Konsumsi energi 1997.19 1900 energi (kcal) 613.43±23.56 air ( g) 39.1±13.37 lemak ( g) 24.30±0.81 % 34±0 karbohidrat. ( g) 77.1±1.34 % 49.67±1.15 protein ( g) 26.24±1.86 50 % 16.67±0.58 Vit. A (µg) 776.98±146.16 500 (RE) Vit. K (µg) 7.60±1.00 55 Vit. B12 (µg) 1.14±0.50 2,4 Vit. E (mg) 0.09±0.04 15 Vit. D (µg) 1.25±0.99 5 serat ( g) 4.70±0.80 PUFA ( g) 2.73±0.71 kolesterol (mg) 83.21±17.83 karoten (mg) 0.20±0.12 Vit. B6 (mg) 0.47±0.05 tot. fol.acid (µg) 55.89±11.67 400 Vit. C (mg) 26.02±5.77 75 kalsium (mg) 77.86±4.30 800 Zat besi (mg) 3.87±0.29 26 zinc (mg) 3.0±0.34 9,3 Profil Darah
Analisis profil darah dilakukan menggunakan metode Quantitative Buffy Coat (QBC) terhadap sampel darah lengkap. Pembacaan terhadap jumlah atau konsentrasi komponen darah meliputi hemoglobin, hematokrit, MCHC, lekosit, granulosit, limfosit, monosit dan platelet darah.
Hemoglobin
Sesudah masa suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak maka konsentrasi rata-rata hemoglobin kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 13,67±0,90 g/dL menjadi 12,69±0,85 g/dL, dengan selisih penurunan 0,98 g/dL. Sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 12,92±0,99 g/dL menjadi 12,63±0,84 g/dL dengan selisih penurunan sebesar 0,49 g/dL (Gambar 14). Berdasarkan uji independent t-test tidak berbeda nyata (p > 0,05) antara kedua kelompok pada periode yang sama. Namun pada uji paired sample t-test terdapat perbedaan yang nyata antara nilai hemoglobin sebelum dan sesudah penelitian (p<0,05). Penurunan yang terjadi pada kedua kelompok masih tetap dalam kisaran konsentrasi hemoglobin yang normal, yaitu 12,0 – 16,0 g/dL.
13.7 13.1 12.7 12.6 -1.0 -0.5 -2.0 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 P K K ons e nt ra s i he m ogl o bi n ( g/ dL ) sebelum sesudah perubahan
Gambar 14 Grafik rata-rata konsentrasi hemoglobin subyek kelompok perlakuan(P) dan kontrol (K) sebelum dan sesudah suplementasi
Hematokrit
Sesudah masa suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak, konsentrasi rata-rata hematokrit kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 41,83±2,75 % menjadi 39,32±2,95 %, dengan selisih penurunan 2,51%, sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 40,38±2,95 % menjadi 39,78±2,69 % dengan selisih penurunan sebesar 1,08 % (Gambar 15). Berdasarkan uji independent t-test tidak terdapat perbedaan yang nyata antara kedua kelompok pada periode yang sama (p > 0,05), dan pada uji paired sample t- test terdapat perbedaan yang nyata antara nilai hematokrit sebelum dan sesudah
penelitian (p<0,05). Penurunan yang terjadi pada kedua kelompok masih tetap dalam kisaran konsentrasi hematokrit yang normal, yaitu 37,0 – 47,0(%).
41.8 40.9 39.3 39.8 -2.5 -1.1 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 P K Ko n s e n tr a s i h e m a to k ri t (% ) sebelum sesudah perubahan
Gambar 15 Grafik rata-rata konsentrasi hematokrit subyek kelompok perlakuan(P) dan kontrol (K) sebelum dan sesudah suplementasi
Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC)
Sesudah masa suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak, maka konsentrasi rata-rata MCHC kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 32,68±0,48 g/dL menjadi 32,28±0,92 g/dL, dengan selisih penurunan 0,4 g/dL. Sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 32±0,58 g/dL menjadi 31,75±0,57 g/dL dengan selisih penurunan sebesar 0,36 g/dL (Gambar 16). Pada uji independent t-test pada periode sebelum studi terdapat perbedaan yang nyata (p<0,05), namun pada periode sesudah studi tidak terdapat perbedaan yang nyata antara kedua kelompok (p>0,05). Pada uji paired sample t-test tidak terdapat perbedaan yang nyata antara nilai MCHC sebelum dan sesudah penelitian (p>0,05). Walaupun demikian penurunan yang terjadi pada kedua kelompok masih tetap dalam kisaran konsentrasi MCHC yang normal, yaitu 31,7 – 36,0 g/dL.
32.7 32.3 32.1 31.8 -0.4 -0.4 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 P K Ko n s e n tr a s i M CHC (g /d L ) sebelum sesudah perubahan
Gambar 16 Grafik nilai rata-rata MCHC subyek kelompok perlakuan (P) dan kontrol (K) sebelum dan sesudah suplementasi
Lekosit Total
Sesudah masa suplementasi konsentrasi rata-rata lekosit total kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 6,63±1,64(x109/L) menjadi 6,03±1,02(x109/L), dengan selisih penurunan 0,6 (x109/L). Sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 6,76±0,85(x109/L) menjadi 6,44±1,48(x109/L) dengan selisih penurunan sebesar 0,36(x109/L) (Gambar 17). Pada uji independent t-test tidak terdapat perbedaan yang nyata antara kedua kelompok pada periode sebelum studi (p>0,05), namun terdapat perbedaan yang nyata pada periode sesudah studi (p<0,05). Pada uji paired sample t-test tidak terdapat perbedaan yang nyata antara nilai lekosit sebelum dan sesudah penelitian (p>0,05). Penurunan yang terjadi masih tetap dalam kisaran konsentrasi lekosit yang normal, yaitu 4,3 – 10,0(x109/L).
6.6 6.8 6.0 6.4 -0.6 -0.4 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 P K N ila i to ta l le k o s it ( x 1 0 9/L ) sebelum sesudah perubahan
Gambar 17 Grafik rata-rata nilai total lekosit subyek kelompok perlakuan (P) dan kontrol (K) sebelum dan sesudah suplementasi
Granulosit
Sesudah masa suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak, maka konsentrasi rata-rata granulosit total kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 4,48±1,49(x109/L) menjadi 3,89±0,84(x109/L) , dengan selisih penurunan 0,59 (x109/L). Sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 4,31±0,45(x109/L) menjadi 4,21±1,23(x109/L) dengan selisih penurunan sebesar 0,10(x109/L) (Gambar 18). Berdasarkan uji independent t-test tidak berbeda nyata (p > 0,05) antara kedua kelompok pada periode yang sama. Pada uji paired sample t-test tidak terdapat perbedaan yang nyata antara nilai granulosit sebelum dan sesudah studi (p>0,05). Penurunan yang terjadi pada kedua kelompok juga masih tetap dalam kisaran konsentrasi granulosit yang normal, yaitu 1,8 – 7,2(x 109/L). 4.5 4.3 2.2 2.5 3.9 4.2 2.1 2.2 -0.6 -0.1 0.0 -0.3 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 P K P K K o n s e n tr a s i g ra n u lo s it , li m fo s it d a n mo n o s it ( x10 9/L ) sebelum sesudah perubahan
Gambar 18 Grafik rata-rata nilai total granulosit, limfosit dan monosit subyek kelompok perlakuan (P) dan kontrol (K) sebelum dan sesudah suplementasi
Limfosit dan Monosit
Sesudah masa suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak maka konsentrasi rata-rata limfosit dan monosit kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 2,15±0,31 (x109/L) menjadi 2,14±0,30 (x109/L) , dengan selisih penurunan 0,01 (x109/L). Sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 2,49±0,75 (x109/L) menjadi 2,3±0,67(x109/L) dengan selisih penurunan sebesar 0,26(x109/L) (Gambar 18). Pada uji independent t-test terdapat perbedaan yang nyata pada periode sebelum studi (p<0,05), dan tidak terdapat perbedaan yang nyata antara kedua kelompok pada periode sesudah studi
(p>0,05). Pada uji paired sample t-test tidak terdapat perbedaan yang nyata antara nilai limfosit dan monosit sebelum dan sesudah penelitian (p>0,05). Penurunan yang terjadi tetap berada dalam kisaran nilai normal yaitu 1,7 -4,9 (x109/L).
Platelet
Sesudah masa suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak, maka jumlah platelet kelompok perlakuan mengalami penurunan dari 353,11±60,16(x109/L) menjadi 329,78±37,49(x109/L) , dengan selisih penurunan 23,33 (x109/L). Sedangkan kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari 342,87±56,35 (x109/L) menjadi 316,75±50,79(x109/L) dengan selisih penurunan sebesar 26,13(x109/L) (Gambar 19). 353.1 342.9 329.8 316.8 -23.3 -26.1 -50.0 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 P K N il ai p lat el et ( x109/ L ) sebelum sesudah perubahan
Gambar 19 Grafik rata-rata konsentrasi platelet subyek kelompok perlakuan (P) dan kontrol (K) sebelum dan sesudah suplementasi
Berdasar uji independent t-test tidak terdapat perbedaan nyata (p > 0,05) antara kedua kelompok pada periode yang sama. Pada uji paired sample t-test terdapat perbedaan yang nyata antara nilai platelet sebelum dan sesudah penelitian (p<0,05). Namun demikian penurunan jumlah platelet yang terjadi pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan masih di dalam kisaran nilai normal yaitu 140 – 400 (x109/L).
Pengaruh pemberian minuman bubuk kakao bebas lemak pada 18 orang subyek wanita yang sehat selama 25 hari telah diteliti oleh Yuliatmoko (2007), Amri (2007), Hasanah (2007) dan Erniati (2007). Pada subyek dan produk minuman yang sama dengan yang digunakan pada penelitian ini, para peneliti tersebut melaporkan tentang kapasitas antioksidan pada plasma dan eritrosit, pengaruhnya pada sistem enzim detoksifikasi serta kapasitasnya sebagai imunomodulator.
Yuliatmoko (2007) melaporkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak berpengaruh nyata dalam meningkatkan aktivitas antioksidan plasma yang meliputi peningkatan kadar vitamin C plasma, peningkatan antiradikal bebas, dan penurunan nilai malonaldehida (MDA) plasma, serta memperpanjang phase lag diena terkonjugasi. Di samping itu, konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak memperlihatkan adanya ketersediaan hayati flavonoid dalam plasma darah subyek.
Hasanah (2007) melaporkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat meningkatkan aktivitas enzim antioksidan katalase baik pada eritrosit maupun plasma. Selain itu juga dapat menurunkan aktivitas enzim sitokrom P-450 dan meningkatkan aktivitas enzim glutation S-transferase pada eritrosit maupun plasma subyek.
Amri (2007) melaporkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat meningkatkan kemampuan oksidatif eritrosit yang ditandai dengan penurunan kadar MDA eritrosit dan peningkatan aktivitas antioksidan eritrosit. Selain itu konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat melindungi membran eritrosit dari kerusakan oksidatif yang ditandai dengan menurunnya persentase lisis yang disebabkan oleh beberapa oksidator.
Erniati (2007) juga telah membuktikan bahwa setelah konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak, aktivitas flavonoid kakao dapat menstimulasi proliferasi limfosit T dan limfosit B, yang diduga melalui stimulasi produksi sitokin, terutama IL-1, IL-2 dan IL-4.
Penelitian ini ingin mengetahui pengaruh minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap profil darah subyek yang meliputi jumlah variabel atau komponen darah. Semua senyawa atau makanan, termasuk flavonoid, yang masuk ke dalam tubuh akan mempengaruhi komposisi darah, karena darah berfungsi mensuplai setiap jaringan di tubuh dengan zat gizi dan oksigen, serta membuang sisa metabolisme dan mengangkut karbon monoksida. Efek perlindungan antioksidan flavonoid terhadap plasma darah merupakan gambaran dari perlindungan total terhadap tubuh, karena plasma merupakan tempat bermuaranya berbagai metabolit sel tubuh (Engler et al 2004; Linder 1992). Efek konsumsi bubuk kakao bebas lemak dalam bentuk minuman terhadap profil darah sangat penting diketahui untuk menentukan status kesehatan konsumen setelah mengkonsumsi, serta mengetahui keamanan produk minuman tersebut.
Pada penelitian ini subyek wanita sehat sebanyak 18 orang dipilih tidak secara acak. Subyek berumur 21-27 tahun dan merupakan mahasiswa tingkat sarjana atau pascasarjana di Institut Pertanian Bogor, sehingga semua memiliki latar belakang pendidikan yang sama. Pemilihan subyek ini bertujuan untuk meminimalkan keragaman karena pengaruh hormonal, perbedaan aktivitas sehari- hari, serta termasuk dalam kelompok umur yang memiliki kesamaan dalam kebutuhan nutrisi makanan dan metabolismenya.
Flavonoid dalam bubuk kakao bebas lemak termasuk senyawa xenobiotik. Metabolisme senyawa xenobiotik dilaporkan bervariasi antara gender organisme terhadap suatu senyawa tertentu yang berasal dari jaringan tertentu. Mooney et al (2005) melaporkan bahwa pada studi suplementasi vitamin antioksidan pada wanita perokok dapat menurunkan 31% level benzo(a)pyrene-DNA adduct, sedangkan pada pria perokok pengaruhnya tidak berbeda nyata. Efek suplementasi pada perbedaan gender disimpulkan akibat interaksi pengaruh hormonal dan faktor kebiasaan pada kerentanan genetis atau kerentanan metabolik sehingga mengawali pembentukan DNA adduct. Sedangkan suplementasi antioksidan berperan dalam menghambat pembentukan adduct tersebut. Sehingga pada penelitian ini tanpa mengabaikan adanya kemungkinan perbedaan pengaruh karena jenis kelamin, maka pemilihan subyek semuanya wanita adalah untuk meminimalkan keragaman karena pengaruh hormonal.
Secara sosio-demografi, subyek tinggal di tempat yang berdekatan satu sama lain, hal ini untuk memudahkan pengontrolan selama studi suplementasi. Latar pendidikan subyek yang semuanya mahasiswa diharapkan bisa mengurangi efek plasebo yang mungkin timbul karena studi ini didisain secara tidak buta ganda dan menggunakan kontrol. Subyek tampak menjalani kehidupan sehari-hari yang cukup dan membelanjakan lebih dari sepertiga bagian uang sakunya untuk keperluan makan, disamping untuk keperluan sekolah dan jajanan. Sehingga semua subyek yang terlibat dalam penelitian ini memiliki latar belakang pendidikan dan keadaan sosio-demografi yang seragam. Kondisi subyek yang seragam di awal penelitian (baseline) diperlukan untuk menghindari dan mengontrol data bias yang mungkin timbul (Lenth 2001).
Pada penelitian ini subyek harus memenuhi kriteria eksklusi seperti perokok dan memiliki riwayat perokok, memiliki riwayat penyakit jantung atau kelainan pada darah, sedang dalam pengobatan suatu penyakit, mengkonsumsi alkohol, obesitas, diabetes, sedang hamil dan sering mengkonsumsi produk coklat. Antioksidan plasma pada subyek yang perokok, diketahui mengalami penurunan, terutama level vitamin C, karotenoid dan vitamin E dalam serum. Sebaliknya pada perokok terjadi peningkatan level aromatik hidrokarbon polisiklik- DNA adduct dalam plasma, sehingga mempengaruhi aktivitas enzim-enzim detoksifikasi (Mooney et al 2005). Demikian halnya dengan subyek yang gemar mengkonsumsi alkohol atau sedang mengkonsumsi obat-obatan tertentu. Subyek yang menderita kelainan darah atau mengidap penyakit degeneratif lainnya, disamping terjadi gangguan dalam sistem metabolisme dalam tubuhnya, juga akan memberikan data yang bias terhadap konsentrasi komponen darah yang diukur. Kehamilan dapat menurunkan aktivitas beberapa enzim yang terlibat dalam metabolisme xenobiotik, seperti catechol O-methyltransferase, monoamin oksidase dan konjugasi glukuronida (Hodgson dan Levi 2000). Di samping itu kehamilan juga menyebabkan plasma mengalami peningkatan volume dan massa sel darah merah sehingga menyebabkan nilai hemoglobin menjadi rendah (Gibson 2005). Sehingga pemeriksaan kesehatan klinis perlu dilakukan sebelum suplementasi untuk memastikan bahwa subyek yang terlibat memiliki kondisi
kesehatan yang baik dan tidak mengidap penyakit serius yang mempengaruhi penelitian.
Indeks berat per tinggi badan memang sering dipilih sebagai indikator status gizi seseorang. Sebagai suatu ukuran komposisi tubuh, indek massa tubuh atau Body Mass Index dapat memenuhi kriteria yang diharapkan yaitu mempunyai hubungan erat dengan jumlah lemak tubuh dan hubungan yang rendah dengan tinggi badan atau komposisi tubuh (Kartono et al 1997). Pengukuran berat badan merupakan pengukuran massa badan yang meliputi jaringan lemak, otot, tulang dan sebagainya (Bray 2002). Body Mass Index (BMI) dapat dihitung berdasar data tinggi badan (m2) dan berat badan (kg), untuk memperkirakan kegemukan atau obesitas tubuh, dan dapat dikaitkan dengan resiko suatu penyakit. Menurut penelitian, obesitas sering berhubungan dengan mortalitas, morbiditas dan kemampuan bereproduksi (Kartono et al 1997). Obesitas sering dikaitkan dengan resiko diabetes, penyakit jantung, paru-paru, kanker hingga gangguan pertumbuhan pada janin (Stipanuk 2000).
Sesudah suplementasi minuman bubuk kakao bebas lemak terjadi kenaikan BMI subyek, di mana kenaikan terjadi pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Kenaikan BMI subyek tersebut disimpulkan bukan sebagai akibat konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama suplementasi, karena kenaikan berat badan dialami oleh kedua kelompok. Asupan makanan, aktivitas fisik dan faktor genetis juga dapat mempengaruhi BMI subyek (Eastwood 2003). Hal ini diperkuat oleh Mathur et al (2002); Rein et al (2002a) dan Holt et al (2002) yang menyatakan pada studi suplementasi minuman kakao atau komponen aktifnya pada subyek sehat, tidak mempengaruhi nilai BMI dan status gizinya.
Asupan makanan yang dapat memenuhi kebutuhan energi setiap individu, diperlukan untuk mendukung aktivitas fisik dan kebutuhan kesehatan lainnya (Eastwood 2003). Energi dilepaskan dari karbohidrat, lemak, protein dan alkohol dalam makanan. Kebutuhan energi individu sangat bervariasi tergantung pada proses metabolik, fungsi fisiologis, aktivitas tubuh, produksi panas tubuh, pertumbuhan dan sintesa jaringan baru.
Menurut See dan Florentino (1997), kebutuhan energi sehari-hari untuk wanita dengan kelompok umur 19-29 tahun adalah sebesar 1997,19 kcal atau 7955,4 kJ. Pada penelitian ini, tampak bahwa subyek kelompok kontrol dan perlakuan memiliki pola makan yang baik dan mencukupi kebutuhan energi pada kelompok usianya. Perbedaan asupan nutrisi subyek yang tampak, erat kaitannya dengan adanya variasi antar individu. Jumlah energi dan kandungan nutrisi pada menu makanan pagi dan malam yang disediakan peneliti nampak kecil, mengingat jumlah tersebut dihitung dari dua kali menu makan. Bila di sela waktu dua kali makan tersebut subyek masih mengkonsumsi jajanan dan juga makan siang, maka rata-rata asupan energi selama studi diduga tidak jauh berbeda dengan pola makan subyek sehari-hari.
Pada penelitian ini data sosio-demografi, kondisi vital, dan asupan makanan dipakai sebagai gambaran subyek pada saat base-line dan bukan merupakan parameter yang diharapkan berubah. Pada awal dan akhir suplementasi perlu dilakukan pencatatan kondisi vital subyek. Data-data tersebut diperlukan untuk mengkontrol bias yang mungkin terjadi.
Setelah konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari terjadi penurunan yang nyata pada jumlah hemoglobin, hematokrit dan platelet darah, namun penurunan pada jumlah MCHC, lekosit, granulosit, limfosit dan monosit tidak berbeda nyata. Konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak disimpulkan bukan sebagai penyebab penurunan pada jumlah variabel darah, karena penurunan terjadi pada kelompok perlakuan dan juga kelompok kontrol. Pola makan subyek dan makanan yang dikonsumsi selama penelitian diduga berkontribusi pada penurunan jumlah variabel darah. Berdasarkan hasil wawancara dengan subyek, umumnya mereka menyatakan bahwa pola makan mereka lebih baik selama suplementasi dibandingkan dengan pola makan mereka biasanya. Selama suplementasi berlangsung, setiap menu yang disajikan selalu disediakan nasi sebagai sumber karbohidrat, lauk sebagai sumber protein dan lemak, sayur dan buah sebagai sumber vitamin dan mineral. Selain itu selama suplementasi berlangsung, subyek juga mengurangi konsumsi makanan jajanan. Menurut Winarno (2004) dan Zakaria et al (1996), dalam makanan jajanan mengandung bahan-bahan pencemar seperti mikoroorganisme, pestisida, logam
berat, zat pewarna, zat pemanis dan zat pengawet. Konsumsi makanan jajan yang tercemar bahan kimia berpotensi menaikkan pembentukan senyawa radikal bebas dalam tubuh konsumen.
Produksi sel-sel darah dipengaruhi oleh faktor-faktor nutrisi, antara lain ; protein, vitamin B12 , folat, besi, vitamin B6, riboflavin (vitamin B2), asam nikotinat (vitamin B3), asam askorbat, vitamin A, vitamin E dan tembaga (Hendricks et al 2002). Kekurangan atau defisiensi asupan nutrisi-nutrisi tersebut akan mempengaruhi jumlah komponen darah, gangguan metabolisme hingga mengindikasikan adanya gangguan fungsi tubuh lainnya. Protein sangat penting peranannya pada proses diferensiasi sel-sel darah, di mana proses tersebut diatur oleh sitokin dan hormon. Sitokin sendiri merupakan protein, enzim-enzim dan mediator inflamasi yang diproduksi darah juga merupakan protein. Riboflavin dan asam nikotinat merupakan kofaktor yang penting dalam metabolisme tubuh dan metabolisme senyawa xenobiotik. Vitamin B6 berperan dalam membantu metabolisme energi terutama metabolisme asam amino, membantu konversi tryptophan menjadi niasin dan serotonin serta membantu pembentukan sel darah (Linder 1992). Vitamin B12 juga berfungsi dalam pengembangan sel darah merah yang normal dan dalam sintesis DNA. Defisiensi vitamin ini dapat menyebabkan penyakit anemia pernisiosa (Hendricks et al 2002). Asam folat dan zat besi adalah nutrisi makanan yang banyak berperan dalam pembentukan sel darah merah. Zat besi tersimpan dalam semua sel tubuh dan berperan penting dalam sintesis protein zat besi, seperti hemoglobin dan myoglobin serta enzim katalase (Hendricks et al 2002). Vitamin K sangat penting berperan dalam pembekuan darah, yaitu sebagai ko-faktor dalam sintesis protrombin dan protein lainnya yang terlibat dalam pembekuan darah (Linder 1992). Vitamin C berperan penting dalam melindungi tubuh terhadap infeksi, membantu pembentukan jaringan penghubung atau kolagen, membantu penyembuhan luka, memelihara elastisitas dan kekuatan pembuluh darah, serta berperan dalam pembentukan sel darah merah (Eastwood 2003). Vitamin C dikenal juga sebagai antioksidan, berfungsi dalam pengaturan metabolisme zat besi serta sebagai ko-faktor bagi enzim sitokrom P450.
Konsumsi bubuk kakao bebas lemak yang mengandung polifenol tinggi dilaporkan mampu meningkatkan kadar vitamin C dalam plasma (Yuliatmoko
2007). Beberapa flavonoid berperan sebagai antioksidan bagi asam askorbat (vitamin C). Pada studi in vitro dilaporkan bahwa, flavonoid menghambat konversi askorbat menjadi dehidroaskorbat (Middleton et al 2000). Salah satu mekanisme penghambatan yang bisa dijelaskan antara lain karena flavonoid mengkelat Cu dan logam-logam lainnya, sehingga memperlambat oksidasi asam askorbat yang dikatalis oleh logam. Mekanisme lainnya diduga karena kemampuan flavonoid sebagai aseptor radikal bebas, di mana pembentukan radikal bebas merupakan tahapan yang penting dalam oksidasi askorbat. Kapasitas perlindungan flavonoid terhadap oksidasi askorbat, tergantung dari struktur yang dimiliki flavonoid tersebut. Flavonoid yang memiliki gugus 3’, 4’- OH pada cincin B dan gugus 3-hidroksi-4-karbonil pada cincin - piron, secara nyata memiliki aktivitas antioksidan yang besar (Middleton et al 2000). Leung (1981) juga melaporkan adanya interaksi sinergis antara vitamin C dan vitamin E terhadap peroksidasi fosfolipid membran.
Vitamin E terdapat di alam sebagai senyawa tokoferol dan tokotrienol, dan α- tokoferol adalah bentuk yang paling aktif. Vitamin E larut dalam lemak melalui sistem limfatik dan di tubuh ditransportasikan dalam lipoprotein. Vitamin E berfungsi sebagai antioksidan karena memutus rantai otooksidasi lipid dengan cara mendonasikan hidrogen. Selain itu vitamin E berperan dalam melindungi membran sel, meningkatkan respon imun, mengatur agregasi platelet dan mengatur aktivasi protein kinase C. Banyak studi yang meneliti peranan vitamin E sendiri atau dikombinasikan dengan antioksidan lainnya dalam melindungi tubuh terhadap kerusakan oksidatif yang berhubungan dengan berkembangnya kanker, jantung koroner dan penyakit Al-zheimer (Mooney et al 2005, Linder 1992).
Hemoglobin merupakan pigmen sel darah merah yang berperan dalam transpor O2 dan CO2. Kandungan polifenol dalam suatu bahan pangan dilaporkan
dapat menghambat penyerapan zat besi dalam makanan yang dikonsumsi. Bahkan konsumsi dosis polifenol yang tinggi, bisa menghabiskan simpanan zat besi pada individu dengan status zat besi marjinal (Mennen et al 2005). Hal ini juga akan berakibat menghambat pembentukan hemoglobin dan produksi sel darah merah. Apalagi jika konsumsi polifenol tidak diimbangi dengan konsumsi makanan yang mengandung vitamin C, di mana vitamin C dapat meningkatkan penyerapan zat
besi. Efek penghambatan polifenol terhadap penyerapan zat besi baru dapat dibuktikan pada studi secara in vitro dan studi pada hewan coba, sedangkan pengaruhnya pada manusia belum terbukti (Mennen et al 2005).
Pada penelitian ini, penurunan jumlah hemoglobin yang terjadi tetap berada pada konsentrasi hemoglobin yang normal. Hal ini diduga karena adanya aktivitas antioksidan dari komponen flavonoid pada kakao bebas lemak yang melindungi sel darah merah dari kerusakan oksidatif (Zhu et al 2005). Menurut Zhu et al (2005), eritrosit mengandung asam lemak tak jenuh ganda dengan konsentrasi yang tinggi, oksigen molekuler, dan ion besi sebagai ligan, oleh sebab itu eritrosit sangat mudah diserang sehingga terjadi stress oksidatif. Amri (2007) juga melaporkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari dapat menurunkan laju hemolisis eritrosit yang disebabkan oleh beberapa oksidator.
Hematokrit merupakan perbandingan bagian darah yang mengandung eritrosit terhadap volume seluruh darah yang dihitung dalam %. Pada defisiensi zat besi, hematokrit akan menurun karena hemoglobin yang terbentuk menjadi berkurang. Penurunan hematokrit berarti berkurangnya viskositas darah dan agregasi sel darah merah. Secara teori, penurunan hematokrit dapat meningkatkan aliran darah dan bisa memulihkan aliran darah yang terganggu karena suatu penyakit menjadi normal (Lowe 1988). Heiss et al (2003) dan Fisher et al (2003) melaporkan bahwa subyek yang mengkonsumsi minuman kaya flavanol mengalami peningkatan dilatasi (relaksasi) pembuluh darah yang seiring dengan peningkatan jumlah oksida nitrat (NO) yang bersirkulasi. NO merupakan molekul yang mengeluarkan sinyal penting bagi fisiologi pembuluh darah. Aktivitas NO meningkat apabila terjadi peningkatan jumlah komponen yang ternitrosasi dalam plasma.
Pada studi double blind cross over, sebanyak 20 subyek yang sedikitnya memiliki satu faktor resiko penyakit kardiovaskular, seperti jantung koroner, hipertensi, hiperlipidemia dan diabetes, dilibatkan di dalam studi. Setelah meminum coklat yang mengandung 176 mg flavan-3-ols (terdiri dari 70 mg epikatekin dan katekin, serta 106 mg prosianidin) dalam 100 ml air, dilakukan