Abstrak
Sebagai organisme intertidal dan subtidal, kerang darah Anadara granosa setiap menghadapi lingkungan yang selalu berubah yang seringkali menimbulkan stres. Stres yang distimulasi biasanya dikendalikan oleh gen-gen protein stres. Ada banyak gen protein stres, diantaranya gen heat shock protein (Hsp) seperti Hsp70 yang berfungsi sebagai molecular chaperone dan terekspresi pada kondisi stres. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi dan menganalisis ekspresi gen Hsp70 pada kerang darah sebagai respon terhadap induksii merkuri. Hasil dari penelitian ini mendapatkan bahwa gen Hsp70 kerang darah bersifat spesies spesifik dan berbeda dengan spesies lainnya. Selain itu penelitian ini membuktikan bahwa merkuri mampu menginduksi ekspresi gen Hsp70 yang mana levelnya meningkat pada konsentrasi merkuri tertentu. Hal ini membuktikan bahwa kerang darah memiliki plastisitas yang tinggi dalam mentoleransi logam berata terutama cemaran merkuri. Dengan demikian, gen Hsp70 selanjutnya dapat dimanfaatkan sebagai marka molekuler untuk perairan tercemar.
Kata-kata kunci: gen Hsp70, Anadara granosa, molecular chaperone, acquired character.
Abstract
As an intertidal and subtidal organism, blood cockle Anadara granosa must cope with the ever-changing environment. It constantly generates stress controlled by stress protein genes. There are many stress genes that play an important role in cell protection. Hsp70 gene becomes one of the genes which function as a
molecular chaperone and be expressed under stress condition. The research aimed at exploring the expression of Hsp70 gene in blood cockle responding to mercury induction. The research revealed that mercury was able to induce Hsp70 gene expression which level increased at certain mercury concentration. This
notion suggests that blood cockles have high plasticity to tolerate heavy metals particularly mercury pollution. Additionally, Hsp70 gene may become a good molecular marker in a contaminant habitat.
Keywords: Hsp70 gene, Anadara granosa, molecular chaperone, acquired character.
Pendahuluan
Heat shock protein (Hsp) merupakan protein yang bersifat konserve dan ada pada semua sel prokariot sampai eukariot (Lindquist 1986; Lindquist dan Craig 1988; Farcy et al. 2009). Hsp termasuk dalam famili gen (gene family) karena terdiri dari beberapa gen seperti Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, dan small heat shock proteins (Hsp40 dan Hsp20). Gen Hsp terletak pada berbagai kromosom dari organisme yang sama. Oleh karena sifatnya yang konserve itu, kemiripan heat shock protein manusia dengan Drosophila sebesar 73%, sedangkan dengan E. coli sebesar 50% (Lindquist 1986). Posisi Hsp70 terletak di kromosom 1 sampai 5 pada Arabidopsis (Sung et al. 2001), di kromosom 1, 2, 3, dan X pada Drosophila melanogaster (Gunawardena dan Rykowski 2000), di kromosom 2 pada nyamuk Anopheles darlingi (Raphael et al. 2004), di kromosom 6 dan 18 pada ikan zebra (Yamashita et al. 2010), di kromosom 3, 10 dan 23 pada bovine (Grosz et al. 1992; Gallagher et al. 1993), di kromosom 1,4, 5, 6, 9, 10, 11, 13, 14, 20, dan 21 pada manusia (Grosz et al. 1992; Brocchieri et al. 2008).
Penamaan awal Heat shock protein berdasarkan berat molekul setiap proteinnya, seperti Hsp70, 72, 73, dan lainnya, serta dikelompokkan berdasarkan ukuran umum yang terdekat sebagai contohnya adalah famili gen HSP70. Hsp70 adalah salah satu anggota dari kelompok heat shock protein yang paling banyak ditemukan pada semua sel organisme dengan berat molekul sebesar 70 kiloDalton (Farcy et al. 2009).
Selain berdasarkan berat molekul, Heat shock protein dikelompokkan menjadi isoform constitutive dan inducible. Bentuk Hsp yang constitutive, yaitu protein yang selalu ada dan dinamakan Heat shock cognate (Hsc). Hsc diekspresikan dibawah kondisi fisiologis tanpa induksi dan berperan sebagai
molecular chaperone. Sedangkan bentuk yang inducible dinamakan Heat shock protein (Hsp), yang disintesa oleh sel dibawah kondisi stres dan berperan dalam melindungi sel (Farcy et al. 2009), dan memperbaiki lembar protein yang memproduksi pelipatan akibat stres.
Hsp70 berfungsi sebagai molecular chaperon, yaitu agen molekuler yang dapat membantu mencegah agen molekuler lain dari agregasi yang tidak tepat dan mengembalikan kesalahan pelipatan strukturnya yang rusak selama atau setelah mengalami stres (Lindquist 1986; Feder dan Hofmann 1999). Dengan fungsi tersebut, Hsp70 melipat kembali protein yang terurai ketika terjadi denaturasi parsial (Molina et al. 2000). Oleh karena kemampuan menginduksi beberapa stres proteotoxic intraseluler (kerusakan fungsi sel yang disebabkan oleh kesalahan pelipatan protein) dalam waktu yang cepat, maka Hsp70 dapat
dijadikan biomarker yang sesuai untuk proteotoxicity pada beragam organisme (Feder dan Hofmann 1999).
Gen heat shock protein-70 (Hsp70) memainkan peran penting untuk resistensi stres dan adaptasi lingkungan (Sorensen et al. 2003). Ekspresi Hsp70 diregulasikan oleh stres lingkungan, dan keadaan patofisiologi (Morimoto 1998). Seperti umumnya gen heat shock response (HSR), maka gen Hsp70 merupakan gen responsif yang bersifat universal terhadap beragam stres lingkungan, bukan hanya stres perubahan suhu tetapi juga cekaman logam berat dan stres lainnya (Parsell & Lindquist 1993). Menurut Goering et al. 2000, pada korteks ginjal dan medula tikus muncul perbedaan ekspresi gen Hsp70 sebagai respon terhadap cekaman HgCl2 pada level konsentrasi 0,25; 0,5; dan 1 ppm selama 4. 8, 16, dan 24 jam (Goering et al. 2000).
Sumber material genetik yang diisolasi untuk tujuan eksplorasi Hsc berbeda dengan Hsp. Sumber material untuk analisa Hsc berasal dari DNA genom, sedangkan untuk analisa Hsp berasal dari mRNA transkriptom.
Struktur gen Hsc70 pada beberapa spesies anggota dari kelompok tiram (oyster) Ostrea edulis (Boutet et al. 2003a) maupun Crassostrea gigas (Boutet et al. 2003b) (Gambar 8) dan dari kelompok mussel yaitu Mytilus galloprovincialis
(Kourtidis 2004) terdiri dari promoter, 6 exon, 5 intron, dan terminator. Ukuran gen lengkap Hsc70 pada ketiga jenis bivalvia tersebut masing-masing adalah 2553 bp (kode akses AJ305315), 2569 bp (kode akses AJ305316), dan 3306 bp (kode akses AJ783714). Promotor Hsc70 yang sudah teridentifikasi dengan lengkap adalah pada M. galloprovincialis yaitu promotornya memiliki CAAT box pada situs ke -278 sampai -281, serta TATA box pada situs ke -408 sampai -413 (Kourtidis 2004). Selain itu juga, promotor Hsc70 yang lengkap teridentifikasi pada ikan tilapia O. mossambicus yaitu promotornya memiliki protein binding site dengan CAAT box dan GC rich yang masing-masing terletak pada posisi -272 dan -444 (Molina et al. 2000).
Gen penyandi (Cds) Hsc70 telah berhasil diisolasi dari bivalvia kelompok tiram (oyster) yaitu Ostrea edulis (Boutet et al. 2003a) dan Crassostrea gigas
(Boutet et al. 2003b),; dan kelompok kerang mussel Mytilus galloprovincialis
(Kourtidis et al. 2004). Ukuran masing-masing coding sequence (cds) dari gen Hsc70 tersebut adalah 1801 bp (599 AA) pada kerang C. gigas (Boutet et al. 2003b), 1798 bp (598 AA) pada O. edulis (Boutet et al. 2003a), dan 1969 bp (654 AA) pada M. galloprovincialis (Kourtidis et al. 2004), Sedangkan ukuran cds pada ikan tilapia Oreochromis mossambicus adalah 1920 bp (640 AA) (Molina et al. 2000).
5’ I1 I2 I3 I4 I5 3’
Gambar 8. Struktur gen Hsc70 (Boutet et al. 2003b).
Demikian pula gen penyandi (cds) Hsp70 telah lebih banyak dieksplorasi, seperti pada bivalvia kelompok tiram (oyster) Crassostrea gigas
1980 bp (659 AA) (Kode akses AF144646) (Boutet et al. 2003b), Crassostrea virginica 1905 bp (635 AA) (Kode akses AJ271444) (Rathinam et al. 2000), Crassostrea hongkongensis 1905 bp (635 AA) (Kode akses FJ157365) (Zhang & Zhang 2008), dan Ostrea edulis 1797 bp (599 AA) (Kode akses AJ305316)
(Boutet et al. 2003a); kelompok mussel Mytilus galloprovincialis 1965 bp (654 AA) (Kode akses AY861684) (Cellura et al. 2006); kelompok clam Meretrix meretrix 1959 bp (653 AA) (Kode akses HQ256748 (Yue & Liu 2011); kelompok scallop Argopecten irradians 1980 bp (660 AA) (Kode akses AY485261) (Song et al. 2006), Argopecten purpuratus 1965 bp (655 AA) (Kode akses FJ839890) (Gonzales et al. 2009), dan Pinctada fucata 1959 bp (653 AA) (Kode akses EF011061) (Wang et al. 2009).
Persentase kesamaan sekuen nukelotida dan asam amino antara Hsc70 dengan Hsp70 pada O. edulis adalah 94,1% nukleotida dan 87,2% asam amino (Boutet et al. 2003a). Pada C. gigas masing-masing adalah 98,4% dan 99,3% (Boutet et al. 2003b). Sedangkan pada M. galloprovincialis adalah 99,4% nukleotida dan 98,8% asam amino (Kourtidis et al. 2004; Cellura et al. 2006).
Baik gen heat shock inducible maupun constitutive 70 belum pernah diisolasi dari “ bivalvia kelompok cockle “ terutama dari daerah tropis seperti
Anadara granosa. Bahkan dari takson yang lebih tinggi yaitu famili kerang cockle Arcidae, gen Hsp dan Hsc 70 belum pernah diisolasi.
Kerang darah Anadara granosa merupakan bivalvia epifauna komersial yang mendiami permukaan substrat lumpur berpasir pada perairan intertidal (Broom 1985). Daerah yang potensial bagi pemanfaatan sumberdaya kerang darah adalah di pesisir pulau-pulau di Indonesia. Sebagaimana halnya hewan- hewan intertidal, kerang darah mengalami stres dari lingkungan yang fluktuatif setiap saat terutama pengaruh akumulasi logam berat di dalam kolom air dan substrat. Batas toleransi kerang darah terhadap konsentrasi logam berat “ bersifat plastis”. Diduga batas toleransi ini berkorelasi erat dengan perubahan ekspresi famili gen Hsp70. Dengan demikian, kerang darah dapat dijadikan sebagai hewan model yang bermanfaat untuk mempelajari mekanisme toksisitas merkuri dan toleransinya terhadap logam berat ini.
Oleh karena itu penting diteliti karakterisasi gen Hsp70 dari Anadara granosa sehingga didapatkan informasi mengenai gen ini melalui pendekatan amplifikasi secara parsial dari sumber cDNA total dengan teknik RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). Teknik RT-PCR telah berkembang pesat dalam analisis genom dan berhasil menganalisa berbagai gen baik secara parsial maupun komplit seperti gen Cu/Zn SOD (Rojo et al. 2004; Sunkar et al. 2006), GAPDH (Barber et al. 2005), NaK-ATPase (Tine et al. 2010 ), Mn SOD, Ec SOD, CAT, GSS, GSR (Corrales et al. 2011), fibroin (Zhou
et al. 2000). Teknik ini juga telah berhasil mengeksplorasi Hsp70 dari berbagai spesies seperti Drosophila melanogaster (Bettencourt et al. 2008), ikan tilapia (Tine et al. 2010), domba (Gade et al. 2010), dan manusia (Corales et al. 2011).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengkarakterisasi gen Hsp70 dan menganalisis ekspresi gen Hsp70 sebagai respon terhadap induksi berbagai konsentrasi logam berat merkuri pada kerang darah yang berasal dari perairan pesisir provinsi Banten.
(a) Isolasi RNA total, (b) sintesa cDNA, dan (c) amplifikasi gen penyandi hsp70 dari Anadara granosa (AgHsp70).
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermafaat dalam:
1. Penggunaan gen hsp70 sebagai marka molekuler untuk stress lingkungan. 2. Menentukan populasi yang paling adaptif untuk keperluan bioremediasi
dan restocking.
Alur penelitian (Road map) penelitian ini didasarkan pada pertimbangan dan alasan sebagai berikut ini (gambar 9).
Bahan Dan Metode Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel kerang darah dilakukan di dua perairan di propinsi Banten, yaitu Bojonegara- Teluk Banten dan Panimbang-Teluk Lada. Kerang darah dibawa ke laboratorium dan ditempatkan pada akuarium yang terpisah yang berisi air laut. Selanjutnya kerang darah diaklimatisasi selama 48 jam sebelum dilakukan cekaman logam berat.
Indukasi HgCl2
Sampel kerang darah dipaparkan pada tiga konsentrasi HgCl2, yaitu 1, 2, dan 10 ppm selama 24 dan 48 jam. Kerang darah kontrol dibiarkan tanpa perlakuan merkuri. Jumlah kerang darah pada setiap perlakuan masing-masing tiga individu. Ukuran kerang darah yang dianalisis adalah 2.753 ± 0.427 cm. Rancangan percobaan yang diterapkan adalah rancangan acak kelompok (RAK). Pada akhir periode perlakuan merkuri, insang kerang darah diambil dan dibilas untuk digunakan pada analisis histologi insang dan isolasi RNA.
Isolasi RNA
Insang diekstraksi untuk analisa RNA total, dengan menggunakan GeneJet RNA Purification Kit (Thermo Scientific Inc.). Berat insang yang digunakan untuk isolasi RNA adalah 5 mg. Prosedur isolasi mengikuti manual pabrik. Integritas RNA diperoleh dengan memasukkan sample ke dalam gel agarose 1,2% dan dilarikan pada mesin elektroforesis. Sampel RNA dimonitor di bawah UV transluminator. Kemurnian RNA diukur dengan spektrofotometer.
Gambar 9. Alur penelitian (Road map) gen Hsp70 Anadara granosa.
Sintesa cDNA
Transkripsi balik cDNA dilakukan dengan menggunakan RevertAid Transcriptase (Thermo Scientific Inc.). Prosedur Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ini mengikuti manual pabrik. Sampel hasil sintesis cDNA digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi cDNA.
Amplifikasi gen Hsp70
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen Hsp70 adalah dengan mendisain dua macam primer. Primer pertama didisain sendiri dengan menggunakan degerate primer FH70.deg dan RH70.deg dengan mengurutkan beberapa spesies bivalvia. Produk PCR yang diharapkan dari pasangan primer tersebut adalah 728 bp. Pasangan primer kedua yang digunakan FH70 dan RH70 untuk mengamplifikasi sekuen parsial gen Hsp70 dari Anadara granosa
(Tabel 4). Primer tersebut didisain sendiri berdasarkan sekuen gen Hsp70 dari oyster Crassostrea gigas, nomor akses GenBank AF_144646, dengan
Sebaran dan perkembangan hidup A.granosa Data genbank gen Hsp70 Data Hsp70 pada berbagai bivalvia Produk PCR gen Hsp70 parsial pada Anadara
granosa Disain primer Hsp70
berdasarkan sekuen bivalvia
Sekuensing gen Hsp70 parsial Anadara granosa
(526 bp) Alignment gen Hsp70 parsial A. granosa dengan bivalvia lainnya Purifikasi RNA Anadara granosa Sintesa cDNA Anadara granosa Karakterisasi gen Hsp70 pada A. granosa Marka molekuler untuk stres lingkungan
menggunakan program Primer3. Adapun produk PCR yang diharapkan adalah sebesar 526 bp.
Tabel 4. Primer yang digunakan untuk amplifikasi cDNA Anadara granosa
Nama
primer Sekuen Primer
Produk PCR (bp) No akses GenBank FH70.deg 5’-CGCAARCACAAGAARGAC-3’ 728 AJ_783714
RH70.deg 5’- CGACCTTTGTCYTTYGTYATGGTG-3’ AJ_271444
FH70 5'-AAGCTAGACAAGGCCCAGAT-3'
526 AF_144646
RH70 5'-TGTTCTCCTTTCCTGTGCTC-3'
Komposisi bahan-bahan PCR terdiri dari 3 µl cDNA ditambah dengan buffer Kapa2G Fast 5 µl; MgCl2 2.5 µl; dNTP, primers, and DMSO masing- masing 1 µl; Taq polymerase 0.2 µl, dan double distilled water sampai campuran mencapai volume 25 µl (Kapa Biosystem). PCR dilakukan dengan menggunakan mesin AB Verity dan Biometra. PCR dilakukan pada kondisi pra denaturasi 940C (3 menit), denaturasi 940C (45 detik). Penempelan primer Hsp70 pada suhu 50,50C, dengan waktu penempelan 1,5 menit. Pemanjangan 720C (1 menit). PCR dilakuan sebanyak 35 siklus. Pasca PCR 720C (7 menit), dan pendinginan 150C (10 menit). Produk PCR dimasukkan pada 1,2% gel agarose yang dijalankan dengan menggunakan mesin elektroforesis selama 60 menit. Integritas produk PCR kemudian dilihat dibawah UV transluminator. Skoring dilakukan pada ekspresi gen Hsp70 dengan menganalisis ketebalan pita PCR setiap sampel. Hal ini diperlukan untuk menilai level relatif ekspresi gen Hsp70.
Pengurutan dan Analisis Urutan DNA
Pengurutan sampel DNA gen Hsp70 dari individu yang berbeda dilakukan dengan menggunakan mesin sekuenser. Pengurutan (sequencing) masing-masing sampel lengkap dua arah baik forward maupun reversenya. Pengerjaannya dilakukan di perusahaan jasa sekuensing. Analisa kesejajaran gen β aktin dilakukan dengan menggunakan program MEGA4 (Tamura et al. 2007). Rekonstruksi kedekatan antar sampel dilakukan dengan membuat pohon filogeni berdasarkan jarak genetik antar nukleotida (nt) maupun asam amino (AA) secara berpasangan menggunakan nilai p distance. Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan Neighbor Joining (NJ) yang diulang dengan menggunakan metoda Bootstrap 1000x (Tamura et al. 2007).
Hasi Hasil
Isolasi RNA Total
RNA total telah berhasil di telah diberi cekaman logam berat kontrol 0 ppm. Untuk melihat int pada elektroforesis dengan vol menunjukkan pita RNA dengan dua RNA dengan spektrofotometer m 1,902. Dengan integritas dan kem dapat digunakan sebagai cetakan unt
Gambar 10. Hasil elektroforesis R menunjukkan dua pi
Amplifikasi cDNA dari gen Hsp
Sintesis cDNA total Transcriptase (Thermo Scientifi kualitas yang diinginkan. Hal menggunakan housekeeping gene
ditunjukkan dengan hasil pita Dengan demikian hasil tersebut teramplifikasinya gen target. A Hsp70 telah dirancang dengan RH70.deg setelah beberapa kali band (Gambar 11), sehingga pe Sedangkan amplifikasi cDNA tot primer FH70 dan RH70 telah m 12). Selanjutnya fragmen ini di
granosa (AgHsp70). Posisi gen H dengan gen Hsp70 Crassostrea
13).
asil dan Pembahasan
sil diisolasi dari kerang darah Anadara granosa ya rat merkuri pada konsentrasi 1, 2, dan 10 ppm, se t integritas RNA total, maka sampel RNA dilarika voltase 85 volt selama 30 menit. Gambar
n dua pita RNA ribosomal. Pengukuran kemurni r menunjukkan nilai kisaran antara 1,582 sampa kemurnian RNA total yang tinggi ini, maka sampl kan untuk sintesa cDNA total.
sis RNA total dari kerang darah Anadara granosa
pita RNA ribosomal 28S dan 18S.
sp70 Anadara granosa dengan PCR
l dengan RT-PCR menggunakan RevertA ntific Inc.) berhasil baik secara kuantitas maupun
al ini terbukti dengan berhasilnya pendeteksi
gene β-aktin yang ekspresinya sangat baik ya a ekspresi (kualitatif) yang tebal dan konsiste sebut telah memungkinkan terbukanya pelua Amplifikasi cDNA total untuk mendapatkan ge
an pasangan primer degenerate FH70.deg da li optimasi, menghasilkan produk PCR yang mul penggunaan primer tersebut tidak dilanjutka total gen Hsp70 dengan menggunakan pasang h menghasilkan fragmen cDNA gen target (Gamba
dinamakan dengan fragmen gen Hsp70 Anadara
n Hsp70 A. granosa setelah dilakukan pensejajar
a gigas, terletak pada situs 990 – 1519 (Gamba 28S 18S yang , serta rikan r 10 urnian mpai mple nosa rtAid upun ksian yaitu konsisten. luang n gen g dan multi utkan. ngan mbar nadara jaran mbar
Gambar 11. Amplifikasi diinduksi degenerate Gambar 12. Amplifikasi diinduksi m dan RH70 2:Panimbang Pengurutan sekuen masing menghasilkan 530 bp Untuk membuktikan bahwa gen Hsp70, maka dilakuka dibandingkan dengan sekue GenBank dengan mengguna memiliki kemiripan terde kemiripan terjauh 76% denga menggunakan MEGA4.
granosa adalah 94% dan 87% (Gambar 14 dan 15). D bivalvia. Sebagai contoh, Hsp70 jenis bivalvia lainn amino antara A. granosa de 25% dan 13.3 – 30.6% (Lam 500 bp
asi gen Hsp70 kerang darah Anadara granosa
nduksi merkuri, dengan menggunakan pasangan te FH70deg dan RH70.deg
M 1 2 3
asi gen Hsp70 kerang darah Anadara granosa
nduksi merkuri, dengan menggunakan pasangan prime 70. M:DNA ladder 100bp; 1:Bojonegara bang 1ppm; 3:Bojonegara 1ppm.
kuen nukleotida dan asam amino gen AgHsp70 0 bp nukleotida dan 176 asam amino (Lampiran 3 hwa gen target yang diisolasi dari A. granosa adala kukan pengurutan nukleotida dan asam amino ekuen dari spesies moluska lainnya yang diam ggunakan BLASTn (Tabel 5). Urutan gen A rdekat 94% dengan Tegillarca granosa, se engan Mus musculus. Selanjutnya data dianalisis 4. Kemiripan sekuen antara A. granosa dan Te
n 87% masing-masing untuk nukleotida dan asam Dengan demikian, gen Hsp70 spesifik untuk
h, gen Hsp70 untuk kerang darah berbeda den innya. Jarak genetik berdasarkan nukleotida da
dengan bivalvia lainnya masing-masing adalah ampiran 5 dan 6). granosa yang an primer granosa yang imer FH70 ra 1ppm; sp70 masing- n 3 dan 4). dalah benar ino yang ambil dari n AgHsp70 sedangkan isis dengan Tegillarca sam amino uk spesies dengan gen dan asam lah 23.45 -
Gambar 13. Alignment gen Hsp70 kerang darah Anadara granosa terhadap gen Hsp70 Crassostrea gigas AB549340.1.
Tabel 5. Hasil alignment dengan BLASTn gen Hsp70 dari cDNA kerang darah yang dibandingkan dengan spesies lainnya
No akses Deskripsi Skor
maks Total skor Query coverage E- value Maks. Ident. JN936877.1 Tegillarca granosa
heat shock protein 70 mRNA, complete cds 807 807 99% 0.0 94% DQ660140.1 Macrobrachium nipponense heat shock cognate 70 (hsc70) mRNA, complete cds 453 453 98% 5e- 124 80% EF011061.1
Pinctada fucata heat shock protein 70 (hsp70) mRNA, complete cds 443 443 99% 9e- 121 79% AY206871.1
Chlamys farreri heat shock protein 70
(hsp70) mRNA, complete cds
428 428 95% 2e-
116 79%
Gambar 14. Pohon filogeni gen Hsp70 dari beberapa spesies bivalvia, berdasarkan sekuen nukleotida (530 bp) dan dikonstruksi dengan metoda Neighbor-Joining
A. irradians C. farreri M. galloprovincialis P. penguin A. granosa T. granosa P. fucata C. gigas O. edulis C. virginica 100 100 100 26 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Scallop Mussel Cockle Oyster
Gambar 15. Pohon filogeni gen Hsp70 dari beberapa spesies bivalvia, berdasarkan sekuen asam amino (176 AA) dan dikonstruksi dengan metoda Neighbor-Joining
Ekspresi Gen Hsp70
Gambar 16 menunjukkan level relatif dari ekspresi gen Hsp70 sebagai respon terhadap berbagai konsentrasi merkuri yang diinduksikan pada kerang darah Anadara granosa. Gen Hsp70 dari kerang darah kontrol menunjukkan ekspresi yang minimal. Dengan adanya peningkatan konsentrasi merkuri, ekspresi gen Hsp70 juga terlihat meningkat sampai pada konsentrasi 1 ppm selama pemaparan 48 jam. Level relatif ekspresi gen Hsp70 lebih tinggi pada kerang darah asal Bojonegara dibandingkan dengan yang berasal dari Panimbang. Gen Hsp70 terekspresi pada semua perlakuan merkuri, kecuali pada kerang darah asal Panimbang yang dipaparkan pada konsentrasi merkuri 2 ppm selama 48 jam. Ekspresi gen Hsp70 tidak hanya dipengaruhi oleh konsentrasi merkuri, tetapi juga oleh periode lamanya pemaparan oleh merkuri.
Gambar 16. Level relatif ekspresi gen Hsp70 gene pada kerang darah yang diinduksi merkuri 1 = 0 ppm; 2 = 1 ppm, 24 jam; 3 = 1 ppm, 48 jam; 4 = 2 ppm, 24 jam; 5 = 2 ppm, 48 jam; 6 = 10 ppm, 24 jam.
A. irradians C. farreri P. fucata P. penguin A. granosa T. granosa C. gigas O. edulis M. galloprovincialis C. virginica 93 78 98 45 41 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 le v e l r e la ti f e k sp r e si g e n H sp 7 0 Konsentrasi merkuri Bojonegara Panimbang AY485261.1 AY206871.1 EU822509.1 EF011060.1 JN936877 AB549340.1 AF416608.1 AY861684.1 AJ271444.1
Pembahasan
Kerang darah dilengkapi dengan sistem sirkulasi terbuka, sehingga adanya perubahan lingkungan akan segera terefleksikan saat insang menyerap air. sehingga insang didisain secara khusus untuk efisiensi pertukaran oksigen dan bahan-bahan terlarut lainnya. Namun demikian, disain morfologi ini menyebabkan juga tersaringnya logam berat yang mengakibatkan bioakumulasi. Kontaminasi logam berat di ekosistem perairan menjadi masalah utama yang sering menjadi perhatian. Logam berat bersifat persisten dan berpotensi membahayakan kehidupan organisme perairan. Dan merkuri merupakan salah satu logam berat yang bersifat toksik.
Gen Hsp70 dari kerang darah A. granosa yang berasal dari perairan pesisir Propinsi Banten dapat terekspresi baik diberi induksi HgCl2 dengan konsentrasi 1 ppm selama waktu pemaparan 24 dan 48 jam, maupun tanpa induksi. Menurut Fabbri et al. (2008), ekspresi Hsp70 muncul pada Crassostrea gigas setelah 8 jam pemaparan pada Hg2+ dan pada Mytilus galloprovinciallis muncul setelah enam hari pemaparan. Berdasarkan uji laboratorium, kerang Macoma balthica yang dipaparkan dengan merkuri pada konsentrasi 1 ppm selama 24 jam menghambat semua aktifitas pembenaman. Pemulihan hewan uji di dalam akuarium bersih selama 15 hari setelah pemaparan pada merkuri, tidak mengembalikan aktifitas pembenaman ke keadaan semula (Eldon et al. 1980).
Penelitian ini juga membuktikan bahwa peningkatan konsentrasi merkuri tidak hanya menyebabkan terekspresinya gen Hsp70, tetapi juga menyebabkan perubahan histologi insang. Berdasarkan pernyataan Goering et al. (2000), Hamdoun et al. (2003), Tine et al. (2010), dan Metzger et al. (2012) bahwa lingkungan fisik dan kimiawi seperti suhu, salinitas, logam berat, dan lainnya dapat menstimulasi stres yang menyebabkan terjadinya ekspresi gen Hsp70. Merkuri merupakan salah satu induktor yang efektif untuk menstimulasi stres (Goering et al. 2000).
Gen Hsp70 terekspresi tidak hanya pada kerang darah yang diinduksi logam berat tetapi juga pada kerang darah kontrol. Menurut Wang et al. (2004), dalam kondisi normal gen Hsp70 berfungsi untuk membantu pelipatan dan penempatan protein. Goering et al. (2000) menyatakan bahwa gen Hsp70 selanjutnya bertugas sebagai pelindung sel (cytoprotector).
Gen Hsp70 yang diisolasi dari kerang darah memiliki kemampuan sebagai
molecular chaperone ketika dipaparkan pada konsentrasi merkuri 1 ppm selama 48 jam. Namun demikian, peningkatan konsentrasi merkuri dengan periode pemaparan yang lebih lama menyebabkan perbedaan ekspresi gen Hsp70. Kerang darah Bojonegara masih mampu mengekspresikan gen Hsp70 pada tingkat ekspresi yang rendah. Di lain pihak, kerang darah asal Panimbang kemampuannya berkurang dalam mengekspresikan gen Hsp70 ketika level merkuri dinaikkan. Pada kondisi ini, luka pada insang lebih parah dan nekrosis sudah terjadi. Alasan yang kuat untuk menjawab permasalahan adalah berkurangnya kemampuan gen Hsp70 untuk mensintesa protein sehingga tidak lagi mampu untuk melindungi sel, dan sel menjadi lebih sensitif terhadap induksi