Percobaan ini dilakukan untuk mendapatkan filtrat enzim dengan aktivitas terbaik yang diproduksi oleh kapang yang berhasil diisolasi dari tanah dan sampel (ampas) BIS yang telah mengalami pelapukan, dengan metode submerged fermentation (pada medium cair).
Persiapan Substrat dan Polisakarida Mengandung Mannan dari BIS
Tahapan pendahuluan untuk memperoleh substrat fermentasi berupa ampas BIS dari proses isolasi protein BIS (Yatno 2009) dan polisakarida mannan dari BIS seperti terlihat pada Gambar 5. Hasil ekstraksi berupa cairan kemudian dipekatkan dengan cara penguapan pada ruang tertutup menggunakan lampu pijar sebagai sumber pemanas (41 ºC) selama 3 hari. Kemudian dilakukan dialisis terhadap sampel dengan pelarut berupa akuades, kemudian dilakukan sentrifugasi (12 000 G) selama 15 menit (Syahruddin 2009).
Isolasi Kapang
Sampel berupa ampas BIS yang dibiarkan pada suhu kamar selama beberapa hari (sampai terlihat tanda-tanda kerusakan biologis/ditumbuhi kapang) dan sampel tanah. Isolasi kapang dilakukan pada medium kultur, mengacu pada Ramli et al. (1994) menggunakan media dan bahan campuran sebagai berikut: 0.05% K2HPO4; 0.05% KH2PO4; 0.05% MgSO4.7H2O; 0.05% KCl; 0.1% (NH4)2SO4; 0.001% FeSO4.7H2O; dan 0.001% MnSO4 yang dilarutkan ke dalam 1 000 mL akuades.
Gambar 5 Preparasi substrat dan polisakarida mannan dari bungkil inti sawit untuk proses fermentasi dan pengujian aktivitas
mannanase.
Tahapan isolasi dan pemurnian kapang (Gambar 6) dilakukan dengan memasukkan sampel tanah/ ampas BIS ke dalam tabung reaksi (15 cm; Ø 1.6 cm) berisi akuades steril dengan perbandingan 1:10 (b/v). Larutan dihomogenisasi menggunakan vortex mixer. Sebanyak 1% larutan tersebut dimasukkan ke dalam kultur medium cair (v/v = 0.1:9.9 mL) yang mengandung 2% ampas BIS sebagai satu-satunya sumber karbon dalam tabung reaksi. Kulturisasi kapang dilakukan selama 4 hari pada suhu ruangan (30 oC) dengan goyangan (80 rpm). Pada akhir masa inkubasi, sebanyak 1 lup diambil dari masing-masing kultur, lalu ditumbuhkan pada media PDA (Potatoes Dextrose Agar) pada cawan petri (agar plate) secara steril dalam laminar flow menggunakan metode Streak plate
Autoclave (121 ºC; 15 menit) Penambahan 400 mL NaOH (1N) Pendinginan sampai dengan suhu kamar
Pemekatan, Dialisis, dan Sentrifugasi Endapan Supernatan Penambahan HCl (0.1 N) (Cairan:HCl = 1 : 3.7–4) Pemisahan
Pengeringan dan penyaringan
Autoclave (121 ºC; 15 menit) Penambahan 400 mL asam asetat (0.05 N)
Disaring
Grinding selama 20 menit (Mortar Grinder)
Substrat untuk seleksi kapang
Padatan (Ampas) Grinding selama 20 menit
(Mortar Grinder) Bungkil inti sawit (100 g) +
pecahan kaca (50 g)
Cairan
Polisakarida mannan
Kaca
(Cappuccino & Sherman 2001) untuk mengisolasi koloni kapang terpisah. Screening dilakukan sebanyak 3 kali sehingga diperoleh jenis kapang yang mampu tumbuh pada substrat. Isolat murni dipelihara pada media agar miring (agar slant) sebagai stok untuk penggunaan pada percobaan selanjutnya.
Gambar 6 Tahapan isolasi dan pemurnian kapang.
Produksi Enzim
Masing-masing isolat kapang hasil isolasi (5 jenis) pada tabung pembiakan ditambah akuades steril sebanyak 3 mL, permukaan media agar miring digores berulang kali dengan spatula untuk melepas spora/miselia kapang. Homogenisasi dilakukan menggunakan vortex mixer, lalu diinokulasi secara steril pada labu erlemeyer yang berisi medium produksi (1% ; v/v) yang mengandung 2% ampas BIS (b/v). Medium yang digunakan untuk produksi enzim sama dengan medium yang digunakan pada proses isolasi kapang. Fermentasi cair (submerged fermentation) dilakukan dengan goyangan/shake flask cultivation (80 rpm) pada suhu ruangan. Ekstraksi enzim (kasar) dilakukan dengan cara sentrifugasi (4 ºC; 10 000 G selama 30 menit), kemudian supernatan dikoleksi dan disimpan pada suhu dingin (4 ºC) untuk penggunaan selanjutnya, seperti terlihat pada Gambar 7.
Sampel tanah/ampas BIS yang telah mengalami pelapukan Sampel (1 g) dalam akuades steril (10 mL); divortex
Inokulasi (1 lup) pada PDA di cawan petri, dibiarkan tumbuh selama 2-4 hari
Koloni terpisah
Inokulasi (1 lup) pada PDA di cawan petri
Pemeliharaan sebagai stok pada PDA slant
Inokulasi (1% = v/v) pada medium kultur mengandung 2% ampas BIS (b/v); 30 oC; 80 rpm; 4 hari
Gambar 7 Tahapan produksi enzim dari isolat kapang.
Pengukuran Aktivitas Enzim
Uji aktivitas enzim Filter Paper (FP)-ase dan mannanase dilakukan menggunakan metode DNSA (Dinitrosalicylic acid) mengacu pada Miller (1959). Gula yang tereduksi diukur menggunakan tehnik spektrofotometri. Penentuan aktivitas FP-ase mengacu pada metode Ghose (1987), sedangkan penentuan aktivitas mannanase mengacu pada metode yang dilakukan Bradner et al. (1999) yang dimodifikasi. Pengujian dilakukan menggunakan bufer sitrat dan Na-sitrat-fosfat (0.05 M) pada beberapa level pH dan beberapa suhu (ºC) inkubasi.
Larutan pereaksi DNSA dibuat dengan bahan berupa; 1% Sodium Hidroxyde (NaOH) dan 1% 3,5 Dinitro salicylic acid dalam pelarut berupa akuades steril. Kemudian ditambahkan 18.2% Pottasium Sodium Tartrate (garam Rochelle), 0.2% phenol dan 0.02% sodium metabisulfite (Na2SO3). Titrasi 3 mL sampel menggunakan indikator phenolptalein dengan 0.1 N HCl (5–6 mL). Tambahkan NaOH (2 g = 1 mL 0.1 N HCl) jika diperlukan. Jika pH telah mencapai 13, larutan DNSA sudah dapat dipakai (Irawadi 1990).
Hidrolisis terhadap substrat uji oleh masing-masing filtrat enzim dilakukan untuk mengetahui kadar gula sampel yang tereduksi. Pembacaan sampel uji dilakukan pada spektrofotometer (Camspec Unico UV-2100), dengan skala
Isolat kapang pada media agar miring Ditambahkan akuades steril (3 mL); divortex
Sentrifugasi (10 000 G; 30 menit; 4 °C) Fermentasi cair (submerged fermentation) selama 4; 7; 11; dan 14 hari (30 °C; 80 rpm)
Koleksi dan penyimpanan supernatan (4 °C) Inokulasi (1%) pada medium produksi
mengandung 2% ampas BIS
absorbansi (skala 0–1) pada panjang gelombang 540 ηm. Satu unit aktivitas enzim (FP-ase / mannanase) dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 mikromol glukosa/manosa per menit per mL, dinyatakan dalam satuan IU /mL (IU = International Unit).
Pengukuran gula reduksi untuk aktivitas enzim FP-ase dilakukan menggunakan standar glukosa dengan substrat berupa kertas saring Whatman No. 1 dengan ukuran 1 cm x 6 cm (± 50 mg), dengan waktu inkubasi 60 menit (Ghose 1987). Kontrol disiapkan dengan cara mereaksikan 1.5 mL bufer dan 3.0 mL
DNSA. Sedangkan blangko berupa campuran 1 mL bufer, 0.5 mL filtrat enzim dan 3 mL DNSA. Sampel uji dilakukan dengan mencampurkan 0.5 mL sampel enzim, 1.0 mL bufer dan 3 mL DNSA.
Pengukuran gula reduksi untuk aktivitas enzim mannanase dilakukan menggunakan gula standar berupa mannosa. Sebanyak 0.5 mL substrat uji (5% polisakarida mannan BIS dalam bufer) dan 0.5 mL sampel enzim dinkubasikan selama 30 menit, lalu dilakukan penambahan 3 mL DNSA. Kontrol berupa 0.5 mL substrat uji, 3.0 mL DNSA dan 0.5 mL bufer. Sedangkan blanko enzim berupa campuran dari substrat uji, 3 mL DNSA dan 0.5 mL filtrat enzim.
Rancangan Percobaan
Produksi enzim dilakukan pada beberapa taraf waktu fermentasi yaitu selama 4, 7, 11 dan 14 hari pada setiap isolat kapang yang diperoleh. Pengukuran nilai aktivitas enzim sampel dilakukan duplo. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.
