TAHAP II Isolasi gen penyand
3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A niger IPB1 1 Isolasi RNA total
Isolasi asam ribonukleat (RNA) total A. niger IPB1 dilakukan pada biakan
yang berumur 3 hari. Miselium dari biakan A. niger IPB1 yang ditumbuhkan pada
media cair dipanen. Sebanyak 1 g miselium digerus dengan bantuan nitrogen cair dalam mortal sampai terbentuk bubuk halus, kemudian diekstrak dengan 800 l reagen TRIzol (Invitrogen). Inkubasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang,
selanjutnya ditambahkan 200 l kloroform, dibolak-balik selama 30 detik. Campuran diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang, selanjutnya disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 15 menit pada suhu 6oC. Supernatan yang
diperoleh dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 500 l isopropil alkohol, kemudian diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 6oC.
disentrifugasi pada 5700 rpm (Jouan BR4i) selama 5 menit pada suhu 6oC.
Endapan yang didapat dikeringkan dengan vakum selama 6 menit dan dilarutkan dalam 20 l ddH2O yang mengandung diethylpyrocarbonate (DEPC) 0.1% (v/v).
Kuantifikasi dilakukan dengan melarutkan 1 l suspensi RNA total dalam 700 l air DEPC 0.1% (v/v), selanjutnya dibaca nilai rapat optisnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al. 1989).
Keutuhan RNA dianalisis secara kualitatif menggunakan elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) 1% (v/v) (4,2 g/l 3-morpholinopropanesulfonic acid (C7H15NO4),
0.41 g/l Na-Asetat, 0.37 g/l Na2EDTA.H2O) pada tegangan 100 volt selama 35
menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip).
3.3.3.2 Sintesis cDNA total
Sintesis cDNA total dilakukan melalui proses transkripsi balik. Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 l 5x reverse transcriptase (RT) bufer, 1
unit Enzim reverse transcriptase (Invitrogen), 10 pmol primer oligo d(T), 2 l dithiothreitol (DTT) (0.1 M), 2 l dNTPmix 2 mM dan ddH2O DEPC 0.1% steril
(konsentrasi final) dalam volume 20 l. Reaksi transkripsi balik dilakukan pada suhu 30oC selama 10 menit, diikuti oleh suhu 42oC selama 60 menit dan 95oC selama 5 menit.
Evaluasi terhadap keberhasilan sintesis cDNA total dilakukan dengan mengamplifikasi gen penyandi aktin dengan menggunakan primer spesifik gen aktin dan cDNA total sebagai cetakannya. Komposisi reaksi PCR (polymerase chain reaction) ialah 0.75 l cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA
polimerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol dari masing-masing primer ActF dan ActR2, dimethyl sulfoxide DMSO 4% (v/v) (konsentrasi final) dan
ddH2O dengan volume reaksi 15 l. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pra-
PCR 95oC selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 57oC selama 30 detik, dan polimerisasi 72oC selama 2 menit dan pasca-PCR 72oC selama 5 menit dan pendinginan 15oC selama 5 menit
3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik
gen endoglukanase yang telah didesain. Komposisi PCR ialah 1 l cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 20
pmol dari masing-masing primer forward dan reverse, DMSO 4% (v/v)
(konsentrasi final) dan ddH2O dengan volume reaksi 20 l. PCR dilakukan
dengan kondisi pra-PCR 95oC selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 57oC selama 30 detik, dan polimerisasi 72oC selama 2 menit dan pasca-PCR 72oC
selama 5 menit dan pendinginan 15oC selama 5 menit.
3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA
Fragmen cDNA eglA yang telah diisolasi disisipkan ke dalam vektor
pengklonan pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA) (Lampiran 2) dan
diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Hasil PCR diligasikan dengan
pGEM-T Easy mengikuti petunjuk produsen (Promega) yaitu dengan mencampur
7.5 ng hasil PCR, 10 ng pGEM-T Easy, 0.3 Weiss Unit T4 DNA ligase dan 1x
bufer ligasi dengan volume reaksi 10 l, kemudian diinkubasi pada suhu 4oC selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α
menggunakan metode Suharsono (2002). Metode ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu pembuatan sel kompeten dan transformasi bakteri. Sel kompeten dibuat dengan membiakkan koloni tunggal E.coli DH5α dalam 2 ml media LB (Luria-
Bertani) cair (tripton 1% (b/v), ekstrak yeast 0.5% (b/v), NaCl 1% (b/v)) pada suhu 37oC selama semalam dalam inkubator beragitasi (250 rpm). Sebanyak 100 l biakan E.coli DH5α kemudian dibiakkan kembali dalam 10 ml media LB cair
sampai mencapai OD600=O.5 (densitas sel 4.107 – 7.107 sel/ml. Sebanyak 1.5 ml
biakan bakteri diendapkan dengan senrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4oC
selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 600 l bufer transformasi (TB) (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM
MnCl2, pH 6,7) dan diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Setelah
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit, endapan bakteri diresuspensikan dengan 60 l TB, ditambah 4.2 l DMSO dan
diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Transformasi dilakukan dengan mencampur sel bakteri kompeten yang dihasilkan dengan 10 l plasmid hasil ligasi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Campuran kemudian diberikan kejutan panas dengan diinkubasi pada suhu 42oC selama 1 menit dan setelah itu
diinkubasikan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran kemudian ditambah dengan 200 l media YT (16 g/l tripton, 10 g/l ekstrak yeast, 5 g/l NaCl, pH 7,0) dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit. Bakteri kemudian disebar dalam media agar LB yang mengandung 50 g/ml ampisilin, 10 l 100 mM isopropiltio-β-galaktosida (IPTG) dan 50 l 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-galactoside) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama semalam.
3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan
E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi
menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Koloni yang tumbuh berarti bakteri transforman, sebab E. coli DH5α baru memiliki gen amp (ketahanan terhadap ampisilin) setelah ditransformasi oleh pGEM-T Easy.
Ada dua jenis warna koloni yang tumbuh yaitu koloni biru dan putih. Koloni biru berarti bakteri transforman pGEM-T Easy non rekombinan, sehingga
gen lacZ masih utuh dan menghasilkan enzim β-galaktosidase untuk memotong
substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Koloni putih berarti bakteri transforman yang mengandung pGEM-T Easy rekombinan, karena gen lacZ menjadi rusak karena tersisipi oleh fragmen DNA (insertional inactivation)
dan tidak akan menghasilkan enzim β-galaktosidase.
3.3.3.6 Analisis cDNA sisipan
Analisis cDNA sisipan dilakukan melalui PCR terhadap koloni putih yang dihasilkan dan pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi EcoRI.
Koloni putih yang terbentuk digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR dalam mendeteksi keberadaan gen endoglukanase. Koloni putih diambil dengan tusuk gigi steril kemudian disuspensikan ke dalam 7.42 l ddH2O dan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 95oC selama 10 menit dan didinginkan dalam es selama 5
menit. Reaksi PCR dilakukan dengan campuran dan kondisi reaksi yang sama dengan isolasi cDNA eglA.
Koloni putih yang menghasilkan pita sesuai dengan ukuran fragmen cDNA sisipan setelah PCR terhadap koloni digunakan sebagai bahan untuk isolasi plasmid yang akan dianalisis lebih lanjut. Plasmid diisolasi dari E. coli DH5α
transforman rekombinan menggunakan prosedur Suharsono (2002). E. coli
ditumbuhkan dalam 2 ml media LB dan diinkubasi dalam inkubator beragitasi (250 rpm) pada suhu 37oC semalam. Kultur bakteri di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Pelet disuspensikan dengan
100 l coldTEG buffer (50 mM glukosa, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA),
ditambahkan 200 l NaOH/SDS buffer (1 N NaOH, 1% SDS), dibolak-balik perlahan dan diinkubasi dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 300 l
icecalsal buffer (3 M NaOAc, 11.5% asam asetat glasial, ddH2O), dihomogenkan
dan disimpan dalam es selama 3 menit. Larutan disentrifugasi 12000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan disuspensikan dengan 1x volume PCI
(fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1)), diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah 2x volume etanol absolut, diinkubasi selama 2 jam di freezer dan
selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan dan kemudian ditambahkan 30 l ddH2O. RNA didegradasi dengan menambahkan
100 ppm RNAse dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Plasmid
dielektroforesis di agarosa 1% (b/v) dalam bufer TAE 1x (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) pada tegangan 100 volt selama 30 menit.