Bakteri asam laktat diisolasi dari bubuk hasil fermentasi biji kakao hibrid yang telah difermentasi selama 72 jam. Proses isolasi
BAL diawali dengan proses enrichment,
dimana 1 g sampel bubuk biji dimasukkan ke dalam 9 mL MRS Broth (Merck), lalu
dihomogenkan sehingga didapatkan
pengenceran 10-1 kemudian di inkubasi pada
suhu 37 oC selama 24 jam.
Setelah inkubasi, sampel diencerkan
menggunakan media pepton water (Merck) di
dalam tabung Eppendorf. Pengenceran
dilakukan secara bertingkat sampai 10-9,
dengan cara 100 L dari enrichment atau
pengenceran10-1 ditambahkan ke dalam
tabung Eppendorf yang berisi 900 L pepton water sehingga didapat pengenceran 10-2,
selanjutnya diambil 100 L dari pengenceran
10-2 ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf
yang berisi 900 L pepton water sehingga didapatkan pengenceran 10-3 dan seterusnya
hingga didapatkan pengenceran 10-9.
Kemudian dilakukan proses plating, kultur dari pengenceran 10-9 diinokulasikan pada
media MRS Agar (Merck), diinkubasi secara anaerob pada suhu 37oC selama 48 jam.
Koloni BAL tunggal yang tumbuh pada
permukaan media dimurnikan kembali
dengan cara menginokulasikan koloni ke dalam media MRS Agar (Merck) secara gores dan diinkubasi secara anaerob pada suhu 37
oC selama 48 jam.
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
A. Identifikasi Morfologi BAL
Kegiatan identifikasi morfologi BAL
dilakukan dengan dua cara, yaitu identifikasi makroskopik dan mikroskopik. Identifikasi makroskopik yang diamati adalah bentuk, warna, dan ukuran koloni BAL yang tumbuh pada media MRS Agar sedangkan identifikasi
mikroskopik yaitu bentuk sel dengan
pewarnaan Gram
B. Uji Antimikroba
Uji aktivitas antimikroba dilakukan terhadap tiga bakteri uji yaitu Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus. Bakteri asam laktat ditumbuhkan dalam media 10 mL MRS
broth di inkubasi selama 24 jam. Bakteri asam laktat diujikan dengan bakteri indicator yang telah ditumbuhkan selama 24 jam pada media LB (Luria Bertani) suhu 37oC. Uji Antimikroba
dengan menggunakan metoda Kirby-Bauer dengan cara bakteri indikator dioleskan
merata pada permukaan NA dengan
menggunakan cottonbud, kemudian pada
kertas cakram dicelupkan bakteri asam laktat dan ditanam pada permukaan NA yang telah diolesi bakteri indikator. Zona bening yang terbentuk diamati pada jam ke 24, 48 dan 72.
Isolat dengan zona hambat tertinggi
dilakukan pengujian ketahanan terhadap berbagai variasi pH dan suhu.
Pengaruh Suhu dan pH terhadap Aktifitas Antimikroba
A. pH
Pengujian resistensi terhadap pH dilakukan pada beberapa variasi pH media MRS Broth yaitu pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 dan 9 (menggunakan HCl 1N dan NaOH 1 N sebagai pengatur pH). Isolat terpilih diinkubasi pada media MRS Broth dengan berbagai yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC secara
anaerob. Kultur yang terbentuk akan
dilakukan uji antimikroba dengan metoda Kirby-Bauer seperti dijelaskan pada prosedur uji antimikroba.
B. pH
Pengujian resistensi terhadap suhu dilakukan pada beberapa variasi suhu inkubasi kultur bakteri asam lakat, yaitu 37, 45, 55, 65, dan 75
oC. Isolat terpilih diinkubasi pada MRS Broth
selama 24 jam pada suhu 37, 45, 55, 65, dan 75
oC secara anaerob. Kultur yang terbentuk
akan dilakukan uji antimikroba dengan metoda Kirby-Bauer seperti dijelaskan pada prosedur uji antimikroba.
Isolasi DNA
Isolat BAL diinokulasikan dalam media 10 mL media MRS Broth dan diinkubasi secara anaerob selama 2 jam. Kultur BAL disentrifus sebanyak 6 mL pada suhu 4 °C selama 5
menit, dengan kecepatan 14.000 rpm.
95
diperoleh ditambahkan 500 μL 1 x TE, 50 μL
SDS 10 % dan 5 μL proteinase K 10 mg/mL
dan divoeteks. Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Ditambahkan 600 μL larutan
fenol : kloform (P:C) (1:1), disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung Eppendorf baru,
ditambahkan 600 μL PC, dibolak balik,
disentrifus 14.000 rpm selama 5 menit.
Lapisan atas dipindahkan ke tabung
Eppendorf baru, tambahkan dengan natrium asetat 3 M sebanyak 1/10 dari volume yang
ada kemudian tambahkan isopropanol
sebanyak 6/10 volume yang ada, lalu dibolak balik dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Supernatan dibuang
dan pelet DNA dicuci dengan dengan 100 μL
etanol 70% dingin, dikering anginkan. Setelah kering larutkan pellet DNA dengan 1xTE sebanyak 25 μL.
Amplifikasi Gen 16S Rrna
DNA diamplifikasi menggunakan PCR 30 siklus. Primer yang digunakan :
27F : AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG M = C; A
1525R : AAG GAG GTG WTC CAR CC W = A; T
Bahan-bahan yang digunakan untuk satu sampel dalam reaksi PCR (Polymerase Chain
Reaction) adalah 20 µl ddH2O, 3 µl primer mix
27F-1525R 5pmol/µl, RTG (Ready to Go) PCR
bead, dan 2 µL templet DNA. Dengan kondisi
PCR: denaturasi awal 94 °C selama 5 menit, denaturasi 94 °C selama 1 menit, annealing 57 °C selama 1 menit, ekstensi 72 °C selama 1 menit dan final extension 72 °C selama 5 menit sebanyak 30 siklus. Produk PCR dianalisa dengan elektroforesis.
Elektroforesis
Sebanyak 25 μL produk PCR ditambah
dengan 1,5 μL BPB (Bromo Phenol Blue)
dielektroforesis pada 100 V selama 30 menit dengan 1 % agarose gel. Sebagai marker digunakan 1 kb DNA Ladder (Takara) dan DNA lambda 50 ng/µL. Gel kemudian divisualisasikan dibawah lampu ultraviolet setelah ditambahkan etidium bromida.
III. Hasil dan Pembahasan
Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Kakao Hibrid
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya perubahan pH selama proses fermentasi kakao hibrid, yaitu dari 4 menjadi 3,5. Hal ini disebabkan karena selama proses fermentasi
menghasilkan asam-asam organik yang
merupakan hasil hidrolisis senyawa kompleks seperti karbohidrat, asam lemak dan juga sebagai hasil aktivitas pertumbuhan bakteri yang menghasilkan asam laktat, asam asetat,
etanol dan CO2.
Jumlah koloni bakteri asam laktat yang
dihasilkan pada pengenceran 10-9 adalah 6,5 x
1010 CFU/g. Hasil ini sesuai dengan ketentuan
pangan probiotik menurut FAO/WHO bahwa
penambahan pangan probiotik harus
memperhatikan kesehatan inang tempat bakteri hidup konsentrasi itu berkisar antara 106- 107 CFU/mL tujuan ini agar terjadi
keseimbangan mikroflora di usus.15
Bakteri asam aktat yang terisolasi dilanjutkan ke tahap pemurnian untuk mendapatkan bakteri asam laktat yang lebih murni. Dari hasil pemurnian ini diperoleh sembilan isolat BAL yaitu H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8 dan H9.
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Identifikasi Bakteri Asam Laktat
Identifikasi dilakukan terhadap 9 isolat dengan cara makroskopik dan mikroskopik. Secara makroskopik pengamatan meliputi ukuran koloni, bentuk koloni, permukaan koloni, dan warna koloni yang dapat dilihat pada Tabel 1. Sedangkan secara mikroskopik dilakukan dengan pewarnaan Gram untuk mengamati bentuk sel bakteri. Identifikasi BAL secara makroskopik pada medium MRS agar terlihat bentuk koloni pada umumnya bulat dan bundar, dengan ukuran koloni bervariasi, permukaan koloni berbentuk cembung dengan tepian licin, berwarna putih susu dan putih kekuningan. Sebelumnya
identifikasi morfologi BAL juga telah
dilakukan pada penelitian sebelumnya dari fermentasi buah sirsak dan pulp kakao hibrid
bahwa morfologi koloni BAL yang
96
dengan ukuran koloni rata-rata ± 2-4 mm,
permukaan koloni berbentuk cembung
dengan tepian licin, berwarna putih susu.15, 16
Identifikasi mikroskopik dilakukan dengan
pewarnaan Gram. Identifikasi dengan
pewarnaan Gram ini mengelompokkan
bakteri berdasarkan reaksi kimia, dimana pewarnaan Gram ini akan membagi bakteri menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negatif, perbedaan ini disebabkan karena lapisan dinding sel bakteri juga berbeda.
Tabel 1. Identifikasi bakteri asam laktat secara makroskopis dan mikroskopis
No. Kode Isolat Warna koloni pada
media agar Warna sel Gram Bentuk sel
1. H1 Putih susu Ungu Positif Basil
2. H2 Putih susu Ungu Positif Basil
3. H3 Putih susu Ungu Positif Basil
4. H4 Putih susu Ungu Positif Basil
5. H5 Putih susu Ungu Positif Basil
6. H6 Putih susu Ungu Positif Basil
7. H7 Putih susu Ungu Positif Basil
8. H8 Putih susu Ungu Positif Basil
9. H9 Putih susu Ungu Positif Basil
Uji Antimikroba
Hasil uji penghambatan pertumbuhan bakteri indicator Salmonell typhi, escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan metode difusi
cakram menunjukkan kesembilan isolat
memperlihatkan kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri indikator, ditandai
dengan terbentuknya zona bening di sekitar kertas cakram dengan ukuran yang bervariasi. Gambar zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar. 1. Zona hambat ke-9 isolat terhadap Salmonella typhi, A. Isolat H1, H2, H3, H4 dan B. Isolat H5, H6, H7, H8, H9
Kemampuan sembilan isolat bakteri asam laktat dalam menghambat pertumbuhan bakteri indikator patogen berbeda-beda. Isolat yang paling potensial dalam menghambat bakteri Escherichia coli adalah isolat H5 dengan diameter zona bening sebesar 9,5 mm. sedangkan isolat H9 adalah isolat yang paling potensial dalam menghambat pertumbuhan
bakteri Salmonella typhi dan Staphylococcus
aureus dengan diameter zona bening berturut-
turt adalah 10,5 mm dan 18 mm. dari uji antimikroba ini dipilih isolate H9 sebagai
isolate potensila yang dilanjutkan uji