Isolasi Bakteri Cairan Rumen Kambing PEK
Penelitian tahap ini merupakan upaya isolasi bakteri rumen kambing PEK yang mempunyai potensi toleran terhadap kehadiran tanin dan diharapkan mempunyai kemampuan menguraikan senyawa tersebut.
Prosedur ini terdiri dari isolasi koloni, pemurnian, identifikasi, dan penyimpanan.
Isolasi Koloni
1. Pembiakkan Bakteri pada Media Cair
Disiapkan empat tabung berisi 10 ml media biakan cair (broth) brain heart infusion (BHI)yang masing-masing mengandung asam tanat 1%, 1,5%, 2%, dan 3% . Ke dalam masing-masing tabung dimasukkan 0.5 ml cairan rumen kambing PEK. Mikroba yang terdapat dalam cairan dibiakkan dalam empat tabung tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 39 0C selama 24 jam. Asam tanin membentuk kompleks dengan zat makanan dalam media BHI dalam bentuk gumpalan, oleh karena itu agar terjadi kontak antara mikroba dengan tanin maka dilakukan pengocokan secara periodik dengan vorteks
selama satu menit. Pengocokan dilakukan selama masa inkubasi yaitu setiap 10 menit pada 3 jam pertama, setiap 30 menit pada 3 jam kedua, dan setiap 3 jam pada inkubasi selanjutnya.
2. Pembiakkan Bakteri pada Media Agar
Pada akhir inkubasi masing-masing biakan diencerkan 100 kali secara serial hingga lima kali dengan cara mengencerkan 0.05 ml biakan kedalam 5 ml media cair BHI, selanjutnya dari campuran tersebut diencerkan kembali sebanyak 0.05 ml ke media cair BHI, demikian seterusnya hingga lima kali pengenceran (serial). Pada pengenceran ke-3 (106 kali), ke-4 (108 kali), dan ke- 5 (109 kali) msing-masing diambil 0.1 ml untuk dimasukkan dalam 7 ml media biakan beragar BHI dalam keadaan cair dengan suhu 47 0C (dengan demikian pengenceran ke-3 menjadi 107 kali, ke-4 menjadi 109 kali, dan ke-5 1011 kali), kemudian dengan cepat tabung tersebut diputar horizontal dalam alat pemutar
(roller) sambil dialiri air dingin, sehingga media beragar dalam bentuk cair itu segera membeku membentuk lapisan agar tipis merata dinding tabung. Dengan cara tersebut bakteri menempel dam menyebar merata dalam agar. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator pada suhu 39 0C selama 2-3 hari. Bakteri yang menempel pada agar akan tumbuh membentuk koloni. Koloni dapat dilihat langsung dengan mata (visual), oleh karena itu koloni ini dapat diamati bentuk, warna, dan ukurannya. Pembentukan koloni akan terlihat rapat dan padat pada pengenceran rendah dan akan jarang atau bahkan tidak ada pada
pengenceran tertinggi. Pada pengenceran padat kita akan mendapatkan sejumlah jenis kelompok koloni, sedangkan untuk mempermudah pengambilan koloni sebagai isolat serta mempermudah pemurniannya dapat dilakukan pada pengenceran tinggi (kerapatan koloni yang jarang). Kelompok koloni yang tidak terdapat pada pengenceran tinggi diambil pada pengenceran yang lebih rendah.
Penentuan Isolat
Penggunaan level asam tanin dimaksudkan untuk memperoleh isolat bakteri yang mampu hidup pada beberapa level konsentrasi tanin. Bakteri yang dapat tumbuh pada level tanin tertinggi merupakan harapan sebagai isolat terbaik.
Koloni-koloni bakteri yang terbentuk pada setiap level konsentrasi tanin dipilah-pilah sehingga didapatkan beberapa kelompok koloni. Kolompok koloni yang tumbuh pada level tertinggi ditetapkan sebagai kelompok koloni terpilih. Dari setiap kelompok koloni terpilih diambil satu koloni sebagai isolat. Setiap koloni isolat diambil dengan ose untuk dibiakkan ke dalam 10 ml media cair BHI (diinkubasi pada suhu 39 0C selama 24 jam). Dengan demikian diperoleh beberapa biakan isolat, dan biakan itu selanjutnya dilakukan pemurnian.
Pemurnian isolat
Koloni isolat-isolat yang telah dibiakkan pada 10 ml media cair BHI, kemudian dibiakan lagi pada 7 ml media agar BHI setelah dilakukan pengenceran (teknik pembiakan pada media agar ini sama seperti pada tahap isolasi). Koloni yang terbentuk diamati keseragamannya. Bila koloni-koloni bakteri yang tumbuh pada media agar BHI masih ada koloni Bakteri yang tidak sama dengan ciri fisik koloni bakteri isolatnya, maka dilakukan pengambilan (menggunakan ose) satu koloni bakteri yang sama dengan ciri fisik koloni bakteri isolatnya kedalam 10 ml media cair BHI untuk dibiakkan kembali (diinkubasi 39 0C selama 24 jam). Biakan dalam media cair ini kembali dibiakkan pada media agar untuk dilihat keseragaman koloninya. Bilamana pengamatan belum terlihat seragam maka kembali salah satu koloni dibiakan dalam media 10 ml media cair BHI dan diamati keseragaman koloninya pada media agar, demikian prosedur ini dilakukan
berulang-ulang hingga koloni-koloni bakteri yang tumbuh pada media agar dinyatakan seragam. Setelah dinyatakan seragam maka satu koloni bakteri isolat diambil dengan ose dan dibiakkan pada 10 ml media cair BHI yang mengandung 1% asam tanin (inkubasi 39 0C selama 24 jam) untuk disimpan.
Penyimpanan
Biakan isolat bekteri yang murni dalam 10 ml media cair BHI mengandung 1% asam tanat, diambil sebanyak 6 ml dicampur 2 ml larutan gliserol 80% (3:1), dan selanjutnya campuran ini disimpan dalam freezer (suhu beku).
Karakterisasi Isolat
Karakterisasi isolat meliputi: 1. Morfologi Isolat
Pengamatan morfologi dilakukan dengan metode pewarnaan gram. 2. Aktivitas Isolat terhadap Pembeningan Tanin
Disediakan 10 ml media agar BHI mengandung 1% asam tanat dan 1% tanin terkondensasi dalam botol kaca kapasitas 100 ml, media membeku dibagian dasar setebar 2-3 mm. Biakan dari penyimpanan (stock) ditumbuhkan sebanyak 0.1 ml pada 10 ml media cair BHI mengandung 1% asam tanat (diinkubasi 39 0
C 24 jam). Biakan tersebut di teteskan pada bagian tengah media agar, kemudian posisi botol segera dibalikan sehingga media agar menggantung atau terlerak di bagian atas selanjutnya diinkubasi 39 0C sema 3-5 hari. Koloni bakteri akan tumbuh dan bilamana terjadi aktivitas pembeningan tanin maka di sekitar koloni bakteri terjadi area yang berwarna bening (clearing zone) yang menunjukkan bahwa isolat mempunyai aktivitas yang bereaksi atas kehadiran tanin.
3. Aktivitas Pemanfaatan Sumber Karbon
Sumber karbon yang digunakan adalah glukosa, fruktosa, galaktosa, xylosa, sukrosa, maltosa, selulosa, selobiosa, dan pati. Sebanyak satu takar spatula (±0.001 gram) dimasukkan dalam 10 ml media cair non karbon. Sebanyak 0.1 ml biakan isolat dibiakkan pada media yang mengandung sumber-sumber karbon tadi, kemudian diinkubasi 39 0C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan
pada tingkat kekeruhan yang terjadi pada biakan media sumber-sumber karbon itu dengan membandingkan dengan blangkonya (media cair non karbon tanpa penambahan sumber karbon).