METODE PENELITIAN
D. Instrument Pengumpulan Data
Instrument yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Bahan dan peralatan
a. Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
1) Beruwas laut yang diperoleh dari sepanjang pesisir pantai Kelurahan Watang Suppa Kecamatan Suppa Kabupaten Pinrang
dan diekstraksi dilakukan di laboratorium Biofarmaka Unhas dan UIN Makassar.
2) Hewan uji, tikus strain Sprague Dawly, berat badan 200-250 gram.
3) Makanan hewan (pallet).
4) Aqua pro injeksion.
5) Antibiotik amoxicillin @ 500 mg sebanyak 5 butir.
6) Bakteri staphylococcus aureus standar yang diperoleh dari laboratorium Rs. Unhas yang telah dibiakkan dengan Mc.Farland 2 x 108ml/CFU dan diinduksikan dengan jumlah 0,2 x 108ml/sel pada mammae tikus tepatnya pada bagian duktus laktiferus.
b. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1) Kandang hewan coba
2) Timbangan digital 3) Elisa kit R & D 4) Sarung tangan
5) Mikropipet dan spoit 1 mL.
2. Protokol penelitian a. Ekstraksi
1) Beruwas laut diperoleh dari kelurahan Watang Suppa Kecamatan Suppa Kabupaten Pinrang sebesar 20 kg daun mentah.
2) Bersihkan dari kotoran yang melekat dengan menggunakan air mengalir lalu sampel dipotong-potong kecil.
3) Keringkan hingga mengandung kadar air dibawah 10%.
4) Beruwas laut diayak dengan ukuran mesh 40 sehingga didapatkan sampel simplisia yang halus, setelah itu sampel siap untuk diekstraksi dengan metode maserasi.
Ekstraksi dengan cara metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70% sebagai berikut :
1) Pada proses meserasi terlebih dahulu sampel dibasahkan dengan etanol 70% hingga terendam sepenuhnya selama 15 menit, setelah itu dicukupkan lagi menjadi 2 liter dengan etanol 70% pada suhu ruang selama 3 x 24 jam sambil sesekali di aduk. Proses maserasi dilakukan sebanyak 2 kali.
2) Maserat kemudian disaring dan ampasnya dimaserasi kembali. Ekstrak yang diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan rotavapor hingga mengental, kemudian dikeringkan dengan bantuan penangas air. Ekstrak kental yang dihasilkan dimasukkan ke dalam vial / cawan porselen dan ditimbang bobot ekstrak.
b. Kultur bakteri
1) Bakteri staphylococcus aureus diperoleh dari laboratorium Rs.Unhas dengan jenis bakteri staphylococcus aureus yang standar.
2) Bakteri Staphylococcus aureus di tanam dalam medium BHIB dan diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37°C dalam inkubator. Kemudian bakteri tersebut ditanam pada medium NA (Nutrient Agar) dan diinkubasi kembali selama 18-24 jam dengan suhu 37°C.
3) Setelah inkubasi bakteri, lakukan pewarnaan gram.
4) Koloni yang tumbuh pada NA dilakukan uji biokimia untuk bakteri S. aureus dengan menanam pada medium DNAse agar kemudian manitol salt agar, lalu lakukan bacitracin dan Novobiocin test dilanjutkan dengan kalatase koagulase test.
Kemudian diinkubasi kembali selama 18-24 jam dengan suhu 37°C.
5) Bakteri yang tumbuh pada uji biokimia dicocokkan dengan tabel identifikasi bakteri S. aureus.
6) Untuk membuat sampel bakteri yang disuntikkan ke tikus dengan cara membuat suspensi dalam larutan NaCl fisiologis sebanyak 10 ml dicampurkan dengan koloni bakteri S. aureus yag berwarna kuning emas dengan tingkat kekeruhan Mc Farlan 2 x 108 CFU. Keakuratan tingkat kekeruhan Mc Farland diukur dengan alat Densi check.
c. Uji histopatologi
1) Sebelum tikus di induksikan bakteri staphylococcus aureus pada semua kelompok, maka akan dilakukan uji
histopatologi pada satu ekor tikus sebagai parameter bahwa teknik injeksi dan pertumbuhan bakteri tepat pada bagian duktus laktiferus.
2) Setalah dilakukan uji histopatologi dan menunjukkan hasil yang diharapkan bahwa mammae tikus khususnya bagian duktus laktiferus telah terinfeksi oleh bakteri staphylococcus aureus dan adanya perubahan sel epitel pada payudara.
d. Perlakuan pada subjek penelitian
Tikus diperoleh dari laboratorium animal Unhas. Uji coba dilakukan berdasarkan uji coba research guidelines for evaluating the savety and efficaty of herbal medicine sesuai dengan standar WHO yaitu minimal 5 (lima) ekor tikus strain Sprangue Dawley pada masing – masing kelompok dan cadangan ditambah 1 (satu) setiap kelompok sehingga jumlah tikus yang dibutuhkan adalah 18 ekor yang dibagi menjadi 3 kelompok. Percobaan akan dilakukan sesuai dengan panduan penggunaan dan perawatan hewan laboratorium dan telah mendapat izin dari Komite Etik Fakultas Kedokteran Unhas Makssar.
Tikus strain Sprangue Dawley sebanyak 15 ekor dibai menjadi 3 (tiga) kelompok dengan random, masing-masing kelompok terdiri dari 5 (lima) ekor tikus dengan pembagian kelompok sebagai berikut:
1) Kelompok kontrol negatif (I)
Kelompok kontrol negatif adalah kelompok kontroll yang diinduksikan bakteri staphylococcus aureus (0,2 mlx108 ml/CFU), hanya diberikan air (aqua pro injeksion) sebanyak 1 ml/250gram BB tikus dan tidak diberikan ekstrak beruwas laut.
2) Kelompok kontrol positif (II)
Kontrol positif adalah kelompok kontrol yang diinduksikan bakteri staphylococcus aureus (0,2 ml x108 ml/CFU), dan diberikan antibiotik amoxicillin dengan dosis 9,6 mg/ml/250gramBB tikus selama 5 hari dan tidak diberikan ekstrak beruwas laut.
3) Kelompok perlakuan (III)
Kontrol perlakuan adalah kelompok yang diinduksikan bakteri staphylococcus aureus (0,2 mlx108 ml/CFU), diberikan antibiotik amoxicillin dengan dosis 9,6 mg/ml/250gramBB tikus selama 5 hari dan ekstrak daun beruwas laut dengan dosis 400 mg/ml/kgBB tikus.
Pengukuran dilakukan dalam tiga tahapan sebagai berikut : 1) Pengukuran pertama (pre-test) kadar sitokin IL-10 pada
masing-masing kelompok dilakukan pada hari ke 8 setelah adaptasi, pengambilan darah sebanyak 0,5 ml dilakukan
pada mata dan dilakukan penginduksian bakteri staphylococcus aureus pada payudara.
2) Pengukuran kedua untuk kadar sitokin IL-10 dilakukan setalah 18-24 jam setelah induksi bakteri dilakukan, dengan mengambil darah pada daerah mata sebanyak 0,5 ml . Selanjutnya pada hari ke-9 masing kelompok diberikan pengobatan yaitu pada kelompok kontrol negatif hanya diberikan air saja dengan dosis 1 ml/250grBB tikus/24 jam selama 5 (lima) hari kedepan, kelompok kontrol positif diberikan antibiotik amoxicillin dengan dosis 9,6 mg/ml/250gramBB/24 jam selama 5 (lima) hari kedepan, dan kelompok perlakuan diberikan antibiotik amoxicillin dengan dosis 9,6 mg/ml/250gramBB/24 jam + ekstrak beruwas laut dengan dosis 9,6 mg/ml/200gramBB/ 24 jam selama 5 (lima) hari kedepan.
3) Pengukuran ketiga untuk kadar sitokin IL-10 dilakukan pada hari ke-14 pada semua kelompok, dengan mengambil darah pada daerah mata sebanyak 0,5 ml .
e. Pemeriksaan Elisa Kit
Dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan dengan metode R & D system Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Rat untuk mengukur kadar IL-10. Sebelumnya, antibodi monoklonal spesifik IL-10 telah dicoated dalam mikroplate.
Sampel dan standar dihisap menggunakan pipit ke dalam well, dan keberadaan sitokin IL-10 akan disandwich (dipasangkan) oleh immobilized antibody t dalam well, Setelah dilakukan pencucian untuk menghilangkan substansi-substansi yang tidak terikat, kemudian ditambahkan enzym-linked polyclonal antibody yang spesifik terhadap IL-10. Kemudian setelah dilakukan pencucian kembali untuk menghilangkan reagen antibodi enzyme yang tidak berikatan, selanjutnya larutan substrate ditambahkan ke dalam well dan kemudian terbentuklah warna yang sebanding dengan jumlah IL-10 yang terikat. Pembentukan warna dihentikan dan kemudian intensitas warna diukur. Berikut Tahap yang dilakukan adalah : 1) Menyiapkan reagen, standar kerja, kontrol, dan sampel
seperti yang diarahkan pada bagian sebelumnya.
2) Menghilangkan kelebihan strip lempeng dari frame piring, mengembalikan mereka ke kantong foil yang berisi paket pengering, dan reseal.
3) Menambahkan 50 µL assay pengencer untuk masing-masing dengan baik.
4) Menambahkan 50 µL standard, control, atau sampel * masing-masing dengan baik, campur dengan menekan lembut frame piring untuk 1 menit. Menutup dengan setrip perekat yang disediakan. Inkubasi selama 2 jam pada suhu
kamar
5) Mengaspirasi masing-masing dengan baik dan mencuci, mengulangi proses empat kali untuk total lima mencuci.
Mencuci dengan mengisi masing-masing dengan baik dengan Wash Buffer (400 µL) menggunakan botol semprot, dispenser manifold, atau autowasher. Penghapusan lengkap cair pada setiap langkah sangat penting untuk kinerja yang baik. Setelah mencuci terakhir, menghilangkan sisa Wash Buffer oleh aspirating atau dengan membalik piring dan
blotting melawan handuk kertas yang bersih.
6) Menambahkan 100 µL Rat IL-10 Conjugate untuk masing-masing dengan baik. Tutup dengan strip perekat baru.
Inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
7) Mengulangi aspirasi / mencuci seperti pada langkah 5.
8) Menambahkan 100 µL substrat Solusi untuk masing masing dengan baik. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.
Lindungi dari cahaya.
9) Menambahkan 100 µL Stop Solution untuk setiap baik.
Tekan dengan lembut piring untuk memastikan menyeluruh pencampuran.
10) Menentukan kepadatan optik masing-masing dengan baik dalam waktu 30 menit, menggunakan microplate reader set ke 450 nm. Jika koreksi panjang gelombang tersedia, set ke
540 nm atau 570 nm. Jika koreksi panjang gelombang tidak tersedia, kurangi pembacaan pada 540 nm atau 570 nm dari pembacaan pada 450 nm. Pengurangan ini akan mengoreksi ketidaksempurnaan optik dipiring. Pembacaan dilakukan secara langsung di 450 nm tanpa koreksi mungkin lebih tinggi dan kurang akurat.