Identifikasi keberadaan gen sitokrom P450 2A6 alel*4 pada isolat DNA dilakukan dengan mengamplifikasi atau menggandakan fragmen DNA melalui proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer berperan penting dalam proses PCR ini. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri dari 18- 30 basa (Sasmito et al., 2014). Primer digunakan sebagai fragmen yang memulai proses penggandaan DNA pada lokasi yang diinginkan. Primer harus memenuhi persyaratan agar dapat menempel dan mengawali proses penggandaan sekuens DNA target. Primer yang baik adalah primer yang mempunyai sifat spesifik yang diharapkan mampu mengamplifikasi area spesifik dalam genom (Praja, 2021; Sint, Raso, & Traugott, 2012). Selain itu primer harus mengandung basa G/C dengan komposisi 40-60% dan jumlah basa pada rentang 18-30, urutan basa pada primer harus saling melengkapi dengan jumlah sekuens DNA target agar bisa menempel
L S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
Gambar 3. Hasil Analisis Kemurnian Isolat DNA
(Sasmito et al., 2014). Desain primer yang tepat adalah salah satu faktor yang paling penting dalam keberhasilan sekuensing DNA.
Dalam penelitian ini digunakan dua pasang primer yang bertujuan untuk mengidentifikasi apakah genotipe subyek uji termasuk dalam kategori homozygot (CYP2A6*1/*1) atau (CYP2A6*4/*4) atau kategori heterozygot (CYP2A6*1/*4).
Kedua pasang primer masing-masing hanya dapat menempel pada satu daerah tertentu, CYP2A6 alel*1 hanya akan menempel pada daerah alel*1 dan CYP2A6 alel*4 hanya akan menempel pada daerah alel*4 karena primer bersifat spesifik.
Primer yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan CYP2A6*1 yaitu primer forward : 5’-GGG AGA GGG GCG CAG CTA AG-3’ dan primer reverse : 5’- GGC AAT TAG GTG AGC GTG C-3’, sedangkan untuk mendeteksi keberadaan CYP2A6*4 digunakan primer forward 5'-GCG GAA GAG GCG GGT ATA AG- 3' dan primer reverse : 5'-GGC AAT TAG GTG AGC GTG C-3'. Kedua pasang primer tersebut akan menghasilkan produk dengan panjang 244-bp. Desain primer yang spesifik dan sekuens yang optimal akan turut menentukan keberhasilan proses PCR, hal tersebut disebabkan karena spesifisitas menentukan kemampuan primer untuk menempel pada isolat DNA target. Letak penempelan primer pada sekuens urutan basa nukleotida potongan gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 pada daerah yang diamplifikasi dapat diilustrasikan seperti pada gambar 4.
GGG AGA GGG GCG CAG CTA AG CCG TTA ATC CAC TCG CAC G CCC TCT CCC CGC GCT GAT TC GGC AAT TAG GTG AGC GTG C
GGG AGA GGG GCG CAG CTA AG CCG TTA ATC CAC TCG CAC G CCC TCT CCC CGC GCT GAT TC GGC AAT TAG GTG AGC GTG C
Keterangan : : arah penempelan primer forward;
: arah penempelan primer reverse.
Primer CYP2A6*1
Gambar 4. Letak Penempelan Primer
Pada urutan sekuens DNA antara gen CYP2A6 alel*1 dan CYP2A6 alel*4 terdapat 13 variasi basa nukleotida (ditunjukkan oleh warna hijau pada gambar 5).
Perbedaan tersebut terletak pada urutan ke 11720-11963, yang menyebabkan perbedaan urutan sekuens DNA antara CYP2A6 alel*1 dan alel*4. Perbedaan yang terdapat pada urutan basa nukleotida ini menyebabkan dibutuhkannya primer yang spesifik sehingga mampu melakukan proses amplifikasi. Perbedaan urutan basa pada CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 ditunjukkan pada gambar 5.
Gambar 5. Urutan Basa Nukleotida CYP2A6*1 dan *4 Keterangan : A : potongan urutan basa CYP*1; B : potongan urutan basa
CYP*4.
Produk PCR tersebut kemudian diidentifikasi dengan metode elektroforesis yang selanjutnya diamati dengan UV transiluminator. Penelitian ini menggunakan 2 pasang primer spesifik, sehingga didapatkan dua macam produk PCR dengan panjang pita yang sama yaitu 244-bp. Identifikasi keberadaan gen CYP2A6 alel*4 ditunjukkan dengan terbentuknya pita sepanjang 244-bp pada elektroforegram. Namun, bila tidak terbentuk pita maka gen tersebut termasuk dalam CYP2A6 alel*1. Begitu juga pada identifikasi keberadaan gen CYP2A6 alel*1 ditunjukkan dengan terbentuknya pita sepanjang 244-bp pada elektroforegram. Bila tidak terbentuk pita pada hasil elektroforegram maka gen tersebut masuk dalam CYP2A6 alel*4. Hasil dari elektroforegram CYP2A6 alel*1 dan alel*4 ini digunakan untuk mengetahui
genotipe dan fenotipe nya. Kategori normal metabolizer jika sampel mempunyai genotipe CYP2A6*1/*1, slow metabolizer apabila sampel mempunyai genotipe CYP2A6*1/*4, sedangkan kategori poor metabolizer apabila sampel mempunyai genotipe CYP2A6*4/*4. Berikut merupakan hasil elektroforesis produk PCR yang diamati dengan UV transiluminator yang ditunjukkan pada gambar 6 dan 7.
Keterangan : M : 100 bp + 3K bp DNA ladder sebagai marker; S1-7 : produk PCR;
kondisi elektroforesis : fase diam agarose 1%; fase gerak larutan TBE 1X; tegangan 110 V dengan running time 30 menit; volume injeksi 5 μL.
Keterangan : M : 100 bp + 3K bp DNA ladder sebagai marker; S1-7 : produk PCR dengan pita tebal dan tunggal; kondisi elektroforesis : fase diam agarose 1%; fase
gerak larutan TBE 1X; tegangan 110 V dengan running time 30 menit; volume injeksi 5 μL.
Berdasarkan gambar 6 terlihat bahwa sampel nomor 1, 3, dan 6 tidak menghasilkan pita pada identifikasi CYP2A6 alel*1, hal tersebut menunjukkan bahwa alel produk PCR yang teridentifikasi pada sampel tersebut
244-bp
Gambar 6. Elektroforegram Produk PCR dengan Primer Spesifik Alel CYP2A6*1
Gambar 7. Elektroforegram Produk PCR dengan Primer Spesifik Alel CYP2A6*4
adalah CYP2A6 alel*4. Sedangkan, pada gambar 7 terlihat bahwa seluruh sampel menghasilkan pita tebal dan terang pada identifikasi CYP2A6 alel*4, hal tersebut menunjukkan pada sampel nomor 1-7 mempunyai CYP2A6 alel
*4. Frekuensi alel, genotipe, dan fenotipe dari seluruh produk PCR dapat dilihat pada tabel iii.
Tabel III. Frekuensi alel, genotipe, fenotipe
Alel Jumlah (n=214) Frekuensi (%)
CYP2A6*1 63 29,44
CYP2A6*4 151 70,56
Total 214 100,00
Genotipe (Fenotipe) Jumlah (n=107) Frekuensi (%) CYP2A6*1/CYP2A6*1
Hasil elektroforegram 107 produk PCR yang diperoleh menggunakan primer spesifik CYP2A6 alel*1 dan 107 produk PCR dengan primer spesifik CYP2A6 alel*4 didapatkan produk PCR yang mempunyai alel*1 dengan frekuensi sebanyak 29,44% dan produk PCR mempunyai alel*4 dengan frekuensi sebanyak 70,56%. Berdasarkan genotipe dan fenotipe, didapatkan alel CYP2A6*1/*1 (normal metabolizer) sebanyak 0,93%; CYP2A6*1/*4 (slow metabolizer) sebanyak 57,94%; dan CYP2A6*4/*4 (poor metabolizer) sebanyak 41,12%. Dari data tersebut, mayoritas subyek uji merupakan golongan slow metabolizer. Hasil ini sejalan dengan penelitian Patramurti dan Fenty (2019), yang mengatakan bahwa frekuensi alel CYP2A6*4 di Indonesia khususnya pada populasi Jawa cukup tinggi, yaitu 48,5%. Seorang perokok yang mempunyai alel CYP2A6*4 cenderung kehilangan kemampuan untuk memetabolisme nikotin menjadi kotinin sehingga kadar nikotin di dalam darah akan lebih tinggi bila dibandingkan dengan perokok yang mempunyai jenis alel aktif CYP2A6*1. Pada kasus subyek uji penderita diabetes melitus tipe 2, jika perokok mempunyai bentuk alel CYP2A6*4 maka dengan tingginya kadar nikotin dalam darah akan meningkatkan resiko terserang diabetes melitus tipe 2 (Liu et al., 2011).
D. Analisis Kadar Kolesterol Total
Pada penelitian ini analasis kadar kolesterol total subyek uji dilakukan menggunakan metode Cholesterol Oxidase Methode atau CHOD-PAP. Prinsip pemeriksaan kadar kolesterol total pada metode CHOD-PAP ini yaitu penguraian kolesterol ester menjadi kolesterol dan asam lemak menggunakan enzim kolesterol esterase. Kolesterol yang terbentuk kemudian diubah menjadi Cholesterol-3-one dan hidrogen peroksida oleh enzim kolesterol oksidase. Hidrogen peroksida yang terbentuk beserta fenol dan 4-aminophenazone oleh peroksida yang terbentuk sebandung dengan konsentrasi kolesterol total. Hasil analisis kadar kolesterol dari subyek uji dapat dilihat pada tabel iv berikut.
Tabel IV. Kadar Kolesterol Total Keterangan
Berdasarkan tabel di atas, kadar kolesterol total dikelompokkan menjadi 2 yaitu, kolesterol total ≥ 200 mg/dL dan kolesterol total ≤ 200 mg/dL, kemudian dianalisis berdasarkan status merokoknya, yaitu perokok aktif, perokok pasif, dan non perokok. Ketiga kategori perokok memiliki rata-rata kadar kolesterol total yang cenderung normal karena berada di bawah ambang batas normal kadar kolesterol total, yaitu 200 mg/dL. Pada perokok aktif rata-rata kadar kolesterol total 199,8 mg/dL, perokok pasif 195,4 mg/dL, dan non perokok 195,6 mg/dL. Dari ketiga kategori perokok, rata-rata perokok aktif lebih tinggi, disusul non perokok, dan perokok pasif. Pada perokok aktif, 9 dari 19 responden (47,4%) mempunyai kadar kolesterol total yang melebihi batas 200 mg/dL. Pada perokok pasif, 14 responden (45,2%) mempunyai kadar kolesterol total yang melebihi batas, dan 17 lainnya
mempunyai kadar kolesterol yang normal. Sedangkan pada kategori non perokok, sebanyak 22 responden (38,5%) mempunyai kadar kolesterol total diatas normal
dan 35 responden lainnya mempunyai kadar kolesterol yang normal. Distribusi kadar kolesterol total dianalisis menggunakan box-plot yang ditunjukkan pada gambar 8.
Berdasarkan box-plot tersebut dapat dikatakan bahwa data miring atau tidak simetris, yang menandakan bahwa data tidak terdistribusi secara normal. Hal ini dapat dilihat dari garis median yang tidak berada di tengah kotak, jarak median ke kuartil 1 dan jarak median ke kuartil 3 tidak sama panjangnya pada ketiga box- plot. Selain itu, pada bagian atas box-plot juga terdapat 4 titik nilai outlier dan bagian bawah terdapat 1 titik nilai outlier yang menunjukkan bahwa distribusi data cenderung ke arah kanan (positive skewness).
E. Pengaruh Polimorfisme Gen Sitokrom P450 2A6 Alel*4 Terhadap