2 TINJAUAN PUSTAKA
Percobaan 1. Induksi kalus embriogenik durian dari berbagai eksplan pada berbagai komposisi media
Induksi kalus embriogenik dari eksplan dasar bunga durian
Percobaan induksi kalus dari eksplan dasar bunga disusun dalam percobaan 2 faktor. Faktor pertama adalah komposisi media (14 taraf, Tabel 9) dan faktor kedua adalah genotipe durian (aksesi Dramaga, varietas Simas, dan varietas Matahari). Percobaan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) dengan 4 ulangan, tiap ulangan terdiri atas 5 botol, dan tiap botol berisi 2 eksplan berasal dari satu dasar bunga yang dibelah menjadi 2 bagian. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ±22 ºC.
Tabel 9 Komposisi media yang digunakan dalam percobaan induksi kalus dengan eksplan dasar bunga dan petal
Nomor Komposisi media 1 Media B5 tanpa ZPT 2 Media B5 + NAA 2 ppm 3 Media B5 + NAA 4 ppm 4 Media B5 + NAA 6 ppm 5 Media B5 + pikloram 2 ppm 6 Media B5 + pikloram 4 ppm 7 Media B5 + pikloram 6 ppm 8 Media MS tanpa ZPT 9 Media MS + NAA 2 ppm 10 Media MS + NAA 4 ppm 11 Media MS + NAA 6 ppm 12 Media MS + pikloram 2 ppm 13 Media MS + pikloram 4 ppm 14 Media MS + pikloram 6 ppm Keterangan : semua media menggunakan 30 g/l gula dan 10 g/l agar.
Bunga durian sebagai sumber eksplan diambil pada kondisi kuncup hampir mekar (ukuran panjang ±3 cm, diameter ±1.5 cm, Gambar 3a) karena bunga pada kondisi ini yang paling responsif terhadap induksi kalus (hasil percobaan pendahuluan, data tidak ditampilkan). Bunga dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit sambil terus dikocok, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Bunga dilap dengan tisu steril, kemudian dibuang bagian epicalyx-nya, dipotong dan diambil 1/3 dari pangkal, dibuang bagian calyx, diambil bagian petal, dibuang semua benang sari dan diambil bagian dasar bunga (Gambar 3b sampai 3h) selanjutnya ditanam pada media. Kegiatan perendaman dalam alkohol sampai penanaman dilakukan di dalam LAFC.
Gambar 3 Eksplan dasar bunga dan petal. a: ukuran bunga yang digunakan (tanda panah); b–h: proses sterilisasi sampai eksplan siap tanam. ca: calyx; ec: epicalyx; pt: petal, db: dasar bunga
Induksi kalus embriogenik dari eksplan petal durian
Percobaan induksi kalus dari eksplan petal disusun dalam percobaan 2 faktor. Faktor pertama adalah komposisi media (14 taraf, Tabel 9) dan faktor kedua adalah genotipe durian (aksesi Dramaga, varietas Simas, dan varietas Matahari). Percobaan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) dengan 4 ulangan, tiap ulangan terdiri atas 5 botol, dan tiap botol berisi 5 eksplan berasal dari satu bunga. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ±22 ºC.
Bunga durian sebagai sumber eksplan diambil pada kondisi kuncup hampir mekar (ukuran panjang ±3 cm, diameter ±1.5 cm, Gambar 3a) karena bunga pada kondisi ini yang paling responsif terhadap induksi kalus (hasil percobaan pendahuluan, data tidak ditampilkan). Bunga dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit sambil terus dikocok, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Bunga dilap dengan tisu steril, kemudian dibuang bagian epicalyx-nya, dipotong dan diambil 1/3 dari pangkal, dibuang bagian calyx, diambil bagian petal, dipotong bagian tepi yang tipis (gambar 3b sampai 3f), kemudian ditanam dalam media. Kegiatan perendaman dalam alkohol sampai penanaman dilakukan di LAFC.
Induksi kalus embriogenik dari eksplan endosperm durian
Percobaan disusun sebagai percobaan dua faktor yaitu konsentrasi BA dan TDZ pada media induksi (8 kombinasi perlakuan, Tabel 10). Komposisi media induksi adalah media dasar MS dengan vitamin media B5 yang dilengkapi dengan glutamina 100 ppm, asparagina 100 ppm, kasein hidrolisat 500 ppm, dan pikloram 0.5 ppm. Percobaan dilaksanakan dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan jumlah ulangan 2 sampai 5 ulangan per perlakuan dan tiap ulangan terdiri atas 1 botol. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap dengan suhu ±22ºC. ca b c a d e f g h pt db ec pt
Tabel 10 Komposisi ZPT pada media induksi untuk kultur endosperm No Konsentrasi BAP (ppm) Konsentrasi TDZ (ppm) 1 0 0 2 1 0 3 0 0.01 4 1 0.01 5 0 0.05 6 1 0.05 7 0 0.5 8 1 0.5
Keterangan : Komposisi media induksi adalah media dasar MS dengan vitamin media B5 yang dilengkapi dengan glutamina 100 ppm, asparagina 100 ppm, kasein hidrolisat 500 ppm, pikloram 0.5 ppm, gula 30 g/l dan agar 10 g/l.
Buah muda durian varietas Otong diambil pada umur ± 2 bulan setelah antesis. Daging buah (aril) bersama biji dikeluarkan dari buah, selanjutnya aril dibuang. Biji dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit, kemudian ditiriskan. Tahap selanjutnya dilakukan dalam LAFC. Biji durian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Selanjutnya biji dibuka untuk diambil endosperm dengan embrio didalamnya. Embrio dikeluarkan dari dalam endosperm dan ditanam langsung pada media perlakuan. Endosperm dipotong dengan ketebalan 0.3 sampai 0.5 cm kemudian ditanam pada media perlakuan.
Induksi kalus embriogenik dari eksplan embrio zigotik muda durian Induksi kalus embriogenik dari eksplan embrio zigotik muda durian merupakan percobaan tunggal dengan perlakuan konsentrasi pikloram pada media dasar MS. Taraf konsentrasi yang digunakan adalah 5, 10, 15, dan 20 ppm. Percobaan dilaksanakan dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK).dengan 2 ulangan dan tiap ulangan terdiri atas 1 botol. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ±22 ºC.
Buah muda durian varietas Otong diambil pada umur ± 2 bulan setelah antesis. Daging buah (aril) bersama biji dikeluarkan dari buah, selanjutnya aril dibuang. Biji dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit, kemudian ditiriskan. Tahap selanjutnya dilakukan dalam LAFC. Biji durian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Selanjutnya biji dibuka untuk diambil endosperm dengan embrio didalamnya. Embrio dikeluarkan dari dalam endosperm dan ditanam langsung pada media perlakuan. Embrio zigotik muda yang ditanam adalah embrio utuh yang panjangnya kurang dari 1 cm.
Pengamatan yang dilakukan pada percobaan induksi kalus adalah:
a. Waktu mulai terbentuk kalus dihitung dari tanggal tanam dengan satuan hari. b. Persentase eksplan membentuk kalus, yaitu jumlah eksplan yang membentuk
c. Ukuran kalus yang terbentuk, dibuat skor 1 sampai 5 berdasar perbandingan ukuran kalus terhadap ukuran eksplan awal, diamati pada minggu ke 4. Skor 1 = < 25%, skor 2 = 25-50%, skor 3 = 50-75%, skor 4 = 75-100%, skor 5 = lebih dari 100%.
d. Pengamatan kualitatif terhadap tipe kalus yang terbentuk, (Gambar 4) meliputi pengamatan visual kalus dan pengamatan sel-sel kalus dengan mikroskop terhadap tiap tipe kalus. Pengamatan sel-sel kalus dengan mikroskop dilakukan dengan preparasi langsung untuk kalus remah dan dengan preparasi metode parafin (Lampiran 1) untuk kalus kompak.
Tipe 1: Kalus kompak, warna putih agak kekuningan, kadang-kadang bernodul. Jika sepotong kecil kalus disiapkan di atas kaca obyek, ditutup dengan kaca penutup dan ditekan sel-sel kalus akan hancur, tidak terlihat sel-sel yang berjajar.
Tipe 2: Kalus kompak, warna putih seperti kapas. Jika sepotong kalus disiapkan di atas kaca obyek, ditutup dengan kaca penutup dan ditekan, sel-sel kalus akan hancur, tidak terlihat sel-sel yang berjajar. Tipe 3: Kalus remah berair, transparan agak kecoklatan, jika sepotong kalus disiapkan di atas kaca obyek, ditutup dengan kaca penutup dan ditekan akan terlihat sel-sel yang terpisah berjajar.
Tipe 4: Muncul embrio somatik globular dan kalus agak transparan.
Percobaan 2. Respon kalus tipe 1 durian terhadap konsentrasi BA pada
