D. Metode Penelitian
3. Identifikasi dan Fraksinasi Komponen Kitooligomer
Produk hasil hidrolisis berbagai preparat enzim dan substrat diidentifikasi pada tahap awal berdasarkan konsentrasi glukosamin yang dihasilkan. Tahap selanjutnya dilakukan identifikasi dengan alat HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Sampel senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat sebelum dianalisis dengan HPLC terlebih dahulu disentrifus untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang dapat mempengaruhi pembacaan alat HPLC.
Identifikasi dan fraksinasi dengan HPLC menggunakan kolom karbohidrat (Waters) sebagai fase diam, dan pelarut asetonitril 60% dalam air sebagai fase gerak. Deteksi dilakukan berdasarkan waktu retensi, dengan detektor UV model 440 dual lamdha. menggunakan volume injeksi sampel sebanyak 20 ìl dan laju alir 1ml/menit. Sebagai standar digunakan senyawa kitooligomer campuran dari Seikagaku Japan, dengan unit monomer sampai heksamer pada konsentrasi 25 mg/ml. (Jeon dan Kim 2000; Chasanah 2004).
4. Pengujian AktivitasSenyawa-senyawa Kitooligomer terhadap Proliferasi
Sel Limfosit
a. Persiapan Media Kultur Sel dan Sampel Hidrolisat Kitooligomer
Media untuk kultur dan pemeliharaan sel menggunakan RPMI-1640 bubuk sebanyak 10.4 gram dan dilarutkan dalam air deionisasi sampai volume 1(satu) liter. Kemudian ditambahkan NaHCO3 2 gram, Glutamin 2 mM sebanyak 10 ml
dengan membran steril berukuran 0,22 ìm. Jika digunakan sebagai media pertumbuhan, komposisi medium dita mbahkan 10% FBS steril (Zakaria 1997).
Persiapan sampel dilakukan untuk menguji aktivitas proliferasi sel limfosit oleh senyawa-senyawa kitooligomer, yaitu terlebih dahulu ditetapkan besarnya konsentrasi hidrolisat senyawa-senyawa kitooligomer yang akan digunakan. Dari hasil pengujian pendahuluan terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit, diperoleh konsentrasi yang cukup baik pada nilai 17 ìg/ml kultur, sehingga semua sampel diuji pada besaran nilai konsentrasi yang sama yaitu 17 ìg/ml kultur. Sampel-sampel yang digunakan adalah beberapa hidrolisat enzimatik yang berasal dari reaksi dengan berbagai konsentrasi enzim per miligram kitosan, senyawa-senyawa kitooligomer murni, kitosan (DD 70%, 85%, 90% dan 100%) glukosamin, enzim, mitogen Concanavalin A dan Pokeweed, dan senyawa 2-Bromo deoksi uridin.
b. Isolasi sel limfosit
Limfosit manusia diisolasi dari darah perifer dengan sentrifugasi berdasarkan perbedaan densitas larutan ficoll-hypaque sebesar 1.77 ± 0.001 g/ml. Pertama dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi sampel darah dalam vacutainer pada 514 x g selama 10 menit dengan menggunakan sentrifus dengan rotor swing. Bagian darah yang lebih berat (sel darah merah) berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah di bagian atas. Lapisan buffycoat yang sebagian besar berisi sel limfosit diambil lalu ditambahkan medium basal. Pada tahap pemisahan selanjutnya suspensi limfosit dalam medium basal dilewatkan pada larutan ficoll-hypaque secara perlahan sehingga terbentuk dua lapisan yang tidak bercampur. Kemudian tabung disentrifus lagi selama 30 menit pada 1430 x g. Sel limfosit, monosit dan platelet berada sebagai lapisan di atas permukaan ficoll dan tidak menembus ke bawah. Sedangkan granulosit dan sel darah merah terpisah di dasar tabung sentrifus. Lapisan atas yang berisi sel limfosit, monosit dan platelet dicuci 2 (dua) kali dengan media basal dan disentrifugasi pada 228 x g selama 10 menit, supernatan di buang dan pelet dicuci serta disentrifus sekali lagi pada 228 x g selama 10 menit, sehingga limfosit (dalam presipitat) terpisah dari platelet, monosit, dan ficoll (dalam supernatan). Pelet sel yang diperoleh langsung ditambah medium pertumbuhan dan dihomogenkan, kemudian dilakukan
perbandingan 1: 1 (10 ìl suspensi sel ditambah dengan 10 ì l pewarna trifan biru). Setelah didiamkan selama 1 menit jumlah sel yang hidup dan mati dihitung dengan menggunakan hemasitometer pada perbesaran mikroskop sebesar 100 kali. Perhitungan jumlah sel dengan menggunakan pewarna trifan biru dimaksudkan untuk menentukan viabilitas sel yang akan diuji, yaitu sebelum dilakukan pengujian sel harus dalam kondisi hidup sebesar 95%. Berdasarkan hasil perhitungan jumlah sel menggunakan hemasitometer, maka dapat ditetapkan jumlah sel dalam setiap ml suspensi sebagai berikut :
N = V/4 x F x 104 sel/ml N = Jumlah sel/ml
V/4 = rata-rata jumlah sel terhitung dari empat bidang pandang F = Faktor pengenceran = 2
104 = 1 ml perkapasitas hemasitometer, yaitu 104 ml. (Palmer et al. 1978, Tejasari 2000).
Suspensi sel (1 x 106 sel/ml) dimasukkan ke dalam sumur-sumur microplate
sebanyak 80 ìl tiap sumur. Suspensi sel dalam media mengandung serum janin sapi (Fetal Bovine Serum (FBS)) 10%. Hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa kitooligomer dengan konsentrasi 85 µg/ml ditambahkan dalam sumur sebanyak 20 ìl, mitogen concanavalin A (Con A) dan pokeweed dengan konsentrasi masing-masing sebesar 50 µg/ml digunakan sebagai sampel pembanding masing-masing ditambahkan ke dalam sumur sebanyak 20 ìl, kecuali jika perlakuan menggunakan campuran senyawa-senyawa kitooligomer (dalam hidrolisat hasil reaksi enzimatik) dan mitogen maka jumlah mitogen dan sampel kitooligomer yang digunakan sebanyak 10 ìl. Jumlah total volume dalam tiap sumur sebanyak 100 ìl. Kultur diinkubasi pada inkubator dengan kondisi 5% CO2, 37o
C, dan RH 90% selama 3 (tiga) hari.
Setelah masa inkubasi berakhir dilakukan pengujian dengan metode MTT, yaitu ditambahkan 10 ìl larutan pereaksi garam tetrazolium (MTT) 5 mg/ml pada tiap sumur microplate, selanjutnya diinkubasi selama 4 (empat) jam. Sebelum pembacaan dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm, dilakukan pelarutan senyawa formazam yang terbentuk dengan larutan isopropanol pada tiap sumur sebanyak 100 ìl.
Sel Suspensi : Sel KR-4 dan K562 dalam keadaan beku yang tersimpan di dalam tangki berisi nitrogen cair setelah dikeluarkan, mengalami proses thawing, terlebih dahulu, yaitu ampul berisi sel diinkubasi pada suhu 37oC atau digengam dengan tangan sampai isi ampul mencair. Ampul selanjutnya disentrifugasi pada 228 x g selama 10 menit, supernatan dibuang dan pelet ditambah medium basal, kemudian disentrifugasi kembali pada 228 x g selama 5 menit, supaya bahan-bahan pengawet sel dan sel yang telah mati dapat dihilangkan dari kultur sel. Pelet sel kemudian ditambahkan media pertumbuhan dan dihomogeni sasi, selanjutnya suspensi sel dipindahkan ke dalam flask dengan media pertumbuhan 5 ml, lalu diinkubasi pada inkubator dengan 5% CO2 pada suhu 37oC. Pemeliharaan sel dilakukan dengan pergantian atau pencucian media setiap 3 (tiga) hari sekali atau bila su spensi telah berubah warna dari merah menjadi kuning yang menandakan telah terjadi penurunan pH karena kegiatan metabolisme dari sel, untuk kultur digunakan sel yang sedang berada dalam fase logaritmik pada kurva pertumbuhan.
Sel Selapis (monolayer) : Pemeliharaan sel selapis (HeLa dan A549)
sama dengan sel suspensi, hanya dalam pencucian atau pergantian media di dalam flask diperlukan larutan enzim tripsin 0.02% di dalam 0.5% EDTA-PBS, untuk pengangkatan sel yang melekat pada dinding flask. Media yang akan diganti mula-mula di buang semua sehingga hanya tersisa sel yang melekat di dinding flask, kemudian ditambahkan larutan tripsin sebanyak 500 µl (untuk volume kultur 5 ml) dan diinkubasi pada inkubator selama 8 (delapan) menit. Sel yang menempel akan terlepas, kemudian ditambahkan PBS secukupnya sebelum suspensi sel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan dilakukan prosedur pencucian sel seperti yang telah dilakukan pada sel suspensi