3 METODELOGI PENELITIAN
3.2 Isolat
Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Cronobacter spp. DES b7a dan DES b10 yang diisolasi dari makanan bayi, DES c13 yang diisolasi dari maizena, DES d3 yang diisolasi dari bubuk coklat (Dewanti-Hariyadi et al. 2011), YR t2a dan YR c3a yang diisolasi dari susu formula bayi (Meutia 2008), dan E6 yang diisolasi dari formula lanjutan bayi (Estuningsih et al. 2006). Isolat Cronobacter spp. yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan
No Nama Isolat Asal Isolat Nomor Akses Pustaka
1 DES b7a Makanan Bayi - Dewanti-Hariyadi et al.(2011) 2 DES b10 Makanan bayi JF800179 Dewanti-Hariyadi et al.(2011) 3 DES c13 Maizena JF800181 Dewanti-Hariyadi et al.(2011) 4 DES d3 Bubuk Coklat - Dewanti-Hariyadi et al.(2011) 5 YR t2a Susu Formula Bayi JF800182 Meutia (2008)
6 YR c3a Susu Formula Bayi JF800183 Meutia (2008) 7 E6 Formula Lanjutan Bayi AY624069 Estuningsih et al. (2006) 8 ATCC 51329 Klinis AY752937 Iversen et al. (2004)
3.3 Bahan
Bahan yang digunakan adalah susu skim yang dibeli dari supermarket di wilayah Bogor, akuades steril, dan alkohol 70%. Media dan bahan kimia yang digunakan antara lain Brain Heart Infusion (BHI) (Oxoid CM0225), Buffered Peptone Water (BPW) (Oxoid CM0509), Tryptose Soy Broth (TSB) (Oxoid CM0129), Druggan Forsythe Iversen (DFI) (Oxoid, CM1055), Tryptose Soy Agar (TSA) (Oxoid CM0131), Yeast Extract (Oxoid LP 0021). Untuk pewarnaan Gram digunakan larutan kristal violet, ammonium oksalat, iodine, etanol 95%, safranin, dan minyak emersi, berasal dari laboratorium mikrobiologi SEAFAST Center IPB. Sedangkan untuk mengatur RH desikator penyimpanan digunakan garam
jenuh teknis K2CO3 (RH ±50%), Na(NO3)2 (RH ± 70%) dan BaCl2 (RH±90%)
yang diperoleh toko kimia Brataco Bogor.
3.4 Alat
Alat-alat utama yang digunakan pada penelitian ini adalah Buchi 190 Mini spray drier, timbangan digital, laminar flow, mikroskop binokuler, mikroskop polarisasi, gelas objek, autoclave, cawan petri, tabung reaksi bertutup, ose, spatula, termometer, sentrifuse 3000 rpm, plastik steril, pipet volum 5 dan 10 ml, pipet tetes, pipet mikro, tips, spatula, alumunium foil, waterbath shaker, inkubator suhu 37 ºC dan 55 ºC, penangas air, oven suhu 160-170 °C, oven suhu 105 °C, aw
meter, labu takar 50 ml, 100 ml, 500 ml, dan 1000 ml, erlenmeyer 250 ml dan 500 ml, gelas ukur 250 ml, wadah gelas bertutup, vortek, refrigerator, dan desikator.
3.5 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilaksanakan dalam tiga tahap, tahap pertama adalah konfirmasi isolat dan skrining cepat ketahanan panas 8 isolat Cronobacter spp. dengan tujuan untuk mendapatkan isolat Cronobacter spp. yang paling tahan panas. Satu isolat terpilih digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya yaitu pengujian ketahanannya terhadap proses pengeringan dan kekeringan. Tahapan pelaksanaan penelitian secara garis besar dapat dilihat pada Gambar 4 dan Lampiran 1.
3.6 Tahapan Penelitian
3.6.1 Persiapan Kultur untuk Skrining Cepat Ketahanan Panas a. Penyegaran Kultur Stok Cronobacter spp.
Penyegaran kultur stok Cronobacter spp. berupa ampul dilakukan dengan cara menginokulasikan serbuk isolat dalam 10 ml media BHI dan menginkubasinya selama 24 jam pada suhu 37 °C. Untuk kultur stok Cronobacter spp. berupa manik-manik disegarkan dengan menginokulasikan 2-3 manik-manik ke dalam dalam 10 ml media BHI dan menginkubasinya selama 24 jam pada suhu 37 °C. Isolat Cronobacter spp. yang disimpan pada media TSA miring disegarkan
Gambar 4. Diagram alir penelitian Penyegaran dan rekonfirmasi kultur
Cronobacter spp. secara biokimiawi
Skriningcepat ketahanan panas isolat Cronobacter spp. dalam TSB
(pada suhu 50°C selama 30 menit)
Pengaruh pengeringan semprot (suhu inlet 160 °C dan outlet 82 °C)
Analisis:
1. Jumlah Cronobacter spp. sebelum dan setelah pengeringan semprot
2. Sintas saat Rekonstitusi suhu 27 °C dan 50 °C
Analisis:
1. Jumlah Cronobacter spp. 2. Sintas saat Rekonstitusi suhu
27 °C dan 50 °C
3. Aktivitas air (aw) susu skim
bubuk
4. Kadar air susu skim bubuk 1 isolat Cronobacter spp.
terpilih ±108- 109cfu/ml dalam 40% (w/v) susu skim steril
Pengaruh penyimpanan pada RH 50%, 70% dan 90% selama12 minggu (3 bulan)
Analisis :
Jumlah Cronobacter spp. pada menit ke 0 dan menit ke 30
dengan menginokulasikan satu ose koloni secara aseptik ke dalam BHI steril dan menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
b. Rekonfirmasi Isolat Cronobacter spp.
Kultur Cronobacter spp. yang telah disegarkan (DES b7a, DES b10, DES c13 DES d3, YR t2a, YR c3a, E-6 dan ATCC 51329) dikonfirmasikan terlebih dahulu untuk mengetahui kemurnian kultur yang digunakan. Konfirmasi meliputi pewarnaan Gram dan warna koloni pada media DFI serta TSA.
c. Perhitungan Jumlah Cronobacter spp. Isolat Cronobacter spp. yang disimpan pada media TSA miring diaktivasi
dengan menginokulasikan satu ose koloni secara aseptik ke dalam 10 ml BHI steril dan menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 16-17 jam sampai fase akhir log sehingga didapatkan kultur dengan populasi sel sekitar 108-109 CFU/ml (Permadi 2010). Untuk mendapatkan kultur dengan populasi sel sekitar 106-107 CFU/ml yang digunakan dalam skrining cepat ketahanan panas, sebanyak 1 ml kultur yang telah ditumbuhkan dalam media BHI diencerkan sedemikian rupa dalam 9 ml TSB steril.
3.6.2 Skrining Cepat Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp. pada Suhu 50 °C selama 30 menit pada Medium TSB (Modifikasi Iversen 2003). Skrining dilakukan sebagai tahap awal untuk memilih Cronobacter spp. yang paling tahan terhadap suhu 50 °C selama 30’. Isolat Cronobacter spp. yang paling tahan suhu 50 °C nantinya akan diuji ketahanan terhadap proses pengeringan dan kondisi kekeringan. Sebanyak 1 ml dari masing-masing kultur Cronobacter spp. hasil aktivasi pada langkah 3 (jumlah awal inokulum sekitar 106-107 CFU/ml) diinokulasikan ke dalam 9 ml TSB steril sebagai media pemanas, media tersebut terlebih dahulu dipanaskan dalam waterbath shaker hingga suhunya mencapai 50 oC. Suhu campuran (TSB + inokulum) dipertahankan selama 30 menit. Untuk memonitor suhu media pemanas selama pemanasan berlangsung, 1 tabung TSB kontrol dilengkapi dengan termometer.
Setelah proses pemanasan, tabung yang berisi campuran (TSB +
inokulum) dengan cepat dipindahkan ke dalam tempat yang berisi air deionisasi dan es yang telah dihancurkan untuk menghentikan proses
pemanasan. Untuk mencapai suhu sampel 0 C dapat dilakukan pendinginan dalam waktu 5-6 menit, suhu target umumnya dicapai dalam 2 menit. Setelah sampel mencapai 0 C, dilakukan langkah resusitasi pada suhu ruang (sekitar 27 C) dalam rentang waktu maksimal 60 menit (Lang & Smith 2008). Pada penelitian ini langkah resusitasi dilakukan selama 30-40 menit. Selanjutnya sebanyak 1 ml campuran (TSB+inokulum) dipipet dan kedalam 9 ml BPW steril untuk dilakukan serial pengenceran hingga 10-4 (diasumsikan terjadi penurunan populasi sel sebesar 2-3 siklus log) Tiga pengenceran terakhir dilakukan pencawanan dengan metode tuang.
Jumlah koloni awal dihitung dengan melakukan serial pengenceran kultur pada TSB hingga 10-5 dengan menggunakan pengencer BPW steril. Tiga pengenceran terakhir masing-masing dilakukan pencawanan dengan metode tuang. Selisih log10 antara jumlah koloni awal dan jumlah koloni setelah perlakukan merupakan besar penurunan jumlah koloni. Satu isolat dengan ketahanan panas tertinggi (penurunan log10 terkecil) dipilih untuk diuji ketahanannya selama proses pengeringan semprot dan penyimpanan pada RH berbeda.
3.6.3 Sintas Isolat Cronobacter sp. Terpilih Sebelum Proses Pengeringan Semprot dalam Susu SkimSaat RekonstitusiSuhu 27 °C dan 50 °C
a. Inokulasi Isolat Cronobacter sp. Terpilih dalam Susu Skim dengan
Air Bersuhu 27°C dan 50 °C
Satu isolat terpilih ditumbuhkan pada BHI steril kemudian diinkubasi sampai akhir fase log pada inkubator 37 oC (16-17 jam) sehingga didapatkan jumlah kerapatan sel sekitar 108 -109 CFU/ml. Uji pengaruh suhu rekonstitusi terhadap sintas Cronobacter sp. dilakukan dengan menginokulasikan 1 ml kultur Cronobacter sp. ke dalam susu skim bubuk yang telah ditimbang sesuai takaran saji susu formula yaitu 2,2 gram dalam 15 ml air (13,2 gram dalam 90 ml air). Susu skim bubuk yang telah diinokulasi dengan Cronobacter sp. selanjutnya direkonstitusi menggunakan dua suhu air steril yaitu 27 oC (air suhu kamar) dan 50 oC. Populasi sel hasil rekonstitusi suhu ±27 oC diasumsikan sebagai jumlah awal sel Cronobacter sp., suhu 27 °C merupakan range suhu pertumbuhan
Cronobacter spp. (suhu optimum pertumbuhan 25 ºC sampai 45 ºC) sehingga pada suhu ini dianggap tidak ada penurunan populasi Cronobacter sp..Susu skim hasil rekonstitusi kemudian dilakukan pemupukan secara duplo pada media TSAYE untuk mengetahui jumlah Cronobacter sp. setelah direkonstitusi air suhu kamar (27 °C) dan 50 oC.
b. Pengamatan Morfologi Sel
Cronobacter sp. dalam sampel susu yang telah direkonstitusi dengan air bersuhu kamar (27 °C) dan 50 oC diamati morfologi selnya dengan menggunakan mikroskop cahaya dan mikroskop polarisasi serta bentuk koloni yang tumbuh pada media TSAYE.
3.6.4 Pengujian Pengaruh Proses Pengeringan Semprot dalam Medium Susu Skim (40% w/v) terhadap Sintas Cronobacter sp. Terpilih
a. Persiapan Kultur Cronobacter sp. untuk Proses Pengeringan Semprot Persiapan inokulum bertujuan untuk mendapatkan biomassa sel maksimal, umumnya biomassa sel dihasilkan maksimal pada fase akhir lag atau saat awal fase stationer. Sebanyak 1 ose isolat Cronobacter sp. diinokulasikan dalam 100 BHI steril dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-17 jam, selanjutnya dilakukan pemanenan massa sel dengan cara melakukan sentrifugasi 45 ml kultur pada 3000 rpm selama 15 menit, pellet hasil sentrifugasi diresuspensikan ke dalam 2-3 ml BPW steril (kultur stok). Untuk menghitung jumlah mikroba awal, sebanyak 1 ml kultur di encerkan dalam BPW dengan berbagai seri pengenceran kemudian diplating (metode tuang) ke dalam media TSAYE secara duplo dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam.
b. Proses Pengeringan Semprot
Pellet hasil pemanenan yang telah diketahui jumlahnya dengan populasi awal sekitar 1010 – 1011 CFU/g yang diperoleh dari tahap diatas inokulasikan ke dalam 450 ml (40% w/v) susu skim (Ling et al. 2010) yang telah disterilisasi pada suhu 100°C selama 15 menit. Setelah itu susu skim rekonstitusi yang telah diinokulasi divortek selama 10 menit dan selanjutnya dikeringkan dengan pengering semprot. Untuk menghitung jumlah mikroba dalam 450 ml (40% w/v)
susu skim, sebanyak 1 ml sampel di encerkan dalam BPW dengan berbagai seri pengenceran kemudian diplating (metode tuang) ke dalam media TSAYE secara duplo dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam.
Proses pengeringan semprot dilakukan dalam skala laboratorium, suhu udara inlet yang digunakan 160 ºC dan suhu udara outlet ±82 ºC didapatkan dengan mengatur flow rate selama skim milk dimasukkan (Permadi 2010). Sampel susu bubuk kering ditampung dalam botol steril yang tertutup rapat, diaduk dengan spatula steril dan disimpan pada suhu 4 ºC (Ling et al. 2010).
c. Sintas Cronobacter sp. setelah Pengeringan Semprot
Penghitungan viabilitas mikroorganisme dilakukan dengan memplating pada media TSAYE (media TSA yang suplementasi 0.6% yeast extract sebagai recovery media) secara duplo kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam (Arroyo et al. 2009). Perhitungan logaritmik penurunan jumlah bakteri dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan: S = penurunan jumlah koloni
N0 = Jumlah populasi mikroba sebelum proses termal
Nt = Jumlah mikroba setelah proses termal
Jumlah koloni sebelum dan setelah pengeringan hasil perhitungan pada media TSAYE yang diketahui dalam CFU/ml dikonversi dalam CFU/g untuk mengetahui jumlah Cronobacter sp. terpilih dalam susu skim bubuk kering.
d. Analisis Perubahan Sintas Cronobacter sp. dalam Susu Skim Bubuk Hasil Pengeringan Semprot Saat RekonstitusiSuhu 27 °C dan 50 °C Uji pengaruh rekonstitusi terhadap sintas Cronobacter sp. dalam susu bubuk skim hasil pengeringan semprotdilakukan dengan merekonstitusi sebanyak 2,2 gram sampel susu bubuk skim dengan menggunakan 15 ml akuades steril yang bersuhu kamar (27 °C) dan suhu 50 °C sekitar 1 menit. Jumlah Cronobacter sp. langsung dihitung dengan memplating pada medium TSAYE dan bentuk koloni yang tumbuh diamati. Dari sampel hasil rekonstitusi juga diamati
N0 Nt ___ ___ Log S =
morfologi sel Cronobacter sp. setelah mengalami proses pengeringan semprot
dengan mikroskop cahaya dan mikroskop polarisasi
3.6.5 Pengaruh Penyimpanan pada RH Berbeda terhadap Sintas
Cronobacter sp. Produk susu bubuk hasil pengeringan semprot disimpan pada desikator yang
telah diatur kondisi RH nya pada RH 50%, 70% dan 90% dalam desikator yang telah diatur kelembapannya menggunakan K2CO3 (RH ±50%), Na(NO3)2 (RH ±
70%) dan BaCl2 (RH±90%). Penyimpanan dilakukan selama 3 bulan dan
pengujian sampel dilakukan setiap 1 minggu.
Analisis yang dilakukan pada susu bubuk skim selama penyimpanan meliputi viabilitas, perubahan aw dan kadar air susu bubuk, sedangkan analisis
setelah merekonstitusi susu bubuk dengan air steril suhu kamar (27°C) dan suhu 50°C meliputi : jumlah Cronobacter sp., penurunan logaritma populasi sel, morfologi sel serta bentuk koloni pada media TSAYE.
3.6.6 Pembuatan Kurva Perubahan Cronobacter sp. selama Penyimpanan dan Saat Rekonstitusi
Jumlah Cronobacter sp. selama penyimpanan dan saat rekonstitusi di dikonversi menjadi nilai log dan diplotkan pada kurva semilog dengan sumbu y menunjukkan koloni yang masih hidup setelah penyimpanan atau saat rekonstitusi (log CFU) dan sumbu x menunjukkan interval waktu (dalam minggu) berdasarkan RH penyimpanan yang diujikan. Kinetika inaktivasi/pertumbuhan mikroba selama penyimpanan pada RH konstan mengikuti reaksi ordo 1, dengan persamaan sebagai berikut :
Keterangan:
N = jumlah bakteri yang hidup
- k = konstanta laju reaksi (konstanta laju perubahan jumlah bakteri)
Untuk mengetahui laju pertumbuhan/kematian Cronobacter sp. selama penyimpanan pada berbagai RH (RH 50%, 70%, dan 90%), data jumlah bakteri dan lama penyimpanan dibuat kurva plot antara log jumlah mikroba setiap minggu
dengan jumlah mikroba awal (log Nt/No) pada sumbu y dan dan sumbu x menunjukkan interval waktu (dalam minggu). Selanjutnya dilakukan perhitungan nilai K dari slope kurva (y= -kt/2,303), K merupakan waktu dalam minggu yang dibutuhkan untuk meningkatkan/menurunkan jumlah Cronobacter sp. sebesar 1 siklus log. Slope kurva didapatkan dengan menggunakan persamaan dibawah ini :
Nilai slope 2,303/k , dinyatakan sebagai K (waktu penurunan desimal), sehingga :
Keterangan:
Nt = jumlah bakteri setelah penyimpanan t minggu N0 = jumlah awal bakteri
t = slope/kemiringan yang menunjukkan konstanta laju reaksi (konstanta laju perubahan jumlah bakteri)
(Hariyadi 2010)
Metode Analisis
a. Pengamatan Morfologis dengan Pewarnaan Gram (Fardiaz 1987)
Sebanyak 1 lup penuh air steril diletakkan pada kaca objek, kemudian dengan jarum ose steril dipindahkan sedikit isolat/sampel ke atasnya selanjutnya dicampurkan dan disebarkan hingga merata dan dibiarkan mengering. Kaca objek dilewatkan di atas api bunsen sampai kaca objek terasa agak panas dan sesekali dikeringkan di udara sehingga terbentuk lapisan kultur yang tipis dan merata. Pewarnaan gram dimulai dengan meneteskan pewarna primer kristal violet secara merata di atas kultur pada kaca objek dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya kaca objek dimiringkan untuk membuang kelebihan kristal violet lalu dibilas dengan air dari botol semprot, sisa air diserap dengan menggunakan kertas serap.
Kemudian kultur ditetesi dengan Iugol dan dibiarkan selama 2 menit, dimiringkan dan selanjutnya dibilas dengan air, sisa warna yang masih ada dihilangkan dengan pemucat warna ethanol 95%, tetes demi tetes selama 10-20 detik sampai zat warna kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca objek. Cuci kembali kaca objek dengan air mengalir lalu ditiriskan an selanjutnya ditetesi dengan larutan safranin selama 10-20 detik. Kaca objek kemudian dimiringkan dan kembali dibilas dengan air, tiriskan dan sisa air yang masih ada diserap dengan kertas serap. Selanjutnya preparat siap untuk diamati dibawah mikroskop.
Pengamatan dengan mikroskop (binokuler dan polarisasi) dilakukan dengan menggunakan lensa objektif minyak emersi (1000 x) dimulai dari pembesaran terendah dan berangsur-angsur diganti dengan pembesaran yang tinggi. Pengamatan dilakukan terhadap ukuran, bentuk dan cara pengelompokan (tunggal, berpasangan, rantai, bergerombol, dan sebagainya). Reaksi gram positif ditandai dengan warna sel ungu atau biru, sedangkan gram negatif berwarna merah muda. Berdasarkan keterangan sebelumnya, diketahui bahwa E. sakazakii merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang.
b. Konfirmasi Isolat Cronobacter spp.
Konfirmasi isolat Cronobacter spp. dilakukan dengan menggoreskan 1 ose kultur dari agar miring TSA atau 1 ose kultur yang telah disegarkan dalam media BHI ke media DFI, kemudian menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Koloni yang positif Cronobacter spp. pada media DFI berwarna biru kehijauan, satu koloni terpisah yang tumbuh pada media DFI diambil 1 ose kemudian digores pada media TSA miring, koloni positif pada media TSA berwarna kuning.
c. Penghitungan Populasi dari Cronobacter spp.
Untuk menghitung populasi Cronobacter spp., sampel dibuat seri pengenceran dalam media BPW (Buffered Peptone Water) . Sebanyak 1 ml sampel hasil pengenceran diplating dengan metode tuang pada media TSAYE dan koloni dihitung setelah 48 jam inkubasi pada suhu 37 oC. Total populasi Cronobacter spp. dihitung berdasarkan rumus dari BAM (Bacteriological Analytical Manual) berikut ini :
N =
dimana ;
N = jumlah koloni per ml/gram C = jumlah koloni dari tiap –tiap petri
n1= jumlah petri dari pengenceran pertama yang dihitung
n2= jumlah petri dari pengenceran kedua
d = pengenceran pertama yang dihitung
d. Kadar Air
Perubahan kadar air dari susu bubuk kering selama penyimpanan diukur menggunakan metode oven. Cawan yang akan digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit, selanjutnya sampel didinginkan dalam desikator dan ditimbang berat awal cawan kosong. Sampel ditimbang dengan cepat sebanyak 3 gram kemudian cawan beserta sampel dimasukkan dalam oven suhu 105 °C selama 6 jam. Cawan didinginkan dalam desikator selama 15 menit dan kemudian ditimbang. Cawan dan sampel dimasukkan kembali ke dalam oven sampai diperoleh berat konstan atau sampai perbedaan berat 0,2 mg. Kadar air dihitung dengan rumus :
Kadar Air (% b.k) = x 100%
(AOAC 1994)
e. Aktivitas Air (aw)
Pengukuran aw dilakukan menggunakan aw meter yang telah dikalibrasi.
Kalibrasi aw meter dengan menggunakan NaCl jenuh yang memiliki aw sebesar
0,75 dan BaCl2 pada aw 0,90. Setelah alat dikalibrasi, sampel susu bubuk kering
dimasukkan ke dalam wadah/chamber pada aw meter kemudian ditutup dan
ditunggu beberapa menit sampai muncul nilai aw sampel yang dianalisis (Nielsen
3.7 Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah
1. Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor (Anova Single Factor) dengan 2 kali ulangan dan tiap ulangan dilakukan secara duplo, untuk pengujian tahapan skrining cepat isolat Cronobacter spp., penurunan logaritma saat rekonstitusi Cronobacter spp. sebelum dan sesudah pengeringan semprot, dan selama penyimpanan diberbagai RH. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan diuji lanjut berganda Duncan (Duncan Multiple Range Test/DMRT) . Model rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut :
Keterangan:
Yij = Nilai pengamatan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = Nilai rataan umum populasi
τi = Pengaruh perlakuan ke-i
εij = Galat pengamatan atau percobaan pada perlakuan ke-i dengan
ulangan ke-j.
2. Rancangan Faktorial Acak Lengkap (RFAL) dengan 2 kali ulangan dan tiap ulangan dilakukan secara duplo, untuk pengujian tahapan penyimpanan pada berbagai kondisi RH. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan diuji lanjut berganda Duncan (Duncan Multiple Range Test/DMRT). Model rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut :
Keterangan:
Yijk = Nilai pengamatan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Yijk = µ + Ai + Bj + ABij+ +εijk
µ = Nilai rataan umum populasi Ai = Pengaruh faktor A level ke-i
Bi = Pengaruh faktor B level ke-j
ABij = Pengaruh interaksi faktor A dan B
εijk = Galat pengamatan atau percobaan pada perlakuan ke-i dengan
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1Rekonfirmasi Isolat Cronobacter spp.
Rekonfirmasi isolat Cronobacter spp. dilakukan berdasarkan pengamatan morfologi dan karakteristik biokimia. Cronobacter spp. merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang, setelah inkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam pada media BHI (Brain Heart Infusion) mampu membentuk endapan atau sedimen di bagian dasar tabung. Pada media kromogenik DFI (Druggan Forsythe Iversen) isolat Cronobacter spp. membentuk koloni berwarna hijau-biru yang berfluorosen, sedangkan pada media TSA (Tryptone Soy Agar) mampu membentuk koloni berwarna kuning berdiameter 1,5-3 mm. Hasil rekonfirmasi isolat Cronobacter spp. dapat dilihat pada Tabel 4. sedangkan gambar hasil konfirmasi dapat dilihat pada Lampiran 2.
Tabel 4. Hasil rekonfirmasi isolat Cronobacter spp.
No Karakteristik Hasil 1. 2. 3. 4. 5. Morfologi Pewarnaan Gram
Kemampuan tumbuh pada medium BHI (Brain Heart Infusion) pada suhu 37 °C selama 24 jam
Kemampuan tumbuh pada media DFI (Druggan Forsythe Iversen) Kemampuan tumbuh pada media TSA (Tryptone Soy Agar)
- Berbentuk batang - Gram negatif
- Positif (keruh dan membentuk endapan/sedimen)
- Membentuk koloni berwarna hijau-biru yang berfluorosen - Membentuk koloni berwarna
kuning