mL) % Recovery
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Rendah 5 99,72% 96,77% 104,96%
Sedang 15 100,65% 101,42% 106,34%
Tinggi 25 100,27% 97,61% 103,63%
Berdasarkan data nilai perolehan kembali baku kapsaisin (Tabel V), nilai perolehan kembali berada pada rentang 96,77% - 104,96% untuk peringkat rendah, 100,65% - 106,34% untuk peringkat sedang, dan 97,61% - 103,63% untuk peringkat tinggi. Hasil perolehan kembali aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin yang didapat memenuhi syarat akurasi untuk sampel dengan kadar 10 -100 ppm, yaitu pada rentang 90% - 107% (Harmita, 2004). Dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan memiliki akurasi
yang baik sehingga pada penetapan aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih dapat memberikan akurasi yang baik pula.
3. Presisi metode uji aktivitas antioksidan
Presisi merupakan derajat penyebaran hasil pengukuran sampel bila metode dilakukan secara berulang dan pengambilan sampel harus homogen (Harmita, 2004). Presisi dinyatakan berdasarkan nilai Coeffisient of Variant
(CV), semakin kecil nilai CV menunjukkan bahwa penyebaran hasil makin kecil yang berkorelasi dengan semakin baiknya presisi dari metode yang digunakan sehingga validitas metode memenuhi kriteria parameter yang ditentukan. Penentuan nilai presisi yang diperbolehkan bergantung pada kadar analit yang terdapat dalam matriks sampel, instrumen yang digunakan, dan tahapan prosedur penelitian yang dilakukan. Untuk sampel dengan konsentrasi ppm, batas CV yang diperbolehkan ≤ 5 (González and Herrador, 2007).
Pengukuran presisi dilakukan pada baku kapsaisin konsentrasi peringkat rendah (5 µg/mL), peringkat sedang (15 µg/mL), dan peringkat tinggi (25 µg/mL) dengan replikasi sebanyak tiga kali.
Tabel VI. Nilai CV uji aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin Peringkat kapsaisin Kadar
(µg/mL) Rata-rata kadar kapsaisin terukur (µg/mL) SD CV (%) Rendah 5 5,0324 0,2130 4,23 Sedang 15 15,4452 0,4869 3,15 Tinggi 25 25,1669 0,7791 3,10
Berdasarkan nilai CV pada Tabel VI, baku kapsaisin memenuhi parameter presisi pada peringkat rendah, peringkat sedang, maupun peringkat
tinggi dengan nilai CV berturut-turut 4,23%; 3,15%; dan 3,10%. Metode yang digunakan telah memenuhi batas presisi, yaitu kurang dari 5%, sehingga menjamin presisi yang baik pula pada uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih.
4. Linearitas metode uji aktivitas antioksidan
Kurva kalibrasi pada metode ini merupakan hubungan proposional antara absorbansi analit (respon) dengan konsentrasi analit (Gonzáles and Herrador, 2007). Hasil dari kurva kalibrasi dapat diukur secara matematik sehingga menunjukkan linearitas metode. Linearitas dinyatakan dalam koefisien korelasi (r). Linearitas dikatakan semakin baik apabila koefisien korelasi dari kurva kalibrasi menunjukkan hasil semakin mendekati satu (Mulja dan Hanwar, 2003). Linearitas dilakukan dengan mengukur regresi linier dari konsentrasi baku kapsaisin dengan aktivitas antioksidan dengan tiga kali replikasi.
Dari pengukuran tiga replikasi, replikasi I menunjukkan nilai linearitas yang paling baik dengan nilai r = 0,9999, sedangkan nilai linearitas baku kapsaisin replikasi II dan III berturut-turut 0,9990 dan 0,9989. Nilai r ini memenuhi syarat linearitas yang baik, sehingga dapat disimpulkan bahwa metode ini memenuhi parameter linearitas.
Hasil dari validasi metode analisis uji aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa metode yang digunakan dalam mengukur kemampuan antioksidan menangkap radikal DPPH memenuhi parameter spesifisitas, akurasi, presisi, dan
linearitas sehingga dapat disimpulkan metode ini memiliki validitas yang baik dan hasil pengukuran dapat dipercaya.
