PENDAHULUAN
Latar Belakang
Anturium adalah tanaman hias daun yang termasuk keluarga Araceae.
Anthurium plowmanii Croat lebih dikenal dengan nama umum AnthuriumWave of
Love (Anturium Gelombang Cinta) karena bentuk daunnya yang bergelombang.
Anthurium Wave of Love berkerabat dekat dengan sejumlah tanaman hias populer seperti aglonema, pilodendron, keladi hias, caladium, dan alokasia (Redaksi Agromedia, 2008).
Anturium menjadi tanaman hias yang populer pada pertengahan 2006
sampai September 2007. AnthuriumWave of Love merupakan jenis anturium yang
paling diminati. Daya tarik utama dari anturium adalah bentuk daunnya yang indah, unik, dan bervariasi. Daun tanaman ini umumnya berwarna hijau tua dengan urat dan tulang daun besar dan menonjol (Redaksi Agromedia, 2008).
Keragaman genetik Anthurium Wave of Love pada dasarnya bisa
dihasilkan dengan cara hibridisasi konvensional, namun cara ini dinilai kurang
efisien karena untuk mendapatkan tanaman Anthurium Wave of Love yang
berbunga diperlukan waktu yang cukup lama dan keberhasilan persilangan juga tidak mudah. Teknik persilangan konvensional menghasilkan keragaman terbatas dan akan bersegregasi pada generasi berikutnya, sehingga diperlukan waktu yang lebih lama untuk menguji kestabilan karakter yang diinginkan. Keragaman genetik diharapkan akan menghasilkan keragaman fenotipe tanaman yang sangat diperlukan terutama pada tanaman hias. Alasan lain yang mendorong perlunya induksi mutasi adalah karena anturium termasuk tanaman berumah satu yang waktu masaknya putik dan tepung sari tidak bersamaan. Pada umumnya putik masak lebih awal dibandingkan tepung sari. Diperlukan cara yang lebih efisien
untuk menginduksi keragaman genetik tanaman Anthurium Wave of Love (Briggs,
1987).
Menurut Harten (2001) mutasi induksi merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan untuk menginduksi keragaman genetik suatu spesies tanaman. Mutasi induksi dapat meningkatkan keragaman genetik tanaman dan kultivar baru
dapat diperoleh dalam waktu yang lebih singkat dibandingkan melalui pemuliaan secara konvensional.
Cassells (2002) melaporkan bahwa mutasi induksi dapat dikombinasikan
dengan kultur in vitro untuk memperbaiki karakter suatu spesies dan memacu
keragaman genetik yang lebih tinggi. Radiasi pada kultur in vitro memberi
peluang terjadinya mutasi, bahkan dari mutasi tersebut dapat diperoleh genotipe
yang tidak ditemukan dalam gene pool yang ada. Welsh (1991) juga melaporkan
bahwa laju mutasi dari sel-sel yang ditumbuhkan pada kultur jaringan lebih tinggi daripada tanaman yang tumbuh dari biji. Kultur jaringan sering menyebabkan perubahan-perubahan nukleotida yang disebabkan oleh kandungan zat di dalam medium, seperti giberelin, auksin dan garam mineral.
Menurut Harten (1988) perlakuan mutasi induksi secara fisik, yaitu dengan radiasi lebih efektif daripada mutasi induksi secara kimiawi. Keuntungan penggunaan mutagen fisik adalah penetrasinya lebih kuat dalam jaringan tanaman, mudah diaplikasikan, serta frekuensi mutasi genetik tinggi.
Salah satu jenis mutagen fisik yang banyak dimanfaatkan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman adalah sinar gamma. Sinar gamma tidak mempunyai massa dan muatan listrik sehingga dikelompokkan ke dalam gelombang elektromagnetik. Sinar gamma tidak dibelokkan oleh medan listrik yang ada di sekitarnya, sehingga daya tembus sinar gamma lebih besar dibandingkan dengan daya tembus partikel alpa atau beta (Batan, 1972). Penggunaan sinar gamma dinilai efektif untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman anturium.
Pemanfaatan sinar gamma untuk meningkatkan keragaman genetik
tanaman Anthurium Wave of Love belum pernah dilaporkan dalam publikasi
ilmiah, namun sinar gamma telah banyak dimanfaatkan untuk induksi mutasi beberapa tanaman hias komersial. Pada tanaman hias famili Araceae, mutasi
induksi dengan sinar gamma sudah dilakukan terhadap tanaman Caladium spp.
(Nariah, 2008), Philodendron bipinnatifidum dan Philodendron xanadu
Tujuan
1. Mendapatkan taraf dosis radiasi sinar gamma dari 60Co yang tepat untuk
menginduksi keragaman genetik tanaman Anthurium Wave of Love
(Anthurium plowmanii Croat.)
2. Mendapatkan LD50 tanaman Anthurium Wave of Love (Anthurium plowmanii
Croat) yang dikulturkan secara in vitro
3. Menghasilkan mutan Anthurium Wave of Love (Anthurium plowmanii Croat.)
yang potensial untuk diteliti lebih lanjut
Hipotesis
1. Terdapat taraf dosis radiasi sinar gamma dari 60Co yang tepat untuk
meningkatkan keragaman genetik tanaman Anthurium Wave of Love
(Anthurium plowmanii Croat.).
2. Terdapat minimal satu mutan AnthuriumWave of Love (Anthurium plowmanii
Croat.) yang memiliki fenotipe tanaman in vitro yang berbeda dari tanaman
TINJAUAN PUSTAKA
Botani dan Morfologi Tanaman AnthuriumWave of Love
Tanaman Anthurium Wave of Love termasuk ke dalam famili Araceae,
berbatang sukulen dan termasuk tanaman perennial. Ciri utama famili Araceae adalah bunganya memikili spadiks (tongkol) dan seludang (Macoboy, 1976).
Habitat asal tanaman anturium tersebar dari selatan dan utara Brazil sampai ke Peru, Bolivia dan Paraguay. Tanaman ini ditemukan di Brazil di daerah Amazon dan di Peru pada ketinggian 50 m - 900 m di atas permukaan laut. Anturium bukan tanaman asli Indonesia, tetapi tanaman ini cocok dengan keadaan iklim di daerah tropis.
Taksonomi tanaman AnthuriumWave of Love sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Kelas : Liliopsida
Ordo : Araceales
Famili : Araceae
Genus : Anthurium
Spesies : Anthurium plowmanii Croat.
Daun AnthuriumWave of Love dapat tumbuh mencapai panjang 56 cm dan
tepinya bergelombang. Warna daun umumnya didominasi oleh hijau tua. Susunan
daun biasanya tegak (erect) dan menyebar. Umumnya panjang petiol Anthurium
Wave of Love 10 cm - 40 cm, namun ada juga petiol yang panjangnya mencapai
50 cm. Tanaman AnthuriumWave of Love tidak bercabang dan tunas-tunas baru
muncul dari batang. Batang Anthurium Wave of Love terdapat di dalam tanah.
Bagian yang menjulur ke atas merupakan tangkai daun, bukan bagian dari
batang1.
Anthurium Wave of Love mempunyai spatha dan spadiks. Ada beberapa
pendapat yang mengatakan bahwa spatha merupakan bunga palsu karena spatha
adalah modifikasi dari daun yang berfungsi untuk melindungi spadiks1.
1.
Proses Mutasi Genetik Tanaman akibat Radiasi Sinar Gamma
Brewbaker (1983) melaporkan bahwa sinar gamma dapat diperoleh dari isotop radioaktif yang diproduksi dalam reaktor nuklir. Radiasi sinar gamma menyebabkan proses ionisasi, yaitu menghasilkan ion-ion positif dan negatif. Ionisasi terjadi saat elektron berinteraksi dengan atom materi yang dilewatinya. Setiap proses ionisasi menyebabkan pemindahan sebuah elektron dari satu atom ke atom lainnya. Proses ini membutuhkan energi lokal yang cukup besar. Sepasang atom yang mengalami ionisasi tersebut berada pada keadaan tidak stabil dan sangat reaktif.
Crowder (1986) melaporkan bahwa radiasi sinar gamma menembus bagian tertentu dari gen, dan menyebabkan perubahan susunan basa nitrogen pada DNA. Frekuensi mutasi berbanding lurus (linear) dengan dosis radiasi sinar gamma. Menurut Welsh (1991) radiasi bisa mengakibatkan efek langsung ataupun tidak langsung terhadap DNA. Efek langsung yang segera terjadi dari proses ionisasi adalah pemotongan DNA. Interaksi radiasi dengan DNA dapat menyebabkan terjadinya perubahan struktur gula atau basa nukleotida dan putusnya ikatan hidrogen antar basa nukleotida. Kerusakan lain yang mungkin terjadi adalah
putusnya salah satu untai DNA yang disebut single strand break atau putusnya
kedua untai DNA yang disebut double strand break. Kerusakan dapat terjadi pada
tingkat DNA, kromosom dan pada tingkat sel. Akibat tidak langsung yaitu radiasi sinar gamma menimbulkan perubahan zat kimia tertentu di sekitar gen yang menghasilkan perubahan susunan nukleotida.
Gen dapat dianggap sebagai suatu target atau sasaran di dalam proses mutasi. Menurut Brewbaker (1983) mutasi genetik yang terjadi pada sebuah target hanya bergantung pada jumlah ionisasi dan tidak bergantung pada lamanya waktu ionisasi. Perubahan yang terjadi untuk menghasilkan mutasi genetik bisa terjadi pada tingkat gen atau tingkat kromosom. Menurut Claire (2002) perubahan nukleotida tunggal di dalam rantai cetakan DNA mengakibatkan produksi protein yang abnormal. Gen menentukan fenotipe melalui enzim yang mengkatalis reaksi kimia yang spesifik di dalam sel.
Secara alamiah sel mempunyai kemampuan untuk melakukan proses perbaikan terhadap kerusakan yang timbul dengan menggunakan beberapa jenis
enzim yang spesifik. Proses perbaikan dapat berlangsung tanpa terjadi kesalahan sehingga struktur DNA kembali seperti semula dan tidak menimbulkan perubahan struktur pada sel. Pada kondisi tertentu, proses perbaikan tidak berjalan dengan sempurna sehingga walaupun kerusakan dapat diperbaiki, tetapi tidak seperti DNA aslinya. Tingkat kerusakan sel yang sangat parah mengakibatkan perbaikan
tidak berlangsung dengan baik, bahkan bisa mengakibatkan kematian sel2.
Aplikasi Mutasi Radiasi dengan Sinar Gamma pada Tanaman Hias
Mutasi adalah proses suatu gen yang mengalami perubahan struktur untaian basa nukleotida. Mutasi diartikan juga sebagai perubahan permanen pada DNA dan akan merubah rantai asam amino yang terbentuk. Perubahan untaian DNA akan menyebabkan fenotipe tanaman juga berubah. Radiasi adalah istilah yang digunakan untuk berbagai bentuk pancaran energi seperti pancaran cahaya, pancaran panas, pancaran radio dan sinar ultra violet (Welsh, 1991).
Mutasi induksi dengan radiasi sinar gamma sudah cukup luas digunakan. Sinar gamma tidak memiliki massa dan muatan, sehingga bisa menembus jaringan dalam sel. Pengaruh radiasi sinar gamma dapat menyebabkan perubahan genetik di dalam sel somatik (mutasi somatik) dan sel gamet, perubahan tersebut dapat diturunkan dan dapat menyebabkan terjadinya perubahan fenotipe. Perubahan dapat terjadi secara lokal pada tingkat sel atau kelompok sel sehingga individu dapat menjadi kimera (Welsh, 1991).
Mutasi telah diamati oleh beberapa peneliti dari berbagai negara sejak beberapa abad yang lalu. Dari Jepang dilaporkan bahwa pada akhir abad ke-17,
seorang warga Edo (sekarang Tokyo) mempunyai tanaman hias ”morning glory”
yang bunganya menyimpang dari tanaman-tanaman lainnya. Beberapa peneliti sudah menduga bahwa terjadi mutasi genetik secara spontan yang menyebabkan perubahan warna pada bunga tanaman tersebut, namun mereka belum punya alasan yang kuat untuk menjelaskan fenomena yang terjadi pada waktu itu (Harten, 2001).
Harten (2001) juga melaporkan bahwa sebenarnya konsep mutasi sudah
lama diketahui. Charles Darwin, dalam bukunya tahun 1868 yang berjudul ”The Variation of Animals and Plants under Domestication” telah menemukan adanya 2.
variasi pada daun dan bunga, namun beliau belum bisa mengemukakan alasan pada saat itu. Fenomena mutasi spontan (mutasi alami) inilah yang mendorong para peneliti untuk melakukan mutasi buatan.
Mutasi buatan dengan sinar-X baru berhasil dilakukan pada tahun 1928 untuk tanaman tembakau dan pada tahun 1930an mutan komersial tembakau mulai dilepas. Pada tanaman hias, mutasi buatan secara komersial pertama kali dilakukan oleh De Mol van Oud dari Belanda pada tahun 1949 pada tanaman tulip (Tulipa sp), warna bunga tulip menjadi menyimpang dengan aslinya. Mutasi ini sudah dilakukan mulai tahun 1936 dengan radiasi sinar-X pada bulb, namun 13 tahun kemudian baru bisa menghasilkan kultivar baru. Mutasi warna bunga pada tulip kultivar Estella pada 1954 juga dilakukan oleh De Mol van Oud. Pada
tahun 1962 peneliti dari Amerika melakukan radiasi sinar gamma pada Dianthus
caryophyllus dengan menggunakan akar sebagai bahan yang diradiasi (Harten, 1988).
Pemuliaan mutasi pada tanaman hias sudah sangat berkembang.
Pengembangan ini diarahkan untuk sifat-sifat seperti warna bunga, vase life untuk
tanaman hias pot dan bunga potong, dan keragaman corak daun untuk tanaman hias daun. Selama 30 tahun terakhir, perkembangan mutan komersial untuk
tanaman hias sudah banyak dilaporkan. Informasi dari IAEA (International
Atomic Energy Agency) tahun 1998 menyatakan bahwa ada 500 kultivar mutan dari 30 jenis tanaman hias yang sudah didaftarkan.
Induksi Mutasi pada Famili Araceae
Nariah (2008) melakukan percobaan radiasi sinar gamma secara in vivo
pada 4 kultivar Caladium spp. Dari penelitian tersebut dilaporkan bahwa nilai
LD50 pada Caladium kultivar Candidum yaitu 61.80 Gy, Caladium kultivar Sweet
Heart 83.85 Gy, Caladium kultivar Pink Beauty 113.93 Gy dan 50.68 Gy pada Caladium kultivar Miss Mufet. Mutan albino dan mutan kerdil dihasilkan dari
Caladium kultivar Sweet Heart. Mutan kerdil dan daun berbentuk seperti corong
dihasilkan dari Caladium kultivar Pink Beauty.
Melina (2008) melakukan induksi mutasi dengan sinar gamma pada dua
Crocodile Teeth dan Philodendron xanadu. Radiasi sinar gamma menurunkan persentase tanaman Pilodendron yang hidup, menghambat pertumbuhan tinggi
tanaman, menurunkan jumlah daun dan ukuran daun. Pada P. bipinnatifidum
kultivar Crocodile Teeth, dosis 10 Gy mampu menginduksi pertambahan tinggi
tanaman, ukuran daun dan jumlah daun. Semakin tinggi dosis yang diberikan, semakin mengubah warna dan bentuk daun dari kedua spesies Pilodendron yang diuji.
Faradilla (2008) melakukan radiasi sinar gamma pada dua kultivar
anturium bunga, yaitu Anthurium andreanum kultivar Mini dan Anthurium
andreanum kultivar Holland. Radiasi dilakukan pada bibit tanaman anturium yang
berumur 2 bulan. Nilai LD50 pada bibit A. andreanum kultivar Mini sebesar
134.47 Gy dan A. andreanum kultivar Holland sebesar 62.17 Gy. Pada dosis
radiasi 0 Gy - 90 Gy, radiasi sinar gamma cenderung menurunkan persentase tanaman hidup, menghambat pertumbuhan tinggi tanaman dan panjang tangkai daun, menurunkan jumlah daun dan ukuran daun.
Radiasi pada biji A. andreanum meningkatkan keragaman bentuk, ukuran
dan jumlah daun tanaman anturium. Nilai LD50 benih A. andreanum adalah
22.37 Gy. Pada taraf dosis 0 Gy - 200 Gy, Wegadara (2008) melaporkan bahwa semakin tinggi dosis yang diberikan, semakin menurunkan panjang akar, panjang
daun, lebar daun dan tinggi tanaman A. andreanum.
Radiasi sinar gamma secara in vitro pada A. andreanum pernah dilakukan
oleh Puchooa dan Sookun (2003). Radiasi dilakukan pada taraf 0 Gy -15 Gy
pada kalus A. andreanum in vitro yang telah dikulturkan selama 4 minggu pada
media Nitcsh dan MS0 yang dimodifikasi. Perlakuan dosis radiasi 5 Gy
memberikan respon terbaik dalam hal pembentukan dan regenerasi kalus. Pada taraf dosis radiasi 10 Gy terjadi nekrotik pada jaringan, dan pada dosis 15 Gy
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat PenelitianPenelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2009 sampai dengan bulan Agustus 2009 di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Perlakuan radiasi sinar gamma dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR), Badan Tenaga Atom Nasional (BATAN), Pasar Jumat, Jakarta Selatan. Pengamatan stomata dilakukan di Laboratorium Biologi Tumbuhan, Pusat Studi Ilmu Hayati, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah tunas steril tanaman Anthurium
Wave of Love yang berumur 14 minggu yang dikulturkan secara in vitro pada
media padat dengan pH 5.9. Bahan tanaman yang digunakan sebelumnya berasal
dari planlet steril Anthurium Wave of Love. Pada setiap botol kultur terdapat
banyak tunas dan di bagian pangkal tunas terbentuk bonggol. Subkultur dilakukan
dengan cara memisahkan bonggol tunas dengan ukuran diameter 1 - 2 cm.
Media in vitro dibedakan menjadi dua, yaitu media untuk perbanyakan
tunas sebelum radiasi dan media untuk subkultur. Komposisi media yang
digunakan untuk perbanyakan in vitro tunas Anthurium Wave of Love sebelum
radiasi adalah MS+ 1 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9.
Komposisi media yang digunakan untuk subkultur setelah perlakuan radiasi
adalah MS+ 2 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9.
Komposisi media dasar Murashige dan Skoog (MS) disajikan pada Lampiran 1.
Bahan lain yang digunakan adalah aquadest, plastik, plastik wrap, karet, tissue,
alkohol 70%, clorox, dan spiritus. Bahan untuk pengamatan stomata meliputi kuteks bening dan selotip.
Peralatan yang digunakan untuk pembuatan dan sterilisasi media adalah
botol kultur volume 300 ml, labu takar volume 1 liter, pipet volumetrik, pengaduk
kaca, pH meter, timbangan analitik, magnetic stirrer, dan autoclave. Peralatan
cawan petri, pinset, gunting, scalpel, dan lampu bunsen. Radiasi sinar gamma
dengan 60Co dilakukan di dalam radiator gamma chamber 4000A. Objek gelas
dan mikroskopdigunakan untuk pengamatan stomata.
Metode Penelitian
Penelitian disusun menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dengan satu faktor. Faktor yang digunakan adalah dosis radiasi sinar gamma yang terdiri dari 6 taraf, yaitu: 0 Gy (D0), 10 Gy (D1), 20 Gy (D2), 30 Gy (D3), 40 Gy (D4), dan 50 Gy (D5), masing-masing taraf perlakuan diulang tiga kali sehingga ada 18 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 10 tunas sebagai unit terkecil yang diamati. Jumlah seluruh tunas dalam percobaan ini adalah 180 tunas.
Model linear yang digunakan adalah :
Yij = µ + αi + βj + εij
Keterangan :
Yij = nilai perlakuan dosis radiasi ke-i dan kelompok ke-j
µ = nilai rataan umum pengamatan
αi = pengaruh perlakuan dosis sinar gamma ke-i (i= 0 Gy, 10 Gy, ....50 Gy)
βj = pengaruh kelompok ke-j (j = 1, 2, dan 3)
εij = galat percobaan
Data pengamatan dianalisis dengan sidik ragam pada taraf nyata 5 %.
Pengolahan data dilakukan menggunakan software microsoft office excel 2007dan
software SAS 6.12.
Pelaksanaan Penelitian
1. Sterilisasi peralatan
Botol kultur, cawan petri, pinset, gunting, dan scalpel dicuci bersih, kemudian
disterilkan di dalam autoclave pada suhu 1210 C dan tekanan 17.5 psi selama
60 menit. Alat tanam dan cawan petri yang sudah disterilkan dimasukkan ke
2. Pembuatan media
Komposisi media yang digunakan untuk perbanyakan tunas sebelum radiasi
adalah MS+ 1 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. Media
dibuat dengan menggunakan larutan stok yang telah disiapkan. Komposisi masing-masing larutan stok untuk membuat media dasar Murashige dan Skoog disajikan pada Lampiran 1. Larutan stok adalah larutan yang konsentrasinya sudah dipekatkan sehingga untuk pembuatan media hanya diperlukan dalam volume yang kecil. Semua larutan stok yang diperlukan dipipet, kemudian ditambahkan
zat pengatur tumbuh dan gula, setelah itu dilarutkan dengan aquadest. Larutan
dimasukkan ke dalam labu takar dan ditambahkan air steril hingga mencapai volume 1 liter. Derajat keasaman larutan diukur dengan menggunakan pH meter. Larutan dibuat menjadi pH 5.9. Apabila pH lebih tinggi dari yang diharapkan, maka diturunkan dengan penambahan larutan HCl 1 N dan sebaliknya apabila pH lebih rendah dinaikkan dengan penambahan NaOH atau KOH 1 N. Agar sebanyak 5 g/l ditambahkan ke dalam media sebagai bahan pemadat. Media dimasak sampai mendidih, selanjutnya media dimasukkan ke dalam botol kultur dengan volume 25 ml/botol dan ditutup dengan plastik. Media selanjutnya disterilkan di dalam
autoclave pada suhu 1210C dan tekanan 17.5 psi selama 20 menit.
3. Perbanyakan tunas
Tunas yang diradiasi berasal dari kultur in vitro tanaman Anthurium Wave of
Love. Subkultur dilakukan dengan memisah-misahkan bonggol tunas dengan
diameter 1 - 2 cm. Subkultur dilakukan di dalam laminar air flow cabinet yang
telah disemprot dengan alkohol 70% dan disinari dengan sinar UV selama satu jam. Semua alat yang digunakan disterilkan dengan cara disemprot dengan alkohol sebelum dimasukkan ke dalam laminar. Pisau, pinset dan gunting yang diperlukan dalam proses penanaman eksplan harus dicelupkan terlebih dahulu ke dalam alkohol 70% dan dibakar.
Perbanyakan tunas Anthurium Wave of Love dilakukan selama 14 minggu
pada media MS+ 1 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9.
Perbanyakan tunas bertujuan agar tersedia tunas yang cukup untuk perlakuan dan agar tunas yang diperoleh memiliki kandungan zat pengatur tumbuh endogen
homogen sehingga kondisi tanaman sebelum diberi perlakuan diasumsikan seragam.
4. Radiasi sinar gamma
Unsur Cobalt isotop 60 (60Co) digunakan sebagai sumber radiasi sinar gamma.
Botol kultur dimasukkan ke dalam radiator gamma chamber 4000A. Dosis radiasi
sinar gamma yang diberikan disesuaikan dengan taraf perlakuan.
5. Penanaman eksplan setelah radiasi
Tunas yang telah diradiasi ditanam kembali selama tiga hari setelah perlakuan karena media yang terkena radiasi bersifat toksik bagi tanaman. Penanaman hari pertama merupakan ulangan I, hari kedua adalah ulangan II, dan hari ketiga merupakan ulangan III. Tunas yang ditanam merupakan tunas tunggal, pada setiap botol ditanam dua tunas. Komposisi media yang digunakan setelah radiasi adalah
MS+ 2 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9.
6. Subkultur I dan II
Subkultur dibedakan menjadi 2 bagian, yaitu subkultur I dan subkultur II. Subkultur II dilakukan 8 minggu setelah subkultur I. Subkultur dilakukan dengan cara memisahkan tunas yang terbentuk menjadi tunas tunggal dan ditanam pada
media MS + 2 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9.
Subkultur bertujuan untuk memisahkan kimera yang terbentuk pada tunas yang diradiasi dan untuk mengamati kestabilan mutan yang terbentuk. Subkultur
dilakukan di dalam laminar air flow cabinet.
7. Pengamatan Stomata
Pengamatan stomata dilakukan di akhir pengamatan, yaitu pada 16 minggu setelah radiasi (MSR). Stomata diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. Luas bidang pandang mikroskop pada perbesaran
400 kali adalah 0.28 mm2. Penghitungan jumlah stomata dilakukan pada satu
bidang pandang di dalam satu preparat. Rata-rata jumlah stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata jumlah stomata/bidang pandang dari 9 daun, kemudian
hasilnya dikonversi menjadi jumlah stomata/mm2. Ukuran stomata diukur
diukur tiga stomata. Ukuran stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata dari 27 stomata yang dipilih secara acak.
8. Kondisi Ruang Kultur untuk Inkubasi
Kultur in vitro Anthurium Wave of Love diinkubasi di ruang kultur. Botol
kultur disusun pada rak bertingkat dengan intensitas cahaya 1000-2000 lux selama
24 jam sehari. Suhu ruangan kultur untuk inkubasi adalah 230C.
Pengamatan
Peubah yang diamati setiap minggu selama 16 minggu meliputi :
Tinggi tunas, diukur mulai dari pangkal batang sampai daun yang paling atas